外治法對實驗性兔膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中bFGF表達的影響

1、    外治法對實驗性兔膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中bFGF表達的影響摘要 ： 目的：了解外治法對堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）在實驗性兔膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達分布情況的 影響 ，探討中醫(yī)外治法 治療 骨性關(guān)節(jié)炎的機理。 方法 ：32只實驗動物隨機分為正常組、模型組、扶他林組和外治法組，采用股靜脈結(jié)扎方法造模成功后，治療1個月。用免疫組化SABC方法對實驗動物膝關(guān)節(jié)滑膜bFGF的表達分布進行觀察。結(jié)果：造模組24只動物膝關(guān)節(jié)滑膜中bFGF免疫組化陽性率為92 %（22/24），且外治法組表達強于扶他林組和模型組。正常組8只動物的膝關(guān)節(jié)滑膜中免疫組化為陰性。結(jié)

2、論：外治法能夠促進實驗動物膝關(guān)節(jié)滑膜bFGF的表達，從而為外治法治療骨性關(guān)節(jié)炎在細胞因子水平提供 理論 依據(jù)。 關(guān)鍵詞 ：骨性關(guān)節(jié)炎；外治法；堿性成纖維細胞生長因子；滑膜骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種慢性關(guān)節(jié)病，又稱退行性關(guān)節(jié)病、增生性關(guān)節(jié)病等。其特征是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生原發(fā)性或繼發(fā)性退行性變，并在關(guān)節(jié)邊緣有骨贅形成。本病的病理變化以關(guān)節(jié)軟骨變性及軟骨下骨質(zhì)病變?yōu)橹?。中醫(yī)外治法治療OA有顯著療效1-2。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）能夠誘導(dǎo)外胚層和中胚層來源的細胞增殖和分化，具有強大的促有絲分裂的作用，且在軟骨損傷后的修復(fù)中有很重要的作用。本實驗通過檢測bFGF在兔關(guān)節(jié)滑

3、膜中的表達及分布，試圖探討中醫(yī)外治法治療OA的機理。1 材料 1.1 實驗動物健康雄性新西蘭大耳白兔32只，購自華中 科技 大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，質(zhì)量2.12.5 kg。 1.2 實驗試劑及儀器bFGF一抗、SABC試劑盒、DAB顯色盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；扶他林乳膠劑購自湖北省中醫(yī) 醫(yī)院 。熏洗中藥購自湖北武漢定康大藥房，方劑采用湖北省中醫(yī)醫(yī)院成方傷科熏洗湯。中藥組成：羌活12 g、獨活12 g、桂枝10 g、桑枝30 g、伸筋草10 g、透骨草10 g、花椒10 g、艾葉10 g、五加皮12 g、海桐皮12 g、白芷10 g、防風(fēng)10 g。G6805-1型針灸治療儀為青島

4、鑫升實業(yè)有限公司生產(chǎn)，湖北中醫(yī)學(xué)院針灸實驗中心提供。2 方法 2.1 造模方法以結(jié)扎股靜脈的方法3造模，用0.3 %的戊巴比妥按3 mg/kg劑量進行耳緣靜脈麻醉。麻醉滿意后將家兔仰臥固定于兔臺上，四肢伸直。所有實驗動物均取右側(cè)下肢造模。右側(cè)股根部備皮、消毒，無菌條件下操作，用手指觸及腹股溝股動脈搏動處并以此為中心，做2 cm縱行切口，切開皮膚、皮下組織，暴露股神經(jīng)血管束，分離股靜脈并進行雙重結(jié)扎，在兩道結(jié)扎線間將股靜脈剪斷，縫合皮膚及皮下組織。術(shù)后每天肌注青霉素20萬U/只，共7 d，以預(yù)防感染。2.2 分組及處理32只白兔隨機分為正常組、模型組、扶他林組和外治法組，每組8只。正常組不做任何

5、特殊處理。模型組造模成功后正常喂養(yǎng)，自由活動。扶他林組用扶他林乳膠劑在患膝周圍涂抹均勻，輕揉35 min。外治法組則用中藥熏蒸配合手法彈撥以及電刺激，每次熏蒸30 min，手法彈撥20 min，以膝關(guān)節(jié)周圍及股后側(cè)及小腿后側(cè)肌肉為主，配合伸膝關(guān)節(jié)。電刺激采用G6805-1型針灸治療儀，配用自制電極，主要刺激兔股前側(cè)及小腿后側(cè)肌肉及膝周穴位，引起兔患膝被動屈伸達40°50°為宜，主要以屈曲為主。以上兩組均造模成功、自由喂養(yǎng)8周后分別開始治療。治療4周后處死動物取標本，標本取出后用10 %多聚甲醛固定，行石蠟切片。模型組和正常組均在相應(yīng)時間處死，取標本做石蠟切片。2.3 檢測方

