第二章沉淀法ppt課件

1、一一 基本原理基本原理 沉淀法也稱溶解度法，其純化生物大分子的原理是根據(jù)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異如蛋白質(zhì)分子表面疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)比例的差異來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)如pH值、極性、離子強(qiáng)度、金屬離子等），使抽提液中有效成份的溶解度發(fā)生變化，從而達(dá)到從抽提液中分離有效成份的目的。 蛋白質(zhì)和核酸在組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)等方面有明顯差異，所以制備這兩種大分子時(shí)，所用的試劑和操作方法也不完全相同。二二. .蛋白質(zhì)的沉淀分離蛋白質(zhì)的沉淀分離1.1.鹽析的原理鹽析的原理 定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；而當(dāng)隨鹽濃度的升高而增加，這

2、種現(xiàn)象稱為鹽溶；而當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，不種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達(dá)到彼此分離的目同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達(dá)到彼此分離的目的。的。 原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。不同蛋白質(zhì)因所帶電荷和水化程度不同，而在不同的鹽濃度下分別沉淀出來。 如血清中加

3、入50%飽和度的(NH4)2SO4可使球蛋白析出，加入100%飽和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，達(dá)到分級(jí)分離的目的通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示 (不是濃不是濃度百分比度百分比)，例如大部分蛋白質(zhì)可在，例如大部分蛋白質(zhì)可在80%硫酸銨硫酸銨飽和度下沉淀。因?yàn)榱蛩徜@加入的體積很大，會(huì)飽和度下沉淀。因?yàn)榱蛩徜@加入的體積很大，會(huì)改變最后的總體積，很難由濃度百分比來計(jì)算，改變最后的總體積，很難由濃度百分比來計(jì)算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。a a 加入飽和溶液法加入飽和溶液法 要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需

4、調(diào)整的硫酸銨要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高濃度不高 V= V0(S2-S1)/V= V0(S2-S1)/（1-S21-S2） V:V:所需加進(jìn)的飽和硫酸銨溶液的體積；所需加進(jìn)的飽和硫酸銨溶液的體積；V0:V0:原溶液體積；原溶液體積；S2S2：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度；：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度；S1:S1:原溶液的硫酸銨飽原溶液的硫酸銨飽和度。和度。 飽和硫酸銨的配制方法：在一定量的水中加入過飽和硫酸銨的配制方法：在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至量的硫酸銨，加熱至50506060，趁熱濾去沉淀，再在，趁熱濾去沉淀，再在00或室溫平衡或室溫平衡1 12 2天，有固體析出時(shí)

5、達(dá)天，有固體析出時(shí)達(dá)100100飽和度。飽和度。b b 加入固體鹽法加入固體鹽法 要求：飽和度高，不增大溶液體積要求：飽和度高，不增大溶液體積 g=533(S2-S1)/g=533(S2-S1)/（100-0.3S2100-0.3S2） S2S2，S1:S1:分別代表所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原分別代表所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原溶液的硫酸銨飽和度；溶液的硫酸銨飽和度；g g：將：將1L S11L S1飽和度的溶液提飽和度的溶液提高到高到S2S2飽和度時(shí)所需加進(jìn)的硫酸銨克數(shù)；飽和度時(shí)所需加進(jìn)的硫酸銨克數(shù)； 實(shí)際使用時(shí)，實(shí)際使用時(shí)，g g可直接查表得到。（留意：可直接查表得到。（留意：00，2525

6、兩張表，室溫用兩張表，室溫用2525） （3蛋白質(zhì)濃度 蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)一起沉淀出來共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在0.2-2%。 （4離子強(qiáng)度和離子類型的影響 a.離子強(qiáng)度增加，溶解度下降，鹽析易發(fā)生 b.不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需離子強(qiáng)度不同，可采用分步鹽析，通過逐步增加離子強(qiáng)度，使不同蛋白分步沉淀出來 c.離子強(qiáng)度相同時(shí)，高價(jià)離子，半徑小的離子鹽析力強(qiáng) （5pH的影響 有效成分的溶解度與pH有密切關(guān)系。如甘油醛脫氫酶PI=8.5在pH6.0時(shí)能溶于3.2M/L硫酸銨溶液，當(dāng)調(diào)pH到7時(shí)，立刻產(chǎn)生沉淀。 大多數(shù)蛋白質(zhì)在等點(diǎn)電時(shí)，在鹽溶

