端粒酶活性與兒童急性淋巴細胞白血病相關(guān)性的研究

1、    端粒酶活性與兒童急性淋巴細胞白血病相關(guān)性的研究高舉廖清奎羅春華李欽伯楊崇禮李豐益楊顯軍 【摘要】目的了解端粒酶在兒童急性淋巴細胞白血病中的表達情況。方法采用端粒重復(fù)序列擴增法（TRAP）檢測了14例兒童急性淋巴細胞白血病骨髓單個核細胞端粒酶活性水平，并與10例正常健康兒童外周血和骨髓單個核細胞端粒酶活性相比較。結(jié)果白血病細胞端粒酶活性顯著升高，可高達K562白血病細胞端粒酶活性的75%98%，而正常外周血和骨髓單個核細胞具有適度低水平的酶活性，其相對活性為K562細胞的1.3%5.7%。結(jié)論端粒酶的激活在急性淋巴細胞白血病的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要

2、作用。 【關(guān)鍵詞】端粒，末端轉(zhuǎn)移酶白血病，淋巴細胞，急性 The association between telomerase activity and acute lymphoblastic leukemia in childhoodGao Ju, Liao Qingkui, Luo Chunhua, et al. Department of Pediatrics, Second Hospital, West China University of Medical Sciences. Chengdu 610041 【Abstract】ObjectiveTo determine whether

3、 telomerase is activated in childhood acute lymphoblastic leukemia. MethodsA highly sensitive PCR-based assay-telomeric repeat amplification protocol (TRAP) was employed to measure telomerase activity in extracts of peripheral blood and bone marrow mononuclear cells from 14 leukemic patients and 10

4、normal children, respectively. ResultsSignificantly high level of telomerase activity was expressed in leukemic blast cells, with the telomerase activity in the range of 75%-98% of reference K562 leukemic cells. While normal peripheral blood and bone marrow mononuclear cells from normal childern had

5、 a very low, but detectable, level of telomerase activity, which was 1.3%-5.7% of the K562 cells. ConclusionTelomerase activation may play an important role in leukemogenesis. 【Key words】TelomeraseLeukemia, lymphocytic, acute 端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白體,它能以自身RNA的部分序列作為模板,指導(dǎo)端粒DNA的生物合成1。近年的研究表明，各種體外培養(yǎng)的永生細胞株

6、和90%以上各種人類原發(fā)惡性腫瘤細胞具有端粒酶活性，提示端粒酶的激活可能是惡性腫瘤發(fā)生學(xué)上的一個共同途徑，而端粒酶本身也可能是各種惡性腫瘤細胞共同的標(biāo)記分子24。 為了解端粒酶在兒童急性淋巴細胞白血病(ALL)中的表達情況，采用端粒重復(fù)序列擴增法（TRAP）檢測兒童急性淋巴細胞白血病骨髓單個核細胞端粒酶活性水平，并與正常外周血和骨髓單個核細胞端粒酶活性相比較，初步探討端粒酶活性與兒童急性淋巴細胞白血病的相關(guān)性。 材料和方法 一、材料 1.K562白血病細胞株（本校免疫教研室惠贈）。 2.臨床標(biāo)本的收集：(1)根據(jù)小兒急性白血病診療建議(修訂草案)5，共收集14份兒童初發(fā)急性淋巴細胞白血?。ˋL

7、L)骨髓肝素抗凝標(biāo)本。年齡214歲，其中男9例，女5例。L1 8例，L2 5例，L3 1例。（2）健康兒童外周血肝素抗凝標(biāo)本共10份，年齡210歲。男6例，女4例。（3）因非腫瘤性疾病而行骨髓檢查的患兒骨髓肝素抗凝標(biāo)本共10份，年齡112歲，其中男5例，女5例。 二、方法 1.K562細胞的培養(yǎng)、裂解和端粒酶提取液的制備：K562細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液(加10%小牛血清)，于37、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集K562細胞后離心5分鐘1 000 g(g為重力常數(shù))， 沉淀后用PBS洗滌2次。計數(shù)細胞總數(shù)為3.5×106個，臺盼藍染色示活細胞大于95%。將K562細胞重懸

