淺論超聲聯(lián)合微泡對內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

1、淺論超聲聯(lián)合微泡對內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響                作者：范國峰，馮毅，童嘉毅，楊芳，馬根山，姚玉宇  【摘要】  目的：體外探討超聲聯(lián)合微泡對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，為進(jìn)一步體內(nèi)研究提供科學(xué)依據(jù)。方法：體外提取、分離和培養(yǎng)豬骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞，隨機(jī)分為對照組、超聲組、超聲微泡組，干預(yù)后24 h分別采用CCK8檢測細(xì)胞增殖活性，PI染色流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡壞死及細(xì)胞周期。結(jié)果：

2、（1）低聲強(qiáng)超聲（0.251.0 W·cm-2）聯(lián)合微泡作用下對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性無明顯影響；較高聲強(qiáng)（1.0 W·cm-2）作用下，隨聲強(qiáng)逐漸增大，細(xì)胞增殖活性逐漸降低。（2）與對照組比較，超聲微泡組（頻率1 MHz,輸出功率1.0 W·cm-2，輻照90 s）對內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡壞死及細(xì)胞周期無明顯影響，而同樣條件下超聲組細(xì)胞凋亡壞死明顯增加，同時(shí)顯著抑制細(xì)胞DNA合成。結(jié)論：1.0 W·cm-2超聲聯(lián)合微泡干預(yù)內(nèi)皮祖細(xì)胞對細(xì)胞增殖活性、凋亡壞死及細(xì)胞周期無明顯不良影響，為進(jìn)一步應(yīng)用超聲微泡體內(nèi)干預(yù)內(nèi)皮祖細(xì)胞移植的研究提供可能。 【關(guān)鍵詞】 

3、超聲; 微泡； 內(nèi)皮祖細(xì)胞； 增殖； 凋亡； 細(xì)胞周期藥物治療和血運(yùn)重建技術(shù)的不斷發(fā)展,使急性心肌梗死的病死率明顯降低，但對心肌梗死后心力衰竭仍無有效的治療手段。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類能夠自我增殖和分化為內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞，能促進(jìn)缺血組織血管新生，增加血流灌注，改善心功能。而超聲聯(lián)合微泡作用能促進(jìn)組織局部動(dòng)脈生成，使灌注血流增加；并且在毛細(xì)血管壁產(chǎn)生微孔，可能有利于細(xì)胞的靶向傳輸。本實(shí)驗(yàn)在體外探討超聲聯(lián)合微泡對EPCs增殖活性、凋亡壞死及細(xì)胞周期的影響，為進(jìn)一步體內(nèi)研究超聲聯(lián)合微泡增效EPCs治療缺血性心臟病提供依據(jù)。 &

4、#160;  1  材料和方法   11  主要試劑和設(shè)備   淋巴細(xì)胞分離液FicollPaque（天津?yàn)笊锕荆?、培養(yǎng)液EGM2（Cambrex公司）、纖維連接蛋白（Fn，Chemicon公司）；DiI標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍祝―iIacLDL,Molecular Probe公司）、FITC標(biāo)記荊豆凝集素I（FITCUEAI，Sigma公司）；CCK8試劑盒（碧云天生物科技研究所）、PI凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；含氟碳?xì)怏w脂質(zhì)體微泡（東南大學(xué)生物工程材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）、熒光正立顯微鏡（Nicon公司

5、）、CZT3超聲同步治療儀（沈陽新樂康復(fù)醫(yī)療儀器廠）、BioRad酶標(biāo)儀、FACS Calibur流式細(xì)胞儀。   1.2  細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定   于雄性中國小型豬脛骨近端抽取骨髓約20 ml，加入FicollPaque分離液，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，以3×105的密度接種于鋪有Fn的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液用EGM2。培養(yǎng)至7 d左右行DilacLDL和FITCUEAI雙染色，記數(shù)雙陽性細(xì)胞為EPCs。   1.3  EPCs的干預(yù)   培養(yǎng)細(xì)胞分為對照組、超聲組和超聲微泡組3

6、組。實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)的EPCs用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，搖勻后以100 l（約5×105 ml-1）加入96孔培養(yǎng)板。對照組不做干預(yù)，超聲組以頻率1 MHz、輸出功率1.0 W·cm-2持續(xù)輻照90 s；超聲微泡組加入5 l微泡（約2×108 ml-1），以同樣超聲條件作用90 s。96孔培養(yǎng)板固定在37 雙蒸水水槽表面，超聲探頭垂直置于培養(yǎng)板下方約8 cm處，為避免超聲波對鄰近孔細(xì)胞的影響，隔孔接種細(xì)胞，每組8孔。1.4  CCK8測定細(xì)胞增殖活性   當(dāng)孔內(nèi)細(xì)胞生長至60%70%融合時(shí),無血清培養(yǎng)24 h，以0.25、0.5、0.75

