體外非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肺泡上皮細(xì)胞的分化

1、體外非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肺泡上皮細(xì)胞的分化         11-01-06 16:19:00     編輯：studa20                   作者：王艷，楊志軍，何璽玉，封志純【摘要】  目的 建立體外非接觸共培養(yǎng)模型，誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)

2、向肺泡上皮細(xì)胞的分化。方法 分三組，每組6例。對照組：小鼠MSCs單獨培養(yǎng)組；實驗組A：正常肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs；實驗組B：損傷肺組織單細(xì)胞懸液+MSCs。共同培養(yǎng)8d，激光共聚焦和RT-PCR檢測共培養(yǎng)體系下室中的SP-C和AQP5的表達(dá)情況。結(jié)果 對照組和實驗組A都只檢測到AQP5；而實驗組B可同時檢測到AQP5和SP-C。實驗組B的AQP5 mRNA的表達(dá)量較對照組明顯增多(P<0.01)，而與實驗組A比較，其AQP5 mRNA的表達(dá)量也有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。但是，實驗組A與對照組比較則無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 本實驗室成功建立了體外非接觸誘

3、導(dǎo)小鼠MSCs分化為肺泡上皮細(xì)胞的實驗?zāi)Ｐ汀?【關(guān)鍵詞】  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肺泡上皮細(xì)胞；激光共聚焦           ChinaABSTRACT: Objective  To establish the co-culture model in vitro and induce bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) to differentiate into lung alveolar epithelial cells. Me

4、thods  Each group had 6 samples, control group was MSCs alone; Group A was the MSCs cultured with the cells from normal lung; and Group B was the MSCs with the cells from injuried lung. Each group was cultured for 8 days and the two markers of lung alveolar epithelial cells including AQP5 and S

5、P-C were tested by laser confocal microscopy and RT-PCR. Results  Only AQP5 was detected in the control group and Group A, both AQP5 and SP-C were detected in Group B, the AQP5 mRNA expression in Group B was significantly increased compared with that in the control group(P<0.01). The AQP5 mR

6、NA expression in Group B was also significantly increased compared with that in Group A (P<0.01). But there was no significant difference in AQP5 mRNA expression between Group A and control group. Conclusion  We have successfully established the co-culture model in vitro to induce bone marro

7、w mesenchymal stem cells to differentiate into lung epithelial cells.KEY WORDS: mesenchymal stem cells; lung alveolar epithelial cell; laser confocal microscopy骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種具有多分化潛能的干細(xì)胞，在不同的培養(yǎng)條件下可分化為一系列的細(xì)胞類型。肺損傷體內(nèi)實驗研究表明，肺損傷小鼠移植MSCs后，MSCs可轉(zhuǎn)化為肺泡型(type alveolar epithelial cel

8、l, AEC)和型上皮細(xì)胞(type alveolar epithelial cell, AECI)等，以修復(fù)損傷肺組織1。ROJAS等2研究發(fā)現(xiàn)，在體外損傷肺組織分泌的因子可以誘導(dǎo)MSCs增殖并向損傷肺遷移，而正常肺組織細(xì)胞并沒有此功能。POPOV等3采用MSCs與肺上皮細(xì)胞(A549)非接觸共同培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)MSCs向肺上皮細(xì)胞分化。本研究采用MSCs與肺組織單細(xì)胞懸液非接觸共培養(yǎng)模型，觀察能否在體外利用損傷肺組織誘導(dǎo)MSCs向肺泡上皮細(xì)胞分化,為進(jìn)一步研究骨髓源性的間充質(zhì)干細(xì)胞治療肺損傷奠定基礎(chǔ)。1  材料與方法1.1  材料 出生4周的健康昆明小鼠，體重為

9、10.011.5g，共25只，均為雄性(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)。DMEM完全培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(GIBCO公司，美國)，胰蛋白酶(Sigma公司，美國)。Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)，RT-PCR試劑盒(QIAGEN，德國)。 倒置顯微鏡(TE2000, Nikon公司，日本)，高分辨率成像系統(tǒng)(DXM1200C，尼康，日本)，激光共聚焦顯微鏡(C1-SHS，尼康公司，日本)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(SKP-02B，湖北省黃石市恒豐醫(yī)療公司)，24孔板(Hanging Cell Culture Insert PET 0.4m，MILLPORE公司，德國)。1.2

