大鼠腦缺血再灌注后全腦及血清炎性因子水平研究

1、文章編號(hào):100322754(20090420456203大鼠腦缺血再灌注后全腦及血清炎性因子水平研究沈麗華1,葉民2,丁新生3,韓秋1,吳二兵1收稿日期:2009203223;修訂日期:2009207212作者單位:(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇南通226001; 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇南京210029;3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇南京210029;丁新生,通迅作者摘要:目的研究局灶性腦缺血再灌注后炎性細(xì)胞因子的損傷機(jī)制。方法按照Longa 法構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型,在再灌注后6h 、24h 、3d 、7d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過TTC (2,3,5

2、2氯化三苯四氮唑染色法觀測腦梗死灶的大小,以酶標(biāo)記免疫吸附測定法(E L I S A 測定模型缺血側(cè)、健側(cè)腦組織勻漿及血清中T NF 2、I L 26的濃度,并分別與假手術(shù)組對比。結(jié)果患側(cè)和健側(cè)腦組織的T NF 2水平在發(fā)病6h 即明顯升高,3d 達(dá)高峰,I L 26的升高遲于T NF 2,在24h 達(dá)高峰;7d 時(shí)二者濃度仍與假手術(shù)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩半球腦組織間未見顯著性差異;血清中兩者升高均晚于腦組織,且升高幅度較低。缺血灶的大小與上述炎癥因子的水平相一致。結(jié)論炎性反應(yīng)遍及全腦并作用于全身,貫穿于腦缺血再灌注損傷的整個(gè)病理過程。關(guān)鍵詞:腦缺血再灌注損傷;腦梗死;腫瘤壞死因子;白細(xì)胞介素26

3、中圖分類號(hào):R743.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:AStudy on cytok i n e changes of bra i n and seru m i n ra ts w ith cerebra l ische m i a 2reperfusi on SHEN L i 2hua,YE M in,D I N G X in 2sheng,et al .(D epart m ent of N eurology,The A ffiliated Hospital of N antong U niversity,N antong 226001,China Abstract:O bjecti ve To study

4、 the mechanis m of inflammat ory cyt okines in the cerebral ische m ia 2reperfusi on inju 2ry .M ethods Rats were subjected t o cerebral ische m ia 2reperfusi on induced by a m iddle cerebral artery occlusi on (MCAO with Longas methods .A t 6h,24h,3d and 7d after reperfusi on,infarct size was deter

5、m ined by 2,3,52tri phenyi ter 2azol oride (TTC staining method,the data of T NF 2and I L 26were deter m ined in i p silateral and contralateral cerebral hem is phere and seru m by enzy me linked i m munos orbent assay (E L I S A ,compared with sha m 2operated gr oup res pectively .Results T NF 2in

6、i p silateral and contralateral brain tissue increased significantly in early ische m ia 2reperfusi on and peak 2ed at 3d,I L 26elevated a little later than T NF 2and peaked at 24h .No distinctive difference was observed in bilateral hem 2is phere .The changes of infla mmat ory cyt okines in seru m

7、were less and lagged than that in brain .Accordant changes of in 2farct size and ede ma were found .Conclusi on The infla mmat ory reacti on appears in the pathol ogic devel opment of focal cerebral ische m ia 2reperfusi on injury and s p reads thr oughout all brain and body .Key words:B rain ischem

8、 ia 2reperfusi on injury;Cerebral infarcti on;T NF 2;I L 26炎癥機(jī)制在腦缺血再灌注損傷中的作用越來越受到重視,腫瘤壞死因子(T NF 2及白細(xì)胞介素6(I L 26均是重要的炎性細(xì)胞因子,二者相互作用1,在神經(jīng)損傷中起重要作用。本研究使用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,動(dòng)態(tài)檢測缺血再灌注后6h 、24h 、3d 、7d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)和健側(cè)腦組織以及血清中T NF 2、I L 26含量的變化情況,同時(shí)觀察上述時(shí)間點(diǎn)腦梗死灶的大小、形態(tài),分析局灶性腦梗死后炎性因子在全腦和血清中的變化情況,研究炎性因子在腦缺血再灌注損傷過程中的作用,為腦缺血

