TGF-β和BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠BMSC向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究

1、TGF-和BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠BMSC向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究         11-03-30 15:04:00     編輯：studa20               作者：梅晰凡，呂剛，王巖松，李全雙，郭占鵬【摘要】  目的 探討轉(zhuǎn)化因子(TGF-)和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成神經(jīng)細(xì)胞

2、的可能性，為神經(jīng)再生及脊髓損傷的治療提供一種新方法。方法 從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞并傳至第5代，誘導(dǎo)前2 h先用含1 g/L轉(zhuǎn)化因子（TGF-）及20%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，以促進(jìn)細(xì)胞分裂，然后用腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)作誘導(dǎo)劑，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)NF，NSE，GFAP等特異性標(biāo)志物。結(jié)果 誘導(dǎo)后5 h，部分細(xì)胞的形態(tài)已發(fā)生改變，12 h后大部分細(xì)胞不僅在形態(tài)上表現(xiàn)為神經(jīng)元樣特征，而目NF及NSE等特異性抗體呈陽性表達(dá)，而GFAP抗體表達(dá)呈陰性。結(jié)論 轉(zhuǎn)化因子(TGF-)和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)能將骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣

3、細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】  骨髓基質(zhì)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化因子；腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子；細(xì)胞分化；神經(jīng)元樣細(xì)胞    Abstract：Objective  To study the possibility that transforming growth factor- and brain-derived neurotrophic factor induces adult rat bone marrow stromal cells(BMSCs) into neurons, and provide a new method for neuron regenerati

4、on and the treatment of spine cord injury. Methods  The bone marrow stromal cells from adult rats were isolated and cultured for 5 passages. The BMSCs were incubated with DMEM containing 20% FRS and TGF-(1g/L )for 2 hours. Then the media were replaced by DMEM media consisting of BDNF(50g/mL). T

5、he morphological changes of the cells were observed under phase contrast microscope，the cells were stained immunocytochemically with NF，NSE and GFAP antibodies respectively. Results  After 5 hour of induction with neurotrophic factor, some cells showed morphological changes, and 12 hours later,

6、many BMSCs became neuron-like cells and were stained positively with NF，NSE antibody，but negatively with GFAP.Conclusions  The bone marrow stromal cells can differentiate into neuronlike cells by the induction of transforming growth factor-and brain-derived neurotrophic factor.   

7、; Key words：bone marrow stromal cells；transforming growth factor-；brain-derived neurotrophic factor；cell differentiation induction；neuron-like cells    近年來的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后采用組織工程方法，將有活性的種子細(xì)胞移植治療脊髓損傷，能促使損傷軸突修復(fù)、再生和恢復(fù)脊髓部分神經(jīng)功能，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSC）可為基因治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病提供良好的載體1。骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的研究也見報(bào)道，為

8、了探討轉(zhuǎn)化因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞聯(lián)合誘導(dǎo)分化的可能性和條件，為以后神經(jīng)細(xì)胞再生和脊髓內(nèi)移植的研究奠定基礎(chǔ)23，本研究觀察了轉(zhuǎn)化因子（transforming growth factor-，TGF-）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( brain-derived neurotrophic factor, BDNF)對(duì)成年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，現(xiàn)報(bào)告如下。    1  材料與方法    1.1  主要試劑和儀器    TGF-和BDNF購自Sigma公司，小鼠抗特異

9、性神經(jīng)元烯醇化酶( NSE)單抗，小鼠抗神經(jīng)絲蛋白(NF)單抗，小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單抗購自華美公司, FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自 Gibco公司，SABC試劑盒購自武漢博士德公司。主要儀器：Olympus CK40倒置顯微鏡，Olympus BX51熒光顯微鏡。SD大鼠由錦州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。    1.2  骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離及培養(yǎng)    梅晰凡，等：TGF-和BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠BMSC向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)  2008年10月，29(5)SD大鼠雌雄不限，130 g

