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文檔簡介
1、低分子量透明質(zhì)酸增強(qiáng)HAV抗原誘導(dǎo)的小鼠體液免疫應(yīng)答的研究 作者:舒曉明, 胡凝珠, 蘭蕓, 陶里, 陳陽, 羅愛華, 胡云章【摘要】 目的: 研究內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子低分子量透明質(zhì)酸作為天然佐劑對HAV抗原誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響。方法: 將ICR小鼠分成9組, 分別設(shè)生理鹽水對照組、 HAV抗原組、 HAV抗原+鋁佐劑組、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸50 g組、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸100 g、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸200 g、
2、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸300 g、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸500 g、 HAV抗原+低分子量透明質(zhì)酸1 mg組, 皮下免疫小鼠。分別在4、 8、 12 、 16周用ELISA法檢測小鼠血清抗HAV IgG水平。結(jié)果: (1)空白對照組在4、 8、 12 和16周未見抗HAV IgG產(chǎn)生; 各實(shí)驗(yàn)組抗HAV IgG水平在8周時(shí)達(dá)到最高; 12周和16周時(shí)各免疫組的抗HAV IgG水平逐漸下降, 尤以鋁佐劑組下降明顯; (2)與HAV抗原組相比, 低分子量透明質(zhì)酸各免疫組小鼠血清抗HAV IgG水平明顯升高(P0.05); 與鋁佐劑組相比, 低分子量透明質(zhì)酸免疫組明顯增強(qiáng)特異性抗HA
3、V IgG水平(P0.05或P0.05); (3)低分子量透明質(zhì)酸安全無毒, 無過敏反應(yīng)。結(jié)論: 低分子量透明質(zhì)酸能夠明顯增強(qiáng)滅活HAV抗原的體液免疫應(yīng)答, 具有強(qiáng)的免疫佐劑作用。其免疫佐劑效應(yīng)優(yōu)于鋁佐劑。 【關(guān)鍵詞】 透明質(zhì)酸 危險(xiǎn)信號 佐劑免疫佐劑對輔助抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久高水平的免疫應(yīng)答十分重要1, 透明質(zhì)酸(hyalouronan acid, HA)是從動(dòng)物組織提取的一種黏多糖, 由(14)D葡糖醛酸和(1 3)N乙?;鵇氨基葡糖雙糖單位重復(fù)連接組成。透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分而廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì), 它是構(gòu)成皮膚、 玻璃體、 關(guān)節(jié)滑液和軟骨組織的重要成分, 具有獨(dú)特的
4、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。近年研究表明, 低分子量透明質(zhì)酸是免疫系統(tǒng)的一種重要內(nèi)源性危險(xiǎn)信號, 與TLR2作用后, 以依賴于MyD88、 IL1R相關(guān)激酶、 TNFR相關(guān)因子6、 蛋白激酶C、 NFB的方式進(jìn)行信號傳導(dǎo), 激活機(jī)體的天然免疫應(yīng)答。因此我們推測低分子量透明質(zhì)酸可能具有免疫佐劑的特性。本研究中以低分子量透明質(zhì)酸作為疫苗佐劑, 與HAV抗原混合后皮下免疫接種小鼠, 觀察內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子低分子量透明質(zhì)酸對HAV抗原誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響, 以探討低分子量透明質(zhì)酸作為疫苗佐劑的可行性。1 材料和方法1.1 材料 ICR健康小鼠(SPF級, 雌性, 6