10、60; 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的體外分離、擴(kuò)增和鑒定 小鼠頸椎脫臼處死后，放入750mL/L的酒精內(nèi)浸泡5min。無菌條件下取出雙側(cè)股骨，去除附帶組織，兩端剪斷暴露骨髓腔。用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液及1號針頭反復(fù)沖洗，將骨髓腔內(nèi)的骨髓沖出，并用1號針頭反復(fù)抽吸，制成單細(xì)胞懸液，充分混勻，轉(zhuǎn)入離心管，1500r/min離心5min棄上清及脂肪層，沉淀用DMEM培養(yǎng)液充分混勻，用吸管輕輕疊加到密度為1.077g/mL的Ficoll-Paque分離液上，2500r/min離心10min，取界面層的單核細(xì)胞，再用DMEM培養(yǎng)液多次洗滌，離心后備用。細(xì)胞沉淀以5

11、15;105個/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶，加入DMEM完全培養(yǎng)液置于37，50mL/L CO2，80%相對濕度的培養(yǎng)箱中，2d后全量換液，去除未貼壁的細(xì)胞，以后每隔3d換液1次，倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞的形態(tài)，貼壁情況及生長情況。待細(xì)胞融合達(dá)80%，胰酶37消化，進(jìn)行傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)。取培養(yǎng)第2代的細(xì)胞用PBS洗滌3次，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液移入離心管，1500r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀PBS洗滌3次，分別加入熒光標(biāo)記的抗體，4孵育30min，PBS洗去未標(biāo)記抗體，10g/L多聚甲醛固定，應(yīng)用FACScan流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)。1.3  建立體外非接觸

12、共培養(yǎng)實驗?zāi)Ｐ?#160;參照本實驗室的方法建立小鼠肺損傷模型4，并參照POPOV等3方法建立體外非接觸共培養(yǎng)實驗?zāi)Ｐ停瑢嶒災(zāi)Ｐ蛨D見圖1。無菌條件下分離提取無肺損傷肺組織(共25只小鼠)、肺損傷模型肺組織(共25只小鼠)。制備肺組織單細(xì)胞懸液。將約5×104個/mL的小鼠肺細(xì)胞接種于0.4m孔徑(Millpore)大小的膜上(懸掛式體外共培養(yǎng)小室)，并放入24孔板中，在24孔板的底部同時放上適當(dāng)大小的載玻片，并接種約5×104個/mL小鼠骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。共設(shè)計三組，每組6孔：對照組：MSCs單獨靜置培養(yǎng)；實驗組A： 正常健康肺組織單細(xì)胞懸液(上室)+MSC

13、s(下室)；實驗組B：損傷組肺組織單細(xì)胞懸液(上室)+MSCs(下室)細(xì)胞。共同培養(yǎng)8d，每日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，貼壁情況及生長情況。1.4  激光共聚焦顯微鏡檢測表面蛋白C(surfatcant protein C, SP-)和水通道蛋白5(aquaporin protein 5, AQP-5)的熒光表達(dá) 在共培養(yǎng)的第8天，根據(jù)以下步驟處理細(xì)胞標(biāo)本：將共培養(yǎng)中接種有MSCs的載玻片取出，40g/L的多聚甲醛固定10min，0.01mol/L PBS漂洗35次；在同一培養(yǎng)皿中分別加入PBS稀釋抗-SP-C(1100)一抗和抗-AQP5(1100)，濕盒內(nèi)4孵育24

14、h，0.01mol/L PBS漂洗3次；加入FITC標(biāo)記和TRITC標(biāo)記的抗兔IgG(1100)，37孵育2h，0.01mol/L PBS漂洗3次；0.01mol/L PBS充分洗滌后加入終濃度為10mg/L Hoechst 33342約1mL，室溫孵育20min；以抗體稀釋液代替單克隆抗體作為陰性對照試驗。0.01mol/L PBS充分洗滌后用VECTASHIELD Mounting Medium封片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察SP-C、AQP5的熒光表達(dá)情況。1.5  RT-PCR 檢測非接觸共培養(yǎng)體系模型下室中的SP-C和AQP5 mRNA1.5.1  總RNA的提取&