7、液中的溶解度最低。所以鹽析時(shí)溶液pH值調(diào)到等電點(diǎn)效果最好。 一般來說，第一次鹽析除去雜質(zhì)），pH應(yīng)調(diào)離有效成分的pI靠近雜質(zhì)的pI；而第二次鹽析時(shí)沉淀有效成分時(shí)，pH應(yīng)調(diào)到有效成分的pI。 （6溫度的影響 在低離子強(qiáng)度或純水中，溫度升高，溶解度增加；在高鹽溶液中，溫度升高，溶解度降低。 一般在室溫下進(jìn)行鹽析;溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫4進(jìn)展;也有個(gè)別酶在低溫時(shí)失活，高溫有活性,如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25比0時(shí)溶解度低，更容易鹽析。 實(shí)際使用： 制備初期：pH ，溫度一定，改變鹽濃度離子強(qiáng)度）（Ks分段鹽析）； 純化，結(jié)晶：離子強(qiáng)度一定，改變pH，溫度分段鹽析）透析：透析： 透析是把待純化的

8、蛋白質(zhì)溶液裝透析是把待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液在半透膜的透析袋里，放入透析液蒸餾水或緩沖液中進(jìn)行的，透析蒸餾水或緩沖液中進(jìn)行的，透析液可以更換，直至透析袋內(nèi)無機(jī)鹽等液可以更換，直至透析袋內(nèi)無機(jī)鹽等小分子物質(zhì)降到最小值為止。小分子物質(zhì)降到最小值為止。 原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖等分開。子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖等分開。5 5 脫鹽脫鹽 (1) 透析法 (2) 凝膠過濾法留意：留意：（1) 1) 低溫操作低溫操作（2 2樣品濃度過大，易變性，共沉淀作用大，分離效果差；

9、過小，易產(chǎn)生變性，樣品濃度過大，易變性，共沉淀作用大，分離效果差；過小，易產(chǎn)生變性，回收率低。回收率低。 （3 3樣品穩(wěn)定結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)，選擇溶解度最低處的樣品穩(wěn)定結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)，選擇溶解度最低處的pHpH，即與等電點(diǎn)共沉淀結(jié)合使，即與等電點(diǎn)共沉淀結(jié)合使用。用。（4) 4) 注意離子強(qiáng)度，離子種類的影響。注意離子強(qiáng)度，離子種類的影響。3 3、優(yōu)點(diǎn)：、優(yōu)點(diǎn)： 比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去。比鹽析法好，溶劑也容易除去。4 4、缺陷：、缺陷： 有機(jī)溶劑易使蛋白質(zhì)和酶變性，必須預(yù)冷，操作有機(jī)溶劑易使蛋白質(zhì)和酶變性，必須預(yù)冷，

10、操作要在冰鹽浴中進(jìn)行。要在冰鹽浴中進(jìn)行。 中性鹽可減少有機(jī)溶劑引起的蛋白質(zhì)變性，提高中性鹽可減少有機(jī)溶劑引起的蛋白質(zhì)變性，提高分離效果，一般添加分離效果，一般添加0.05mol/L0.05mol/L的中性鹽。的中性鹽。 由于中性鹽由于中性鹽會(huì)增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度，故中性鹽不宜添會(huì)增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度，故中性鹽不宜添加太多。加太多。 有機(jī)溶劑沉淀法一般與等電點(diǎn)沉淀法聯(lián)合使用。有機(jī)溶劑沉淀法一般與等電點(diǎn)沉淀法聯(lián)合使用。即操作時(shí)溶液的即操作時(shí)溶液的pHpH值應(yīng)控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附值應(yīng)控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。近。 （三選擇性變性沉淀法：（三選擇性變性沉淀法： 選擇一

11、定的條件使溶液中存在的某些雜選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法稱為蛋白變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法稱為選擇性變性沉淀法。選擇性變性沉淀法。 例如：利用加熱，改變例如：利用加熱，改變pHpH或加進(jìn)某些重金或加進(jìn)某些重金屬離子等使雜蛋白變性沉淀而除去。應(yīng)用此法，屬離子等使雜蛋白變性沉淀而除去。應(yīng)用此法，應(yīng)對(duì)欲提純蛋白質(zhì)和雜蛋白的理化性質(zhì)有較全應(yīng)對(duì)欲提純蛋白質(zhì)和雜蛋白的理化性質(zhì)有較全面的了解。面的了解。（四等電沉淀法：（四等電沉淀法： 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)一這特性，對(duì)蛋白同的蛋白質(zhì)具有

12、不同等電點(diǎn)一這特性，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。質(zhì)進(jìn)行分離純化的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。 在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，消除了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，消除了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)合使用。合使用。 單獨(dú)使用等電點(diǎn)法主要是用于去除等電點(diǎn)單獨(dú)使用等電點(diǎn)法主要是用于去除等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。在加酸或加堿調(diào)節(jié)相距較大的雜蛋白。在加酸或加堿調(diào)節(jié)pHpH的過的過程中，