10、左右，將其拉頸處死，75%酒精浸泡10 min，無菌條件下取出股骨，除去骨周圍的肌肉組織，剪開骨兩端，顯露骨髓腔，用10 mL注射器，以IMDM培養(yǎng)液從一端沖洗骨髓腔，將骨髓沖到平皿中，用吸管反復(fù)吹打含有骨髓的沖洗液使其成為單細(xì)胞懸液，后用150目尼龍網(wǎng)過濾，濾液常溫下1000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀內(nèi)加入紅細(xì)胞裂解液(每只鼠骨髓內(nèi)加入1 mL)置常溫下2 min，后加入IMDM培養(yǎng)液10 mL，吹散后1000 rpm離心10 min，棄上清后向沉淀內(nèi)加入IMDM含10%FBS培養(yǎng)液10 mL，吹散后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋后按8 000個(gè)細(xì)胞cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，于37 5C

11、O2及飽和濕度下培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，分別于培養(yǎng)的第4、10、17天半量更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞4，第20 天以0.25胰蛋白酶消化傳代得到骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)置經(jīng)多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）防脫片處理的蓋玻片。    1.3  轉(zhuǎn)化因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合誘導(dǎo)鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞    上述細(xì)胞傳代至第5代后繼續(xù)培養(yǎng)，加入含1 g/L轉(zhuǎn)化因子（TGF-）預(yù)誘導(dǎo)2 h，然后用含50 g/mL腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF）的IMDM念20%FBS培養(yǎng)基地37 5%CO2及包和濕度下培養(yǎng)

12、骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行分化誘導(dǎo)；以單純IMDM含20%FBS培養(yǎng)基同等條件培養(yǎng)作對(duì)照1；并以含1 g/L TGF-的IMDM含20%FBS培養(yǎng)基同等條件培養(yǎng)作對(duì)照2；并以含50 g/mL BDNF的IMDM含20%FBS培養(yǎng)基同等條件培養(yǎng)作對(duì)照3。相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)3天后，吸棄培養(yǎng)液，0.01 M PBS沖洗3次，4 丙酮固定-70 保存?zhèn)涿庖呒?xì)胞化學(xué)染色。    1.4  轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定和轉(zhuǎn)化率的測(cè)定    吸棄培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液；純丙酮室溫固定2030 min，蒸餾水洗，干燥后可冰凍保存；冰凍切片從冰箱內(nèi)取出

13、，恢復(fù)至室溫，PBS沖洗3 次；純甲醇加H2O2至0.5%，室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3 次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；滴加適當(dāng)稀釋的一抗（小鼠IgG），其中小鼠抗大鼠NSE(-)抗體稀釋度為1100，小鼠抗大鼠NF抗體稀釋度為1200，對(duì)照實(shí)驗(yàn)以0.01 M PBS液代替抗體，37 3060 min或20 60120 min，也可4 過夜；0.01 M PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，2037 20 min。0.01 M PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，203720 min

14、。0.01 M PBS洗5 min×4次，DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒（ED1022），取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在530 min之間，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，逐級(jí)脫水，透明，封片。光鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)目。    2  結(jié)    果    2.1  大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況    剛接種時(shí)細(xì)胞種類較多，包括造血干細(xì)胞及分化程度不同的其它各系血細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等，散在懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)。培養(yǎng)12天后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞開始貼壁，經(jīng)過數(shù)次換液后，未貼壁的細(xì)胞逐步被清除，培養(yǎng)10 天時(shí)，細(xì)胞以造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞為主5；培養(yǎng)20 天后，大多數(shù)造血干細(xì)胞死亡，剩下的主要是骨髓基質(zhì)細(xì)胞。典型的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)是：型細(xì)胞較少，梭形，70 m×8 m大小，胞核20 m×5 m大?。恍图?xì)胞為主要類型，形態(tài)差異較大，胞體大而扁平，3050 m大小，有突起，胞核圓形，直徑1520 m，立體感不強(qiáng)，胞漿淡染。同時(shí)，混有少量造血干細(xì)胞。