8、于預(yù)冷的清洗緩沖液中(10 mmol/L HEPES，pH7.5；1.5 mmol/L MgCl2；10 mmol/L KCl；1 mmol/L 二硫蘇糖醇)，離心2分鐘后(4，10 000 g)，將細胞重懸于200 l預(yù)冷的裂解緩沖液中(10 mmol/L Tris HCl，pH 7.5；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA；0.1 mmol/L AEBSF；5 mmol/L巰基乙醇；0.5%CHAPS，10%甘油)。置冰上孵育30分鐘，然后于4離心30分鐘(16 000 g)。迅速取出上清液，于液氮中快速凍存。后轉(zhuǎn)移至-70冰箱保存?zhèn)溆?。采用Folin-酚試劑法測定蛋白

9、水平，總蛋白濃度為3.5 g/l。 2.外周血和骨髓單個核細胞(MNC)的分離和裂解：初發(fā)ALL患兒骨髓幼稚細胞計數(shù)均大于85%。采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離外周血和骨髓單個核細胞后，用PBS洗滌2次并計數(shù)。裂解和端粒酶提取液的制備同上。 3.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：(1)標(biāo)準反應(yīng)條件為：PCR總反應(yīng)體積50 l，包括20 mmol/L Tris HCl，pH8.3；1.5 mmol/L MgCl2；63 mmol/L KCl；1 mmol/L EGTA；0.005% Tween-20；0.01%牛血清白蛋白；1 g T4基因32蛋白；2單位Taq酶，50 mol dNTPs；0.1

10、g TS 引物（5"-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3"）；0.1 g CX 引物（5"-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3"）和2 l K562細胞提取液。于23孵育30分鐘，然后于90首先作用90秒，然后進行35次PCR循環(huán)：9430秒，5030 秒，7245秒，最后于72保溫3分鐘后終止反應(yīng)。(2)TRAP的特異性：在標(biāo)準反應(yīng)條件下以及分別省去引物、底物、Taq酶和細胞提取液，并對細胞提取液完成各種預(yù)處理措施后，進行TRAP反應(yīng)。細胞提取液的預(yù)處理措施包括：RNase A預(yù)處理：10 l 提取液中加入RNase A 1 g

11、，于37孵育1 小時后取2 l于標(biāo)準反應(yīng)體系中。預(yù)加熱處理：將10 l提取液加熱10分鐘（85），然后取2 l于標(biāo)準反應(yīng)體系中。蛋白酶K（proteinase K）預(yù)處理：10 l提取液中加入Proteinase K 3 g，于37孵育30分鐘，然后取2 l于標(biāo)準反應(yīng)體系中。(3) TRAP方法的敏感性：將K562細胞提取液10、100、1 000倍稀釋后，分別取2 l于標(biāo)準反應(yīng)體系中。(4)MNC的擴增采用標(biāo)準反應(yīng)條件，但加入相同蛋白含量的提取液，便于端粒酶活性的相互比較。 4.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：TRAP擴增產(chǎn)物于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓1015 V/cm。DNA分子量標(biāo)

12、準為pBR322/Hae。 5.凝膠的SYBR Green染色：將SYBR Green濃縮液稀釋10 000倍成使用液，染色30分鐘，于紫外投射儀上觀察DNA條帶。 6.凝膠的GDS成像和分析：于UVP GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)，采用GRAB-IT和GEL WORKS intermediate 軟件對凝膠進行成像分析。先求出每一條帶的峰面積（Volume），得出每一泳道（Lane）的峰面積的總和，并扣除陰性對照的背景值，即為每一標(biāo)本的端粒酶活性。 結(jié)果 一、TRAP方法的特異性和敏感性 在分別省去引物、底物、Taq酶和端粒酶液，并對端粒酶液完成各種預(yù)處理措施后行TRAP反應(yīng)，均未出現(xiàn)端

13、粒酶特異性的DNA梯帶。因此，標(biāo)準條件下經(jīng)TRAP反應(yīng)擴增出的相差6個核苷酸的DNA梯帶，真實反映了端粒酶的活性。另外，將K562細胞提取液1 000倍稀釋后（相當(dāng)于35個K562細胞，7 ng蛋白）仍可檢出陽性結(jié)果。 二、正常外周血單個核細胞(MNC)端粒酶活性的檢測 10例正常外周血MNC標(biāo)本均檢出端粒酶活性，其相對端粒酶活性為K562細胞的2.0%3.5%。 三、非腫瘤患兒骨髓MNC端粒酶活性的檢測 10例非腫瘤患者骨髓MNC標(biāo)本均檢出端粒酶活性，其相對端粒酶活性為1.3%5.7%。 四、ALL骨髓MNC端粒酶活性的檢測 在14例兒童初發(fā)ALL骨髓MNC中除2例外，均檢出較高水平的端粒酶