9、后再灌注損傷的治療提供依據(jù)。1材料與方法1.1大鼠實(shí)驗(yàn)分組及腦缺血再灌注模型制備健康雄性S D 大鼠44只,體重220250g (由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為模型組(24只,按照Longa 等的方法加以改良制備短暫性MCAO 模型。具體步驟:10%水合氯醛(3m l/kg 腹腔注射麻醉后,將S D 大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,沿頸正中切開皮膚,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA ,結(jié)扎頸外動(dòng)脈分支(ECA 與翼腭動(dòng)脈。CCA 近心端以手術(shù)線結(jié)扎;結(jié)扎線的遠(yuǎn)端用眼科剪剪開小口,將尼龍栓線(4/0號(hào)插入頸內(nèi)動(dòng)脈達(dá)到大腦前動(dòng)脈,平均插入深度由分叉部計(jì)(19.5±0.5mm ,線栓的血管外部分結(jié)扎

10、固定。右側(cè)腦缺血2h 后,小心拔除栓線,實(shí)現(xiàn)缺血后的再灌注。動(dòng)物清醒后出現(xiàn)左前爪下垂,爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈,行動(dòng)遲緩等表現(xiàn)為模型成功,提尾有左前肢屈曲內(nèi)收者方可入組。假手術(shù)組20只,手術(shù)同前,不插入栓線。1.2大鼠血漿抽取及腦組織勻漿制備在缺血再灌注后6h 、24h 、3d 、7d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn),每組5只大鼠,以10%水合氯醛麻醉打開胸腔,以注射器抽取心臟血3m l,37水浴半小時(shí)后,3000r pm /m in 離心654J Apop lexy and Nervous D iseases,August 2009,Vol 26,No .410m in,留取血清備用。開顱取腦,以萬分之一電子天平準(zhǔn)確稱

11、取大鼠缺血區(qū)和健側(cè)相同部位腦組織100mg,加入1m l0.9%NaCl(生理鹽水,在組織勻漿器中研磨,制備成10%組織勻漿,全部勻漿過程均在4冰浴環(huán)境下完成。1.3TT C染色模型大鼠4只在上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn),開顱取腦,置-4冰箱20m in,將其切成5等份冠狀位切片,置2%TT C溶液中,37水浴,4%多聚甲醛固定。缺血再灌注病灶呈蒼白色,正常組織呈紅色。1.4大鼠腦組織勻漿及血清T NF2、I L26測定采用雙抗體“夾心”酶聯(lián)免疫吸附測定(EL I S A方法(晶美生物工程有限公司。將檢測大鼠腦組織勻漿及血清經(jīng)適當(dāng)稀釋加入E L I S A板孔中,封板37反應(yīng)90m in后洗板5次;加入準(zhǔn)備

12、好的生物素化抗體工作液,封板37反應(yīng)60m in后洗板5次;加入酶結(jié)合物工作物,封板避光37反應(yīng)30m in后洗板5次;再加入含顯色底物四甲基苯肼(T MB的顯色液,37避光反應(yīng)1520m in;最后加入終止液中止顯色反應(yīng)并迅速測定450nm吸光度。根據(jù)已知濃度的人T NF2或I L26標(biāo)準(zhǔn)品(試劑盒提供進(jìn)行梯度稀釋并測定450n m吸光度,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)及檢測標(biāo)本均采用復(fù)孔,復(fù)孔測定的吸光度值取均數(shù)減去零標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度值的均數(shù)作為該濃度標(biāo)準(zhǔn)濃度或檢測標(biāo)本的測定值,進(jìn)一步通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計(jì)算出含量濃度。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均以±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,

