第十章核酸分子雜交技術(shù)1ppt課件

1、核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 核酸分子雜交的根本原理核酸分子雜交的根本原理 具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補(bǔ)配對原那么退火構(gòu)成雙鏈的過程。按堿基互補(bǔ)配對原那么退火構(gòu)成雙鏈的過程。 雜交的雙方是待測核酸和知核酸序列，知雜交的雙方是待測核酸和知核酸序列，知 核酸序列稱探針。核酸序列稱探針。 雜交有固一液相雜交和液相雜交。雜交有固一液相雜交和液相雜交。 DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子 一、一、DNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性 一DNA變性 1、定義：某些理化要素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性2、變

2、性的方法：、變性的方法：1熱變性：溫度升高到熱變性：溫度升高到90100時(shí)，雙鏈核酸時(shí)，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 2酸堿變性：酸堿變性：pH值低于值低于3或高于或高于10時(shí)，雙鏈核時(shí)，雙鏈核 酸分子鏈酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。間的氫鍵斷裂。 3化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。3、變性后的理化性量變化：、變性后的理化性量變化： 粘度降低粘度降低 密度添加密度添加 紫外吸收值添加紫外吸收值添加4、DNA變性曲線變性曲線 AT區(qū)先解鏈區(qū)先解鏈 GC區(qū)后解鏈區(qū)后解鏈 階

3、梯式曲線階梯式曲線5、GC含量與含量與Tm值之間的關(guān)系值之間的關(guān)系 G+C%=Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3二復(fù)性二復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原那么重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱按堿基互補(bǔ)原那么重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)構(gòu)成雙鏈：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)構(gòu)成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA。2、復(fù)性過程、復(fù)性過程1單鏈分子間碰撞構(gòu)成部分雙鏈單鏈分子間

4、碰撞構(gòu)成部分雙鏈2部分雙鏈周圍的堿基如不配對時(shí)，雙鏈重新解離部分雙鏈周圍的堿基如不配對時(shí)，雙鏈重新解離3部分雙鏈周圍的堿基如配對，那么構(gòu)成中心序列部分雙鏈周圍的堿基如配對，那么構(gòu)成中心序列4構(gòu)成完好的雙鏈分子構(gòu)成完好的雙鏈分子 二、影響雜交的要素二、影響雜交的要素 1、核酸分子的濃度和長度：、核酸分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度添加，雜交效率添加單鏈探針，濃度添加，雜交效率添加 雙鏈探針，濃度控制在雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過高影響雜濃度過高影響雜 交效率交效率2、溫度：、溫度： 1DN

5、A/DNA雜交，適宜溫度較雜交，適宜溫度較Tm值低值低2025 2RNA/DNA或或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低雜交，加甲酰胺降低 Tm值值 3用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低值低5 3、離子強(qiáng)度：、離子強(qiáng)度： 1低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度添加，雜低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度添加，雜交率添加交率添加 2高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)展序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必需維持雜交展序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必需維持雜交反響液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度反響液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃

6、度 4、甲酰胺：、甲酰胺： 1甲酰胺能降低核酸雜交的甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待液的溫度，低溫時(shí)探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測核酸與探針同源性不高時(shí)，加測核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 雜交雜交 2如待測核酸序列與探針同源性高時(shí)，那么用水如待測核酸序列與探針同源性高時(shí)，那么用水溶液在溶液在68雜交雜交 5、核酸分子的復(fù)雜性：、核酸分子的復(fù)雜性： 1核酸的復(fù)雜性是指存在于反響體系中不同順序核酸的復(fù)雜性是指存在于反響體系中不同順序的總長度的總長度 2Cot與反響體系中核酸復(fù)雜性成正比與反響體

7、系中核酸復(fù)雜性成正比 3兩個(gè)兩個(gè)DNA樣品濃度絕對一致時(shí)，變性后的相對樣品濃度絕對一致時(shí)，變性后的相對雜交率取決于雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性的相對復(fù)雜性 6、非特異性雜交反響：、非特異性雜交反響： 1雜交前封鎖非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對探針雜交前封鎖非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對探針的非特異性吸附的非特異性吸附 2常用的封鎖物有兩類：即非特異性常用的封鎖物有兩類：即非特異性DNA和高分和高分子化合物。如鮭精子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉溶液或脫脂奶粉 第二節(jié) 核酸分子雜交的方法按待測核酸能否固定在固相支持物上分： 固-液相雜交 膜上印跡雜交 原