14、活性，其相對活性為75%98%。 討論 本研究結(jié)果表明，正常外周血和骨髓MNCs具有低水平的端粒酶活性，可達K562細胞的3.5%。國外文獻資料顯示，80%以上正常外周血和骨髓MNC的相對端粒酶活性為2%10%68。盡管選用的參照細胞系各不相同，但結(jié)果基本一致。本組10例正常外周血MNC標(biāo)本端粒酶活性較低，可能由于SYBR Green的檢測敏感性低于同位素標(biāo)記和放射自顯影方法所致。 正常外周血和骨髓中具有適度端粒酶活性表達的細胞可能是某些特定的造血干細胞6，7，9。低水平的端粒酶活性既能減緩這類細胞端?？s短的速度，使其增生分裂能力有一定程度的增強，保證了血液細胞充足的自我更新能力，又不足以使其

15、無限度地分裂增生成為永生細胞，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生7，8。另外，除造血細胞外，正常表皮基底細胞、腸粘膜上皮細胞等具有高度分裂增生和自我更新能力的細胞也有一定水平的端粒酶活性，表明端粒酶的適度表達在細胞的增生調(diào)控機制方面也可能具有重要作用8。 另一方面，正常外周血或骨髓中的端粒酶表達細胞也可能是受抗原刺激而激活的免疫細胞。端粒酶在這些細胞中低水平的表達，對于免疫細胞的克隆擴增和正常的免疫功能有著重要的作用911。 本結(jié)果還表明，ALL骨髓MNC具有較高水平的端粒酶活性，明顯高于正常外周血和骨髓MNC端粒酶水平。這一結(jié)果與Broccoli等7報道的ALL病例組端粒酶水平相當(dāng)，但有兩例ALL未檢出

16、端粒酶活性，可能與端粒酶在制備過程中被降解有關(guān)。文獻報道，對慢性白血病的研究表明，在慢性白血病的慢性期，白血病細胞端粒酶水平與正常MNC端粒酶水平相當(dāng)6，7，12。一旦發(fā)生急性變，端粒酶活性則有顯著升高，提示這可能與白血病細胞在兩種疾病狀態(tài)下的增生能力和分化程度不同有關(guān)。因為研究發(fā)現(xiàn)端粒酶活性水平與細胞周期有關(guān)，靜息期細胞(G0期細胞)端粒酶表達受阻抑，而增生期細胞(G1、S、G2和M期細胞)有端粒酶活性13。同時，細胞端粒酶活性水平尚與細胞的分化程度成負相關(guān)14。 綜上所述，ALL白血病細胞具有較高水平端粒酶活性，可能對ALL的診斷具有重要價值。但由于本組病例數(shù)較少，而且不同病例間端粒酶活性

17、差異較大，因此需要進一步研究來闡明端粒酶檢測在ALL診斷和演進方面的作用。 本課題由國家自然科學(xué)基金資助(基金編號：39670767) 作者單位：610041 成都，華西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科 參考文獻 1Blackburn EH. Telomerase. Annu Rev Biochem, 1992,61：113-129. 2Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer. Science,1994,

18、266：2011-2015. 3Feng L, Funk WD, Wang SS, et al. The RNA component of human telomerase. Science,1995,269：1036-1241. 4Piatyszek MA, Kim NW, Weinrich SL, et al. Detection of telomerase activity in human cells and tumors. Meth Cell Sci,1995,17：1-15. 5孫桂香，李齊岳，整理.小兒急性白血病診療建議（修訂草案）.中華兒科雜志,1993，31：285-287.

19、 6Counter CM, Gupta J, Harley CB, et al. Telomerase activity in normal leukocytes and hematologic malignancies. Blood,1995,85：2315-2320. 7Broccoli D, Young JW, Lang TD, et al. Telomerase activity in normal and malignant hematologic cell. Proc Natl Acad Sci USA， 1995,92：9082-9086. 8Lundblad B, Wright

20、 WE. Telomeres and telomerase： a simple picture becomes complex. Cell, 1996,87：369-375. 9Hiyama K, Hirai Y, Kyoizumi S, et al. Activation of telomerase in human leukocytes amd hematopoietic progenitor cells. J Immunol, 1995, 155：3711-3715. 10Bodnar A, Kim NW, Effros RB, et al. Mechanism of telomerase induction during T-cell activation. Exp Cell Res, 1996,228：58-64. 11Norrback KF, Dahlenborg K, Carlsson R, et al.