5、8周齡, 質(zhì)量1820 g), 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的方法飼養(yǎng)。酶標(biāo)儀(BioRAD Microplate reader Model 550)購自美國BioRAD公司??笻AV IgG ELISA檢測試劑盒購自KPL公司, 酶標(biāo)板購自美國eBioscienc公司。滅活HAV抗原和Al(OH)3佐劑均由本室保存。低分子量透明質(zhì)酸(相對分子量(Mr)為10000以下)購自江蘇鎮(zhèn)江東元生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 低分子量透明質(zhì)酸的制備 用電子天平稱取適量低分子量透明質(zhì)酸, 用蒸餾水溶
6、解配制成濃度為5 g/L。1.2.2 免疫動(dòng)物 將ICR雌性小鼠隨機(jī)分成9組, 分別設(shè)生理鹽水空白對照組、 HAV抗原200 g免疫組(HAV)、 HAV抗原200 g+300 g鋁佐劑免疫組(HAVAL)、 HAV抗原200 g+50 g透明質(zhì)酸免疫組(HAVHA1)、 HAV抗原200 g +100 g透明質(zhì)酸免疫組(HAVHA2)、 HAV抗原200 g +200g透明質(zhì)酸免疫組(HAVHA3)、 HAV抗原200g +300g透明質(zhì)酸免疫組(HAVHA4)、 HAV抗原200 g +500 g透明質(zhì)酸免疫組(HAVHA5)和HAV抗原200 g +1 mg透明質(zhì)
7、酸免疫組(HAVHA6), 每組6只。免疫途徑為皮下免疫, 共免疫1次。1.2.3 血清抗HAV IgG水平檢測 分別于免疫后4、 8、 12和16周對小鼠尾靜脈采血, 血樣37放置1 h后, 4過夜, 分離血清, 用ELISA試劑盒檢測抗HAV的特異性IgG水平, 具體操作方法按照試劑盒說明書。1.2.4 低分子量透明質(zhì)酸安全性檢測 (1)低分子量透明質(zhì)酸的異常毒性試驗(yàn): 實(shí)驗(yàn)組選用ICR小鼠10只, 雌雄各1半, 每只小鼠皮下注射5 mg低分子量透明質(zhì)酸, 同時(shí)設(shè)立生理鹽水對照組, 連續(xù)觀察7 d。(2)低分子量透明質(zhì)酸的刺激性試驗(yàn): 取IC
8、R小鼠2只, 分別在一側(cè)后肢股四頭肌注射低分子量透明質(zhì)酸(5 g/L) 1 mL, 另一側(cè)注射等量生理鹽水。另取ICR小鼠2只, 分別在一側(cè)后肢腳掌注射低分子量透明質(zhì)酸(5 g/L) 1 mL, 另一只注射等量生理鹽水。48 h后處死, 解剖觀察局部組織變化。(3)低分子量透明質(zhì)酸的過敏試驗(yàn): 取ICR小鼠10只, 雌雄各1半, 皮下注射50 g低分子量透明質(zhì)酸, 2周后再尾靜脈注射50 g低分子量透明質(zhì)酸, 立即觀察有無過敏反應(yīng)。1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析, 并進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)
9、, 如方差齊, 則進(jìn)行單因素方差分析; 而方差不齊則采用KruskalWallis H Test, P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果2.1 低分子量透明質(zhì)酸安全性 (1)低分子量透明質(zhì)酸的異常毒性試驗(yàn): 試驗(yàn)期內(nèi)所有動(dòng)物均未出現(xiàn)松毛、 縮團(tuán)、 發(fā)抖等異常反應(yīng); 進(jìn)食、 飲水、 糞便和精神等均正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有動(dòng)物均健在且質(zhì)量增加, 說明低分子量透明質(zhì)酸安全無毒。(2)低分子量透明質(zhì)酸的刺激性試驗(yàn): 在小鼠股四頭肌注射低分子量透明質(zhì)酸48 h后解剖觀察局部組織
10、無充血、 水腫及硬結(jié)等異常變化; 小鼠后掌注射48 h后解剖觀察局部也無異常變化。表明低分子量透明質(zhì)酸劑量為5 mg時(shí)安全無毒性。(3)低分子量透明質(zhì)酸的過敏反應(yīng): 小鼠在過敏試驗(yàn)中未出現(xiàn)蜷縮、 豎毛、 流淚、 噴嚏、 搔鼻、 抽搐、 痙攣、 呼吸困難、 水腫及休克等過敏反應(yīng)。2.2 不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫增強(qiáng)效應(yīng) 初免后4、 8、 12、 16周檢測抗HAV IgG水平, 結(jié)果顯示生理鹽水空白對照組檢測不到抗HAV IgG, 各實(shí)驗(yàn)組小鼠在4周內(nèi)均產(chǎn)生抗HAV IgG; 隨著時(shí)間推移呈上升趨勢, 到第8周達(dá)到抗體滴度的峰值, 此后逐漸下降; 但是不同劑量透明質(zhì)酸