8、位雜交 液相雜交 RNA酶維護(hù)分析法 核酸酶S1維護(hù)分析法 一、一、Southern印跡雜交印跡雜交一待測核酸樣品的制備一待測核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細(xì)胞、裂解或破碎細(xì)胞 2、抽取純化基因組、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化、限制酶消化DNA為大小不同的為大小不同的DNA片段片段二待測二待測DNA樣品的電泳分別樣品的電泳分別 1、瓊脂糖濃度：分別大片段用低濃度膠、瓊脂糖濃度：分別大片段用低濃度膠 分別小片段用高濃度膠分別小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動(dòng)慢泳動(dòng)慢,小分子小分子DNA泳動(dòng)快，泳動(dòng)快， 大小大小 一

9、樣的分子處于同一條帶一樣的分子處于同一條帶 3、分子量規(guī)范：經(jīng)、分子量規(guī)范：經(jīng)Hind消化的消化的DNA，雜交，雜交 所用分子量規(guī)范可用核素標(biāo)志所用分子量規(guī)范可用核素標(biāo)志 三凝膠中核酸的變性堿變化三凝膠中核酸的變性堿變化 凝膠置于凝膠置于NaOH溶液中使溶液中使DNA變性斷裂為較短的變性斷裂為較短的 單鏈單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 四四Southern印跡印跡 指將電泳分別的指將電泳分別的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程相支持物上的過程1、固相支持物的選擇、固相支持物的選擇1理想的固相支持物應(yīng)具備的特性理想的固相支持物應(yīng)具

10、備的特性 具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的才干具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的才干 不影響與探針的雜交反響不影響與探針的雜交反響 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定結(jié)實(shí)與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定結(jié)實(shí) 具有良好的機(jī)械性能具有良好的機(jī)械性能 非特異吸附少非特異吸附少2常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附才干強(qiáng)，雜交信號本硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附才干強(qiáng)，雜交信號本 底低。缺陷是底低。缺陷是DNA分子結(jié)合不結(jié)實(shí)分子結(jié)合不結(jié)實(shí) 尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的才干比硝酸的才干比硝酸 纖維素膜強(qiáng)；缺陷：雜交信號本底高纖維素膜強(qiáng)；缺陷：雜交信號本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜

11、共價(jià)結(jié)合；對不同與膜共價(jià)結(jié)合；對不同 大小的大小的DNA片段有同等結(jié)合才干；缺陷：結(jié)合能片段有同等結(jié)合才干；缺陷：結(jié)合能 力較上述兩種膜低力較上述兩種膜低2、Southern印跡的常用方法印跡的常用方法 1毛細(xì)管虹吸印跡法毛細(xì)管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推進(jìn)作用，將凝膠中利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推進(jìn)作用，將凝膠中的的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其根本原理是：其根本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液經(jīng)過濾酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液經(jīng)過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，紙

12、橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上片段移出凝膠而滯留在膜上2電轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)法利用電場的電泳作用將凝膠中的利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相轉(zhuǎn)移到固相支持物上。支持物上。3真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細(xì)管虹吸法一樣，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中經(jīng)過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。 五五Southern雜交雜交 1、預(yù)雜交：封鎖膜上能與、預(yù)雜交：封鎖

13、膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)結(jié)合的位點(diǎn) 預(yù)雜交液為不含預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液探針的雜交液 2、雜交：液相中的、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測探針與膜上的待測DNA雜交雜交 雙鏈雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA 六雜交結(jié)果檢測六雜交結(jié)果檢測 1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)志的探針、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)志的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)志的探針、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)志的探針七七Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用雜交在醫(yī)學(xué)

14、中的運(yùn)用 1、酶切圖譜分析、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量、特定基因定性和定量 3、基因突變分析、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析、限制性片段長度多態(tài)性的分析二、二、Northern印跡雜交印跡雜交 1、根本原理和根本過程與、根本原理和根本過程與Southern blot根本一樣根本一樣 2、鑒別、鑒別RNA 3、探針可用、探針可用DNA或或RNA片段片段 4、待測樣品為總、待測樣品為總RNA或或mRNANorthern印跡與印跡與Southern 印跡的不同點(diǎn)印跡的不同點(diǎn) 1、變性：、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保 持持RNA處