15、#160;RNA抽提試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，具體操作按照試劑盒說明書。1.5.2  cDNA第一鏈合成反應(yīng) 20L反應(yīng)體積中含2L 10×PCR buffer、2L 2mmol/L dNTP、4L 25mmol/L MgCl2、0.5L RNase抑制劑、2L RNA模板、1L oligo dT引物、7.5L無RNase水，反應(yīng)條件為：50 30min，99 5min，5 5min。1.5.3  PCR擴(kuò)增反應(yīng) 通過對AQP-5和SPC基因組DNA序列分析，用計算機(jī)輔助生物軟件Primer 5.0(Applied Biosystem, I

16、nc.Co.)設(shè)計了兩對引物，AQP-5:Forward(5-3)：TGTCGTCGTGGTGATTGTA；Reverse(5-3)：ACTGTGCCCTTCTTCCTG。預(yù)計擴(kuò)增片段長為355bp；SPC：Forward(5-3)：GAGCCAGTTTCGCATTCC；Reverse(5-3)：CAGGTCTCGCCCAGAAGA。預(yù)計擴(kuò)增片段長為463bp。引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系包括：每種dNTP 250mol/L，MgCl2 2.5mol/L，10×PCR緩沖液5L，Taq酶5u，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3L，引物0.1mol/L/條，終反應(yīng)體系50L。PCR反應(yīng)在PX-2型PC

17、R儀上進(jìn)行，AQP-5循環(huán)條件為：95 10min；94 60s，48 90s，72 60s，35個循環(huán)；72 10min。SPC循環(huán)條件為：95 10min；94 60s，50 90s，72 60s，35個循環(huán)，72 10min。取5L產(chǎn)物經(jīng)12g/L瓊脂糖電泳，鑒定產(chǎn)物的特異性。最后將所獲得的PCR產(chǎn)物利用GeneTools(SynGene公司，版本：3.07)進(jìn)行產(chǎn)物量的測定(豐度圖結(jié)果未顯示)。1.6  統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果均數(shù)之間比較采用General Lin

18、eral Model(GLM)模型進(jìn)行析因多因素方差分析，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。     11-01-06 16:19:00     編輯：studa202  結(jié) 果2.1  小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、純化、擴(kuò)增和鑒定 骨髓單核細(xì)胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底散在分布，呈圓形，48h后完全換液，去除未貼壁的血細(xì)胞。此時貼壁的細(xì)胞為單個或幾個細(xì)胞的克隆，細(xì)胞形態(tài)均一，為長梭形。培養(yǎng)至1012d，細(xì)胞接近融合，每個克隆約數(shù)百至數(shù)千個細(xì)胞，集落之間細(xì)胞出現(xiàn)重疊，

19、細(xì)胞形態(tài)均一，隨著培養(yǎng)時間的延長，旋渦中心的細(xì)胞可形成多細(xì)胞層，細(xì)胞界限不清，黏附于貼壁細(xì)胞之上的雜細(xì)胞在換液的過程中逐漸被清除。傳代后的MSCs增殖生長仍然迅速，生長潛伏期較短，710d即達(dá)到完全融合(圖2)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示二代細(xì)胞均一性在95%以上，CD34、CD45表達(dá)為陰性，證明這一類細(xì)胞為非造血類細(xì)胞。CD105、CD106表達(dá)陽性(圖3)。2.2  激光共聚焦顯微鏡檢測SP-C和AQP5的熒光表達(dá) 于共培養(yǎng)的第8天處理標(biāo)本，然后用激光共聚焦觀察各處理組共培養(yǎng)下室中的免疫熒光表達(dá)情況。對照組只檢測到MSCs的藍(lán)色熒光和AQP5的紅色熒光(圖4A)。實驗組A也只