13、計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1大鼠腦組織缺血再灌注6h、24h、3d和7d 的TTC染色的染色結(jié)果右側(cè)大腦半球白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū),正常腦組織呈紅色。6h已出現(xiàn)梗死灶,但中線無明顯移位,在24h和3d可見腦中線移位,組織腫脹,尤以3d明顯,7d腦腫脹減輕。2.2大鼠腦組織及血清中T NF2、I L26的動(dòng)態(tài)改變腦缺血再灌注組大鼠缺血側(cè)腦組織勻漿T NF2濃度在缺血再灌注6h開始即已明顯增高,并于3d達(dá)高峰,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,3d高峰濃度與其他時(shí)段相比,也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01;而I L26的濃度

14、雖在6h也已開始升高,但與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,24h才見明顯高峰,與正常組及6h組相比有顯著性差異(P<0.01,而與其他時(shí)段組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。健側(cè)腦組織兩者的變化趨勢與患側(cè)大致相同(見表1。大鼠血清T NF2、I L26升高較遲,在24h組和3d組較假手術(shù)組有明顯升高,但升高幅度不如腦組織明顯,以后逐漸下降,7d與對照組已沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;組間比較發(fā)現(xiàn)3d時(shí)血清T NF2、I L2 6的濃度顯著高于6h組和7d組(分別為P<0.01, P<0.05(見表2。表1腦缺血再灌注模型大鼠腦組織T NF2、I L26的動(dòng)態(tài)變化(±s,pg/m l組別例數(shù)6h24h

15、3d7dT NF2模型組缺血側(cè)模型組健側(cè)假手術(shù)組I L26模型組缺血側(cè)模型組健側(cè)假手術(shù)組202020202020445.8±91.73472.4±94.63155.2±72.597.7±39.291.4±30.187.4±22.7470.1±83.43481.7±111.73162.1±110.4261.8±51.03259.9±70.3388.3±26.3715.5±121.3#3673.8±130.5#3159.2±96.6255.7

16、7;42.83225.4±55.9378.6±30.2478.1±145.53489.6±107.83148.5±101.7229.1±75.23192.8±56.2382.4±18.5與假手術(shù)組相比3P<0.01;與其他時(shí)間點(diǎn)比較#P<0.01表2腦缺血再灌注模型大鼠血清T NF2、I L26的動(dòng)態(tài)變化(±s,pg/m l組別例數(shù)6h24h3d7dT NF2實(shí)驗(yàn)組假手術(shù)組I L26實(shí)驗(yàn)組假手術(shù)組2020202085.8±39.175.9±20.533.9±7.2

17、30.3±8.0112.2±28.3#79.6±25.945.7±13.9#31.6±10.5133.8±45.5377.1±22.346.8±15.4#30.8±9.498.3±35.677.8±21.635.3±12.931.2±9.6與假手術(shù)組相比#P<0.05;與假手術(shù)組相比3P<0.01;與6h相比P<0.01,與7d相比P<0.05754中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志2009年8月第26卷第4期3討論缺血性腦血管病的發(fā)病率、致殘率、致死率都很

18、高,給社會(huì)和家庭帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān),及時(shí)地恢復(fù)血流有利于減輕神經(jīng)功能缺損,然而血液再灌注也能導(dǎo)致腦組織的損傷和功能障礙2。許多研究表明,腦缺血再灌注后,缺血的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的炎性因子,T NF2和I L26是其中十分重要的細(xì)胞因子36。我們在實(shí)驗(yàn)中建立了線栓法S D大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞局灶性腦缺血再灌注的動(dòng)物模型,模擬人類缺血性腦血管病再灌注的狀態(tài),從6h、24h、3d及7d4個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀測健側(cè)和患側(cè)腦組織及血清中T NF2和I L26水平,并同時(shí)觀察腦梗死體積,了解局灶性腦缺血再灌注后炎性細(xì)胞因子的濃度變化、作用部位,以探討其作用機(jī)制,目前國內(nèi)外尚無類似報(bào)道。結(jié)果顯示,大