15、于變性形狀，處于變性形狀，DNA電泳前和電泳電泳前和電泳 中不變性中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處置轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處置,Southern 印跡時(shí)，印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)展堿變性及中和處置轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)展堿變性及中和處置 3、靶核酸為、靶核酸為RNA三、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交三、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交 1、斑點(diǎn)印跡為圓形、斑點(diǎn)印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀、狹縫印跡為線狀 3、鑒別、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個(gè)樣品、簡單、快速，同一張膜可檢測多個(gè)樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量、特異性不高、不能鑒別核酸分子量四、原位雜交四、原位雜交 1、定義

16、：將標(biāo)志的核酸探針與固定在細(xì)胞或組、定義：將標(biāo)志的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)展雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分織中的核酸進(jìn)展雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交雜交 堅(jiān)持組織細(xì)胞的形狀堅(jiān)持組織細(xì)胞的形狀 對核酸無抽提，修飾與降解作用對核酸無抽提，修飾與降解作用 不改動(dòng)核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位不改動(dòng)核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位 不妨礙核酸與探針的雜交過程不妨礙核酸與探針的雜交過程 對雜交信號無遮蓋作用對雜交信號無遮蓋作用 理化性質(zhì)穩(wěn)定理

17、化性質(zhì)穩(wěn)定 2、雜交過程：、雜交過程：1組織或細(xì)胞的固定組織或細(xì)胞的固定 理想固定液應(yīng)具備：理想固定液應(yīng)具備：2組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處置組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處置 去垢劑如去垢劑如Triton x-100和和SDS和蛋白酶和蛋白酶 K去除核酸外表的蛋白質(zhì)去除核酸外表的蛋白質(zhì) 組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 控制消化時(shí)間，防止細(xì)胞構(gòu)造破壞和核酸從載?？刂葡瘯r(shí)間，防止細(xì)胞構(gòu)造破壞和核酸從載玻 片上零落片上零落3探針的選擇與標(biāo)志探針的選擇與標(biāo)志 以獲得最好雜交效果為根據(jù)選擇探針以獲得最好雜交效果為根據(jù)選擇探針 探針的長度普通為探針的長度普通為50

18、300bp ,有時(shí)達(dá)有時(shí)達(dá)1.5kb 放射性核素標(biāo)志探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定放射性核素標(biāo)志探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時(shí)間長檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時(shí)間長 非核素標(biāo)志探針平安、穩(wěn)定性好、顯色快，易非核素標(biāo)志探針平安、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于察看于察看4雜交雜交 雜交液體積小：雜交液體積?。?020l cDNA和和RNA探針雜交溫度約為探針雜交溫度約為50 雜交時(shí)間雜交時(shí)間:DNA探針雜交為探針雜交為24h.RNA探針雜交過夜探針雜交過夜 雜交前普通將組織切片置雜交前普通將組織切片置95 515分鐘使分鐘使DNA變性變性 沖洗溫度普通沖洗溫度普通 不超越不超越5

19、0 5雜交結(jié)果檢測雜交結(jié)果檢測 所用探針為核素標(biāo)志所用探針為核素標(biāo)志,放射自顯影檢測放射自顯影檢測 所用探針為非核素標(biāo)志所用探針為非核素標(biāo)志,比色或化學(xué)發(fā)光檢測比色或化學(xué)發(fā)光檢測五、液相雜交五、液相雜交 指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液體中配對構(gòu)成雜交分子的過程。的單鏈核酸分子在液體中配對構(gòu)成雜交分子的過程。一一RNA酶維護(hù)分析法酶維護(hù)分析法1、RNA酶維護(hù)分析法原理酶維護(hù)分析法原理 RNaseA和和RNaseT1專注水解雜交體系中的單專注水解雜交體系中的單鏈鏈RNA，不水解探針，不水解探針RNA與待測與待測RNA互補(bǔ)構(gòu)成互

20、補(bǔ)構(gòu)成的雙鏈的雙鏈RNA，使雜交分子得到維護(hù)，稱，使雜交分子得到維護(hù)，稱RNA酶酶維護(hù)分析法。維護(hù)分析法。2、雜交過程、雜交過程 制備待測制備待測RNA RNA探針的制備與標(biāo)志：體外轉(zhuǎn)錄法制備和標(biāo)探針的制備與標(biāo)志：體外轉(zhuǎn)錄法制備和標(biāo) 記記RNA探針探針 雜交：待測雜交：待測RNA與與RNA探針在液相中雜交探針在液相中雜交 RNaseA和和RNaseTI除去單鏈除去單鏈RNA 電泳分別電泳分別RNA 放射自顯性檢測雜交結(jié)果放射自顯性檢測雜交結(jié)果二核酸酶二核酸酶S1維護(hù)分析法維護(hù)分析法 1、原理、原理 核酸酶核酸酶S1在一定條件下專注水解雜交體系中在一定條件下專注水解雜交體系中的單鏈的單鏈DNA和