13、要一邊攪拌一邊慢慢加入，以防止局部程中，要一邊攪拌一邊慢慢加入，以防止局部過酸或過堿過酸或過堿 。 （五非離子多聚物沉淀法：（五非離子多聚物沉淀法： 聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG），葡聚糖，右旋糖苷硫），葡聚糖，右旋糖苷硫酸鈉等非離子多聚物可以沉淀蛋白質(zhì)和細(xì)菌。酸鈉等非離子多聚物可以沉淀蛋白質(zhì)和細(xì)菌。 沉淀機(jī)理：空間位置排斥效應(yīng)。試劑溶解度大，沉淀機(jī)理：空間位置排斥效應(yīng)。試劑溶解度大，在水中占據(jù)大部分空間，將需沉淀物相互靠近，在水中占據(jù)大部分空間，將需沉淀物相互靠近，增加碰撞機(jī)率。增加碰撞機(jī)率。 優(yōu)點(diǎn)：（優(yōu)點(diǎn)：（1 1操作條件溫和，不易引起變性；操作條件溫和，不易引起變性； （2 2具有極高的

14、沉淀效率；具有極高的沉淀效率； （3 3沉淀后多聚物容易除去。沉淀后多聚物容易除去。運(yùn)用：沉淀分離細(xì)菌，病毒蛋白；質(zhì)粒純化運(yùn)用：沉淀分離細(xì)菌，病毒蛋白；質(zhì)粒純化 核酸類化合物都溶于水而不溶于有機(jī)溶劑。所以核酸可用水溶液提取，而用有機(jī)溶劑沉淀法沉淀分離。 從生物材料中分離出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白質(zhì)DNP或RNA-蛋白質(zhì)RNP復(fù)合物形式存在 。因此，要制備初步純化的核酸時(shí)，首先要分離出DNP或RNP，再將復(fù)合物解聚，除去蛋白質(zhì)，然后通過沉淀法得到核酸。 在0.14mol/L的氯化鈉溶液中， RNP 的溶解度相當(dāng)大，而DNP的溶解度僅為在水中溶解度的1%；當(dāng)氯化鈉的濃度達(dá)到1mol/

15、L的時(shí)候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以常選用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取RNP，而選用1mol/L的氯化鈉溶液提取DNP。DNP DNP三、核酸的提取與沉淀分離三、核酸的提取與沉淀分離1.DNP/RNP1.DNP/RNP復(fù)合物的解聚：復(fù)合物的解聚： 主要采用加入去污劑、有機(jī)溶劑和蛋白水主要采用加入去污劑、有機(jī)溶劑和蛋白水解酶等試劑來實(shí)現(xiàn)。解酶等試劑來實(shí)現(xiàn)。 去污劑：在破碎細(xì)胞的溶液中，加入適量的陰去污劑：在破碎細(xì)胞的溶液中，加入適量的陰離子去污劑離子去污劑SDSSDS、Triton X-100Triton X-100、Tween 40 Tween 40

16、 和和 NP-40 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，將等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，將DNP/RNPDNP/RNP復(fù)合物解聚，進(jìn)而釋放出核酸。去污劑復(fù)合物解聚，進(jìn)而釋放出核酸。去污劑- -蛋白質(zhì)等復(fù)合物可用適量乙酸鉀沉淀去除。蛋白質(zhì)等復(fù)合物可用適量乙酸鉀沉淀去除。 有機(jī)溶劑：苯酚、氯仿等是蛋白質(zhì)的變性劑。有機(jī)溶劑：苯酚、氯仿等是蛋白質(zhì)的變性劑。根據(jù)抽提液中蛋白質(zhì)的含量和溶劑的純度，用根據(jù)抽提液中蛋白質(zhì)的含量和溶劑的純度，用變性劑反復(fù)處理抽提液，直到離心后，上層水變性劑反復(fù)處理抽提液，直到離心后，上層水相含核酸和下層有機(jī)相之間的界面處無變相含核酸和下層有機(jī)相之間的界面處無變性蛋白為止。性蛋

17、白為止。蛋白水解酶：用此法除去復(fù)合物中的蛋白質(zhì)的蛋白水解酶：用此法除去復(fù)合物中的蛋白質(zhì)的操作比較溫和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白操作比較溫和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶酶K K和蛋白酶和蛋白酶E E，可以避免剪切和破壞核酸。，可以避免剪切和破壞核酸。 2.2.多糖的消除：多糖的消除： 采用動(dòng)物或植物作材料提取核酸時(shí)，動(dòng)物在宰采用動(dòng)物或植物作材料提取核酸時(shí)，動(dòng)物在宰殺前饑餓殺前饑餓12h12h，植物在取材前暗室培養(yǎng)數(shù)天，其體內(nèi)，植物在取材前暗室培養(yǎng)數(shù)天，其體內(nèi)的糖原和淀粉類物質(zhì)均會(huì)減少。的糖原和淀粉類物質(zhì)均會(huì)減少。 混雜于核酸提取液中的多糖類物質(zhì)，一般可用混雜于核酸提取液中的多糖類物質(zhì)，一般可