6、法石蠟切片常規(guī)脫蠟，3 %的雙氧水室溫510 min滅活內(nèi)源性酶?？乖瓱嵝迯?fù)。滴加5 % BSA封閉液，20 min(室溫下)。加入稀釋的bFGF一抗，1 h(37 )。加入生物素標記的羊抗兔二抗，鏈霉親合素生物素過氧化酶溶液與DAB液，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間。蘇木素復(fù)染封片觀察。其間每個步驟均用PBS沖洗5 min 3次。結(jié)果判定：在400倍高倍鏡下觀察細胞內(nèi)外有無染色，未著色為陰性，淺棕黃色為弱陽性，中等棕黃色為陽性，深棕黃色為強陽性。2.4 統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±)表示，組間差異比較采用q檢驗，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行 分析 。3

7、 結(jié)果 正常組免疫組化染色為陰性；模型組僅有部分細胞因子反應(yīng)陽性，部分為弱陽性，胞漿中有黃褐色的斑塊狀陽性物質(zhì)分布，但量較少，大部分細胞無著色，外治法組和扶他林組與正常組相比有所不同，胞漿中陽性物質(zhì)數(shù)量增多，陽性細胞增加。在400倍光鏡下每組選取10個典型視野，采用同濟醫(yī)科大學(xué)免疫組化實驗室HMIAS-2000型全自動醫(yī)學(xué)彩色圖像 分析 系統(tǒng)進行分析。具體結(jié)果見表1。表1 各組bFGF平均光度均值的比較(略)注:與外治法組比較*P0.05，*P0.014 討論 bFGF最早由牛的腦垂體中提取，是由146個氨基酸組成的活性物質(zhì)，它對中胚層來源的細胞有明顯的促有絲分裂作用4。它的生物學(xué)功能有以下幾

8、個方面：促進新生血管形成;促進軟組織損傷修復(fù);促進骨、軟骨組織損傷修復(fù)?，F(xiàn)已證實在人體和動物實驗中bFGF關(guān)節(jié)內(nèi)注射對軟骨細胞的再生修復(fù)有很好的促進作用5。實驗 研究 表明bFGF對體外培養(yǎng)的兔軟骨細胞促進膠原合成和維持軟骨細胞表型有重要作用6。并認為可能與以下作用有關(guān)： 增加細胞匯合生長時細胞的量；增加軟骨細胞蛋白多糖和膠原合成，可使高分子蛋白多糖和型膠原含量增高；可阻滯軟骨細胞的分化；可使衰老或退變的軟骨細胞反分化而使其表型接近正常細胞。徐衛(wèi)東等7通過觀察bFGF對培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細胞基質(zhì)及轉(zhuǎn)化生長因子1(TGF1)表達的 影響 ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)bFGF能明顯促進膠原和蛋白多糖的合成，并與劑量、時

9、間成正相關(guān)，能促進關(guān)節(jié)軟骨TGF1的表達，從而推遲了關(guān)節(jié)軟骨細胞的成熟，維持細胞的軟骨表現(xiàn)型。本實驗中采用股靜脈結(jié)扎的造模 方法 ，比較接近OA早期的病理改變。OA在中醫(yī)屬“痹證”范疇。通過結(jié)扎股靜脈造成下肢血液回流受阻，與其他的造模方法相比，保留膝關(guān)節(jié)功能與正常結(jié)構(gòu)，更符合該病的臨床發(fā)病 規(guī)律 。實驗結(jié)果表明：外治法組關(guān)節(jié)滑膜中bFGF的表達明顯強于扶他林組，可能與以下因素有關(guān)：（1）熏洗中藥主要具有活血化瘀、祛風(fēng)勝濕、溫通經(jīng)絡(luò)的作用，通過熏洗的熱效應(yīng)和藥物作用可以使淤滯的氣血得以溫通，改善了局部的微循環(huán)條件。其中羌活、獨活、五加皮、海桐皮、伸筋草、透骨草等祛風(fēng)濕類中藥有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛作用

10、8。（2）通過電刺激以及手法 治療 后，可以促進靜脈回流，可能對bFGF的表達也有影響。 參考  文獻  ：1姜洪洋，薛劍冰，程云峰.中藥熏洗治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎120例報告J.中醫(yī)正骨,2004,7(7):50.2熊昌源，許申明.壓腿鍛煉、手法彈撥、中藥熏蒸三聯(lián)法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎療效觀察J.中醫(yī)正骨，1995,7（3）：3-4.3張子峰，熊昌源，梁克玉.骨內(nèi)高壓致骨性關(guān)節(jié)炎的動物實驗J.前衛(wèi)醫(yī)藥雜志，1998,15（6）：344-345.4Gospodarwicz D. Fibroblast growth factor chemical structure and biologic functionJ. Clin Orthop Relat Res,1990,257：231.5丁煥文，何錫煌.堿性成纖維細胞生長因子的生物學(xué)功能J.中華創(chuàng)傷雜志,1995,11(3):189-191. 6馮明利，雍宜民，沈惠良，等.bFGF對體外培養(yǎng)的兔軟骨細胞的膠原合成和穩(wěn)定細胞表型的作用J.首都醫(yī)科大學(xué)