21、單鏈和單鏈RNA，不水解，不水解DNA探針與待測探針與待測RNA雜交構(gòu)成的雜交體，使雜交分子得到維護(hù)，雜交構(gòu)成的雜交體，使雜交分子得到維護(hù)，稱核酸酶稱核酸酶S1維護(hù)分析法維護(hù)分析法2、雜交過程、雜交過程 制備待測制備待測RNA：總：總RNA或或mRNA均可均可 單鏈單鏈DNA探針的制備與標(biāo)志探針的制備與標(biāo)志 雜交：單鏈雜交：單鏈DNA探針與待測探針與待測RNA在液相中雜交在液相中雜交 核酸酶核酸酶S1除去單鏈除去單鏈DNA和單鏈和單鏈RNA 電泳分別電泳分別DNA/RNA雜交體分子雜交體分子 放射自顯影檢測雜交結(jié)果放射自顯影檢測雜交結(jié)果第三節(jié)第三節(jié) 探針的標(biāo)志探針的標(biāo)志一、探針的種類一、探針的

22、種類 基因組基因組DNA探針探針 cDNA探針探針 RNA探針探針 寡核苷酸探針寡核苷酸探針二、標(biāo)志物二、標(biāo)志物 一理想標(biāo)志物應(yīng)具備的特性：一理想標(biāo)志物應(yīng)具備的特性： 高度靈敏性高度靈敏性 不影響堿基配對的特異性不影響堿基配對的特異性 不影響探針分子的主要理化性質(zhì)不影響探針分子的主要理化性質(zhì) 對酶促反響活性無影響或影響不大對酶促反響活性無影響或影響不大 檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性(二二) 標(biāo)志物種類標(biāo)志物種類 核素標(biāo)志物：核素標(biāo)志物：32p、35s、3H 非核素標(biāo)志物非核素標(biāo)志物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體

23、配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)志物與某種底物反響發(fā)光，化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)志物與某種底物反響發(fā)光， 如生物素?；膲A性磷酸酶如生物素酰化的堿性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光可使發(fā)光底物發(fā)光 三、標(biāo)志方法三、標(biāo)志方法 體內(nèi)標(biāo)志法：將核素標(biāo)志的化合物作為合成體內(nèi)標(biāo)志法：將核素標(biāo)志的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時(shí)使代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時(shí)使 核素?fù)饺氲叫潞怂負(fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，如合成的核酸分子中，?H-胸苷可摻入到胸苷可摻入到DNA中，中， 3H-尿苷可摻入到尿苷可摻入到RNA中中 體外標(biāo)志法：體外標(biāo)志法：

24、 化學(xué)標(biāo)志法：標(biāo)志物分子上的活性基因與化學(xué)標(biāo)志法：標(biāo)志物分子上的活性基因與 探針分子上的某些基因反響，探針分子上的某些基因反響， 標(biāo)志物直接結(jié)合到探針分子上標(biāo)志物直接結(jié)合到探針分子上 酶促標(biāo)志法：標(biāo)志物預(yù)先標(biāo)志核苷酸，然酶促標(biāo)志法：標(biāo)志物預(yù)先標(biāo)志核苷酸，然 后利用酶促法將標(biāo)志的核苷酸后利用酶促法將標(biāo)志的核苷酸 摻入到探針上摻入到探針上 酶促標(biāo)志法酶促標(biāo)志法一切口平移法一切口平移法nick translation)1、利用、利用DNase I在在DNA雙鏈上呵斥單鏈切口雙鏈上呵斥單鏈切口2、利用大腸桿菌、利用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的53核核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐漸末端逐漸切除切除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的的53聚合酶催化下，聚合酶催化下，以互補(bǔ)的以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板依次將單鏈為模板依次將dNTP銜接到銜接到切口的切口的3末端末端-OH上，合成新的上，合成新的DNA鏈，同鏈，同時(shí)將標(biāo)志的核苷酸摻入到新的時(shí)將標(biāo)志的核苷酸摻入到新的DNA鏈中鏈中二隨機(jī)引物法二隨機(jī)引物法 其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在作為合成新鏈的引物