11、免疫組的抗體水平仍然明顯高于HAV單獨(dú)抗原免疫組以及鋁佐劑組。不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫組在同一時(shí)間的抗體水平不同, HAVHA4、 HAVHA5和HAVHA6組在8周時(shí)產(chǎn)生的抗HAV IgG的水平較高, 分別為1(359.19±2.25)、 1(320±3.46)、 和1(285.09±3.10); 且HAVHA5和HAVHA6組的抗體水平能夠長時(shí)間維持在較高水平, 至16周時(shí)兩組的抗HAV IgG水平分別為1(160±1.55)和1(113.13±2.25), 而其他實(shí)驗(yàn)組抗HAV IgG水平均已明顯下降。提示低分子量透明質(zhì)酸的免疫增強(qiáng)效
12、應(yīng)在一定范圍內(nèi)可能與免疫劑量成量效依賴性。 各低分子量透明質(zhì)酸免疫組的免疫效應(yīng)與HAV抗原單獨(dú)免疫組的免疫效應(yīng)相比較, 結(jié)果顯示, 4周、 8周、 12周和16周時(shí)結(jié)果顯示不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗HAV IgG水平均明顯高于HAV抗原單獨(dú)免疫組, 在4周時(shí)HAVH6免疫組的抗HAV IgG水平最高, 為1(201.59±3.10), 約為HAV抗原單獨(dú)免疫組的7倍, 二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8周時(shí)HAVHA1組、 HAVHA4組、 HAVHA5組、 HAVHA6組與HAV抗原單獨(dú)免疫組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05, 圖1)。至12周和16
13、周時(shí), 所有劑量的低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗HAV IgG水平與HAV抗原單獨(dú)免疫組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05, 圖1)。這些結(jié)果表明, 低分子量透明質(zhì)酸能夠增強(qiáng)HAV抗原的特異性體液免疫應(yīng)答, 具有免疫佐劑效應(yīng)。 各低分子量透明質(zhì)酸免疫組的免疫效應(yīng)與鋁佐劑組的免疫效應(yīng)相比較, 結(jié)果顯示, 除HAVH3免疫組的抗HAV IgG水平在4周時(shí)低于鋁佐劑免疫組以外, 其他各低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗HAV IgG水平在4、 8、 12和16周時(shí)均要明顯高于鋁佐劑組。雖然在4周和8周時(shí)各低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗體水平明顯高于鋁佐劑免疫組, 但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在12周時(shí)結(jié)果顯
14、示, HAVHA1組、 HAVHA4組、 HAVHA5組和HAVHA6組與鋁佐劑組的抗HAV IgG水平相比, 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05, 圖1); 而HAVHA2免疫組、 HAVHA3免疫組的抗HAV IgG水平與鋁佐劑組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至16周時(shí), HAVHA2組、 HAVHA3組和HAVHA5組與鋁佐劑組的抗HAV IgG水平相比, 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); 而其余低分子量透明質(zhì)酸免疫組的抗HAV IgG水平與鋁佐劑組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明低分子量透明質(zhì)酸不僅具有免疫佐劑作用, 增強(qiáng)特異性的抗HAV IgG水平, 而且其佐劑效應(yīng)在一定劑量范圍內(nèi)和一定時(shí)間內(nèi)優(yōu)于鋁佐劑。圖1