19、鼠腦缺血再灌注后6h整個(gè)腦組織的T NF2即已經(jīng)明顯升高,達(dá)到正常對照組的3倍,這表明T NF2參與了大鼠腦缺血再灌注的急性反應(yīng),I L26的升高稍遲于T NF2,高峰表達(dá)出現(xiàn)于24h;而T NF2的高峰在72h出現(xiàn),與國外Uno、Sairanen、國內(nèi)李力仙等79學(xué)者的研究結(jié)果一致。兩種細(xì)胞因子濃度的升高均保持較長時(shí)間,在7d仍高于假手術(shù)組,表明T NF2、I L26共同作用于腦缺血再灌注的炎癥反應(yīng)過程,這其中以T NF2為首要的啟動(dòng)效應(yīng)因子,進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),刺激I L21、I L26等下游因子,產(chǎn)生細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)10,從而引起血管通透性增加腦水腫、細(xì)胞凋亡和壞死11。在實(shí)驗(yàn)過程中我

20、們也發(fā)現(xiàn)缺血再灌注大鼠的健側(cè)腦組織同時(shí)伴隨著高水平的T NF2、I L26表達(dá)。這可能是由于:(1缺血側(cè)腦組織水腫導(dǎo)致腦中線移位,健側(cè)腦組織受壓、缺血,從而引起炎性因子分泌增加;(2缺血再灌注過程一方面刺激全身性循環(huán)系統(tǒng)單核2巨噬細(xì)胞系分泌T NF2、I L26增加;另一方面缺血再灌注側(cè)局灶性的炎癥反應(yīng)可以通過神經(jīng)元軸突傳遞和釋放,產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng),激活全腦的炎癥反應(yīng)。血清中T NF2、I L26的變化趨勢與腦組織一致,在手術(shù)后24h、3d缺血再灌注組較假手術(shù)組有顯著升高,與本作者前期臨床研究的結(jié)果一致12,其中以3d最為明顯。但幅度較腦組織低,持續(xù)時(shí)間也較短,7d與對照組已沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示局

21、灶腦缺血再灌注損傷后腦內(nèi)炎癥因子通過破壞的血腦屏障引起全身炎性反應(yīng),在發(fā)病的急性期毒性較大。同時(shí)段的腦組織TTC顯示在發(fā)病6h已出現(xiàn)梗死灶;24h梗死灶產(chǎn)生占位效應(yīng)使中線移位;3d梗死灶完全形成,腦組織腫脹明顯,中線進(jìn)一步受壓移位;7d梗死灶縮小,中線移位較前減輕。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與腦組織及血清的T NF2、I L26的濃度變化相一致。隨著病程延長炎性因子的表達(dá)下降,梗死灶也開始吸收、水腫減輕。我們分析可能的機(jī)制為:(1 T NF2、I L26上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上的粘附因子(I CAM21的表達(dá),引起血管炎性反應(yīng),加重腦缺血;(2使血腦屏障的通透性增加,腦組織水腫;(3通過細(xì)胞因子的級聯(lián)效應(yīng)

22、,加劇腦組織的炎癥反應(yīng),釋放大量的毒性物質(zhì),加重神經(jīng)細(xì)胞的壞死13。綜上所述,腦缺血再灌注后急性期即出現(xiàn)T NF2、I L26濃度的升高,3d的變化最顯著,以后逐漸下降,與腦梗死灶的大小及水腫嚴(yán)重程度相一致,提示炎癥反應(yīng)貫穿著腦缺血再灌注損傷的整個(gè)病理、生理過程;同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)從局部損傷腦組織擴(kuò)散到全腦并可引起全身的毒血反應(yīng)。所以干預(yù)炎性反應(yīng)可減輕腦組織的損害,改善腦功能;也可為我們避開機(jī)體毒性反應(yīng)的高峰期提高神經(jīng)保護(hù)藥物的療效提供理論上的依據(jù)。參考文獻(xiàn)1Zhu Y,Sait o K,Murakam i Y,et al.Early increase in mRNA levels of

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