18、用選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨CTABCTAB可達(dá)到分離目的。可達(dá)到分離目的。 或用等體積的或用等體積的2.5mol/L2.5mol/L磷酸緩沖液和等體積的磷酸緩沖液和等體積的乙二醇甲醚處理，離心后，多糖位于中部，核酸存乙二醇甲醚處理，離心后，多糖位于中部，核酸存在上層乙二醇甲醚中。在上層乙二醇甲醚中。3.RNA3.RNA的提?。旱奶崛。?由于由于RNARNA是基因表達(dá)過程中非常重要的生物分子，是基因表達(dá)過程中非常重要的生物分子，如如mRNAmRNA攜帶了攜帶了DNADNA為蛋白質(zhì)編碼的信息。為蛋白質(zhì)編碼的信息。RNARNA的分離是的分離

19、是研究基因功能的重要基礎(chǔ)之一，在分子生物學(xué)中占有研究基因功能的重要基礎(chǔ)之一，在分子生物學(xué)中占有重要的地位。重要的地位。 tRNA(tRNA(約占細(xì)胞內(nèi)約占細(xì)胞內(nèi)RNARNA的的15%)15%)的相對(duì)分子質(zhì)量較小，的相對(duì)分子質(zhì)量較小，在細(xì)胞破碎以后溶解在水溶液中，濾液用酸處理，調(diào)在細(xì)胞破碎以后溶解在水溶液中，濾液用酸處理，調(diào)節(jié)到節(jié)到pH5pH5得到的沉淀的中可分離得到得到的沉淀的中可分離得到tRNAtRNA。 mRNAmRNA占細(xì)胞占細(xì)胞RNARNA的的5%5%左右，很不穩(wěn)定，提取條件左右，很不穩(wěn)定，提取條件要嚴(yán)格控制。要嚴(yán)格控制。 rRNArRNA約占細(xì)胞內(nèi)約占細(xì)胞內(nèi)RNARNA的的80%80

20、%，一般提取的，一般提取的RNARNA主要主要是是rRNArRNA。 RNARNA的提取方法主要有稀鹽溶液提取和苯酚溶液的提取方法主要有稀鹽溶液提取和苯酚溶液提取。提取。（1 1稀鹽溶液提?。合←}溶液提取： 將細(xì)胞破碎制成細(xì)胞勻漿，然后用將細(xì)胞破碎制成細(xì)胞勻漿，然后用0.14mol/L0.14mol/L的氯化鈉溶液反復(fù)抽提，得到核糖核蛋白提取液，的氯化鈉溶液反復(fù)抽提，得到核糖核蛋白提取液，再進(jìn)一步與脫氧核糖核蛋白、蛋白質(zhì)、多糖等分再進(jìn)一步與脫氧核糖核蛋白、蛋白質(zhì)、多糖等分離，可得離，可得RNARNA。（2 2苯酚溶液提取：苯酚溶液提?。?在細(xì)胞破碎制成勻漿后，用在細(xì)胞破碎制成勻漿后，用SDSS

21、DS變性蛋白并抑變性蛋白并抑制制RNaseRNase活性，經(jīng)多次酚活性，經(jīng)多次酚/ /氯仿在一定條件下振蕩氯仿在一定條件下振蕩一定時(shí)間，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用一定時(shí)間，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAcNaAc和乙醇沉淀和乙醇沉淀RNARNA，將，將RNARNA與蛋白質(zhì)分開。與蛋白質(zhì)分開。4.DNA4.DNA的提?。旱奶崛。?從細(xì)胞中提取從細(xì)胞中提取DNADNA，一般在細(xì)胞破碎后，一般在細(xì)胞破碎后用濃鹽法提取。即用用濃鹽法提取。即用1mol/L1mol/L的氯化鈉溶液從的氯化鈉溶液從細(xì)胞勻漿中提取脫氧核糖核蛋白，再與含有細(xì)胞勻漿中提取脫氧核糖核蛋白，再與含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)。少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)?；蛘呦纫曰蛘呦纫?.14mol/L0.14mol/L氯化鈉溶液氯化鈉溶液( (也可用也可用0.1mol/L NaCl0.1mol/L NaCl加上加上0.05mol/L0.05mol/L檸檬酸代替檸檬酸代替) )反復(fù)洗滌除去核糖核蛋白后，再用反復(fù)洗滌除去核糖核蛋白后，再用1mol/L1mol/L氯氯化鈉溶液提取脫氧核糖核蛋白，經(jīng)氯仿戊醇化鈉溶液提取脫氧核糖核蛋白，經(jīng)氯仿戊醇( (辛醇辛醇) )或水飽和酚處理或水飽和酚處理 ，除去蛋白質(zhì)，而，除去蛋白質(zhì)，而得到得到DNADNA。5. 5. 核酸的沉淀分離：