7、、1.0、1.5、2.0 W·cm-2的不同聲強(qiáng)超聲聯(lián)合微泡干預(yù)EPCs，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK8溶液10 l，37 孵育12 h，酶標(biāo)儀上以450 nm測吸光度，細(xì)胞增殖越多、越快，則顏色越深，呈線性關(guān)系。   1.5  流式細(xì)胞儀檢測壞死凋亡細(xì)胞及細(xì)胞周期   各組細(xì)胞干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用1 ml冷PBS制成1×105 ml-1的細(xì)胞懸液,1 000 r·min-1離心10 min，棄上清,將細(xì)胞重懸于200 l結(jié)合緩沖液中,加入PI液5 l，混勻避光室溫反應(yīng)15 min，再加入300

8、l結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長488 nm檢測，結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，直接給出凋亡及壞死細(xì)胞百分比，同時(shí)獲得DNA含量分布結(jié)果。   1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理   采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用x-±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），組間兩兩比較采用Student Newman Keuls（SNK）檢驗(yàn)，P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)   果   21  EPCs的鑒定結(jié)果&#

9、160;  培養(yǎng)第7天貼壁細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，可見圓形及不規(guī)則形細(xì)胞。熒光顯微鏡下，細(xì)胞攝取DiIacLDL后呈紅色，F(xiàn)ITCUEAI染色后呈綠色，雙染色細(xì)胞中EPCs占90以上（圖1）。   22  超聲聯(lián)合微泡作用對EPCs增殖活性的影響   0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0 W·cm-2不同聲強(qiáng)超聲微泡組的吸光度值分別為1.344±0.177、1.305±0.159、1.301±0.110、1.234±0.101、1.063±0.093和0.759&#

10、177;0.078（圖2）。與對照組（1.325±0.143）相比，0.25、0.5、0.75和1.0 W·cm-2組對EPCs增殖活性無影響（P=0.840），1.5和2.0 W·cm-2組EPCs增殖活性明顯下降（P0.05）?？梢姵暵?lián)合微泡作用對EPCs增殖活性無影響的最大超聲能量是1.0 W·cm-2，可以在獲得最大生物效應(yīng)同時(shí)安全用于實(shí)驗(yàn)研究。圖2  不同聲強(qiáng)超聲聯(lián)合微泡作用下的吸光度（CCK8法）            2.3

11、60; 超聲聯(lián)合微泡對EPCs凋亡壞死的影響   為了進(jìn)一步研究1.0 W·cm-2聲強(qiáng)超聲聯(lián)合微泡對EPCs的影響，用PI染色流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡壞死情況。檢測結(jié)果顯示對照組為(11.84±0.30)%、超聲組為(14.70±0.35)%，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；超聲微泡組為（12.70±0.24），與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.960）。   2.4  超聲聯(lián)合微泡對EPCs細(xì)胞周期的影響   用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析表明，1.0 W·cm-2聲強(qiáng)超

12、聲作用下處于S期的EPCs比例為（5.11±0.86），較對照組（25.20±2.47）明顯減少，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）；而超聲微泡組為（27.32±5.26），較對照組反而有輕度增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.760）。見表1。 表1  對照組、超聲組與超聲微泡組不同細(xì)胞周期EPCs    3  討   論   缺血性心臟病已成為不同收入國家人口死亡的首要原因，分別占到低中收入和高收入國家患病人口的11.8和17.3ALAN D L，COLIIN D M，MAJID

13、E，et al.Global and regional burden of disease and risk factors，2001:systematic analysis of population health dataJ.Lancet,2006,367:17471757.2VINCENT F M S，RICHARD T L.Stemcell therapy for cardiac diseaseJ.Nature,2008,451:937942.3JI S，MING Q，SANJIV K，et al.Stimulation of arteriogenesis in skeletal mu

14、scle by microbubble destruction with ultrasoundJ.Circulation,2002,106:15501555.4SONG J I，PATRICK S C，ALEXANDER L，et al.Microvascular remodeling and accelerated hyperemia blood flow restoration in arterially occluded skeletal muscle exposed to ultrasonic microbubble destructionJ.Am J Physiol Heart Ci

15、rc Physiol,2004,287(6):H27542761.5JUNJI Y，KOJI O，HIROTO T，et al.Treatment of ischemic limbs based on local recruitment of vascular endothelial growth factorproducing inflammatory cells with ultrasonic microbubble destructionJ.J Am Coll Cardiol,2005,46:899905.6SOPHIE H，ALEXANDER L，KLIBANOV S.Microbub

16、bles in ultrasoundtriggered drug and gene deliveryJ.Advanced Drug Delivery Reviews,2008,60:11531166.7FERIL L B，KONDO T，ZHAO Q L，et al.Enhancement of hyperthermial induced apoptosis by nonthermal effects of ultrasoundJ.Cancer Lett,2002,178 (1):6370.8BORIS K，EITAN K.Shear stress induced by a gas bubbl

17、e pulsating in an ultrasonic field near a wallJ.IEEE Transactions on Ultrasonics，F(xiàn)erroelectrics，and Frequency Control,2004,51:973979.9KIMIKO Y，TAKAAKI S，TETSURO W,et al.Fluid shear stress induces differentiation of Flk1positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitroJ.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,288:H1915H1924.10TAO J，YANG Z，WANG J M,et al.Effects of fluid shear stress o