15、160; 不同時(shí)間小鼠血清抗HAV IgG水平(略)aP0.05與HAV組; cP0.05與HAVAL組.3 討論 目前鋁佐劑是惟一批準(zhǔn)應(yīng)用于人的疫苗佐劑, 但是鋁佐劑存在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答, 而細(xì)胞免疫很弱, 與IgE型過敏性疾病有關(guān)等弊端等。理想疫苗佐劑應(yīng)該是既能增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答, 又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答, 且無毒副作用1。因此, 研究開發(fā)新型疫苗佐劑, 以替代鋁佐劑成為疫苗佐劑的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn), 細(xì)胞損傷釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子具有刺激樹突狀細(xì)胞成熟, 增加共刺激分子如CD86和CD83等的表達(dá), 促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌; 介導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用4, 5
16、。提示內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子可能作為有效的內(nèi)源性免疫佐劑, 增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞對外來抗原的免疫應(yīng)答。 為了探討內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子低分子量透明質(zhì)酸作為疫苗佐劑的可行性, 本研究中采用滅活HAV抗原和低分子量透明質(zhì)酸進(jìn)行不同劑量配比, 通過免疫小鼠觀察了抗HAV IgG水平的變化, 并對低分子量透明質(zhì)酸作為佐劑與鋁佐劑的效應(yīng)比較進(jìn)行了初步探討。研究證實(shí), 低分子量透明質(zhì)酸聯(lián)合滅活HAV抗原進(jìn)行免疫, 有效地誘導(dǎo)了抗HAV IgG的產(chǎn)生。與單獨(dú)滅活HAV抗原組相比, 不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫組其產(chǎn)生的特異性抗體水平均明顯高于HAV抗原單獨(dú)免疫組, 其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05
17、), 提示低分子量透明質(zhì)酸具有免疫佐劑效應(yīng); 與鋁佐劑組相比, 不同劑量的低分子量透明質(zhì)酸免疫組其誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫增強(qiáng)效應(yīng)在不同時(shí)期顯示優(yōu)于鋁佐劑或與鋁佐劑相當(dāng); 且本研究結(jié)果還提示在一定范圍內(nèi)隨著低分子量透明質(zhì)酸的劑量的增加, 抗HAV IgG的水平逐漸增高, 即其抗HAV IgG水平與低分子量透明質(zhì)酸在一定范圍內(nèi)可能呈量效依賴性。低分子量透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)成分, 屬于內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子, 具有無毒安全性高、 結(jié)構(gòu)明確、 易于生產(chǎn)和價(jià)格便宜等特點(diǎn), 符合理想疫苗佐劑的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了低分子量透明質(zhì)酸安全無毒。 綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)以低分子量透明質(zhì)酸作為新型疫苗佐劑,能夠有效地增強(qiáng)滅活HAV抗原的體液免疫應(yīng)答, 而且不同劑量低分子量透明質(zhì)酸免疫增強(qiáng)效應(yīng)顯示相當(dāng)于或優(yōu)于鋁佐劑, 且低分子量透明質(zhì)酸的免疫增強(qiáng)作用持續(xù)時(shí)間要長于鋁佐劑。因此, 通過本研究提示, 低分子量透明質(zhì)酸可以作為一種潛在的新型人用疫苗佐劑。同時(shí), 隨著許多重大疾病如HBV、 HIV、 腫瘤等嚴(yán)重危害著人類的健康, 開發(fā)新型治療性疫苗迫在眉睫, 而尋找一種佐劑能夠協(xié)同疫苗抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL免疫效應(yīng), 達(dá)到治療疾病的作用是一種非常有潛力的策略。因此, 我們下一步的工作將進(jìn)一步研究低分子量透明質(zhì)酸是否能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的CTL免疫反應(yīng)?!緟⒖?/p>
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