20、檢測到MSCs的藍(lán)色熒光和AQP5的紅色熒光(圖4B)。實驗組B可同時檢測到MSCs的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，以及綠色的SP-C的熒光(圖4C、圖4D)。2.3  共培養(yǎng)體系下室中的SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況2.3.1  對照組SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況 對照組于第1、5、8天檢測AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)情況。在共培養(yǎng)開始第1天，可檢測到AQP5的mRNA表達(dá)，但AQP5的表達(dá)比較弱，不同時間段差異不明顯，而在不同時間段SP-C都沒有表達(dá)(圖5)。2.3.2  實驗組A SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況

21、60;實驗組A所檢測到的SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況與對照組觀察結(jié)果相似(圖6)。2.3.3  實驗組B不同時間段SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況 實驗組B在共培養(yǎng)的各時間段可同時檢測到AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)(圖7，圖8)。2.3.4  不同實驗處理組中AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)量的比較 對照組和實驗組A各時間點均未見SP-C mRNA的表達(dá)，而在實驗組B于共培養(yǎng)的第1、5、8天的SP-C mRNA的表達(dá)量分別為1599.00±158.95、2066.80±101.30、3893.00±1

22、78.60。不同處理組的AQP5 mRNA的表達(dá)量見表1。實驗組B各時間點AQP5 mRNA的表達(dá)量與對照組比較，AQP5 mRNA的表達(dá)量明顯增多(F=78.61，P<0.01)，而與實驗組A的AQP5 mRNA的表達(dá)量比較，也有統(tǒng)計學(xué)差異(F=67.38，P<0.01)。但是，實驗組A各時間點則與對照組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(F=1.45，P>0.05)。表1  不同處理組AQP5mRNA的表達(dá)量的比較（略）3  討 論    AEC具有分泌肺泡表面活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)肺泡表面張力、維持肺液體平衡和多種防御功能，不僅可以修復(fù)肺泡的

23、正常結(jié)構(gòu)，更可以有效地恢復(fù)功能，從而阻止和修復(fù)肺損傷5。因此，體外或者體內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為AEC一直是肺損傷修復(fù)的一個研究熱點。研究表明，SP-C是AECII細(xì)胞表達(dá)的特征性蛋白，AEC細(xì)胞可能是AECI的祖細(xì)胞，當(dāng)AEC可以轉(zhuǎn)化為AECI后，獲得AECI的表型特征AQP5，同時失去AEC的表型標(biāo)志SP-C6。因此，本實驗選用SP-C和AQP5兩個特異性蛋白來鑒定干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肺泡上皮細(xì)胞的效果。    本實驗建立的懸掛式體外非接觸共培養(yǎng)小室，當(dāng)MSCs單獨靜置培養(yǎng)時，或者與正常肺組織單細(xì)胞懸液共同培養(yǎng)時，在共培養(yǎng)的全部時段，都未檢測到AEC表達(dá)的特征性蛋白SP

24、-C的表達(dá)，說明干細(xì)胞都沒有轉(zhuǎn)換為AEC或者轉(zhuǎn)化為AEC細(xì)胞的數(shù)量非常少。該兩種情況下都有AQP5的表達(dá)。而且，AQP5的表達(dá)量也沒有變化。KOTTON7及其同事的研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的MSCs可表達(dá)AECI的特異性標(biāo)記物AQP5，這種細(xì)胞亞型可能是肌細(xì)胞、骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞。推測所檢測到的AQP5表達(dá)是MSCs自身表達(dá)的結(jié)果，MSCs沒有向AECI分化。而損傷肺組織與MSCs共培養(yǎng)時，不但有SP-C的表達(dá)，而且隨著時間的延長，表達(dá)量逐漸增加，說明MSCs成功轉(zhuǎn)換為AEC；同時，AQP5表達(dá)量明顯高于實驗組A和對照組。我們推斷AQP5表達(dá)量增加部分是由AEC細(xì)胞轉(zhuǎn)化為AECI細(xì)胞引起的

25、或是MSCs直接分化為AECI。這與文獻(xiàn)報道的用博來霉素導(dǎo)致小鼠肺損傷時，靜脈注射外源性的MSCs，在受體小鼠肺中，比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前，MSCs總的DNA的含量升高23倍，同時AEC的含量升高3倍的研究結(jié)果一致8。    骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在不同的環(huán)境、不同的培養(yǎng)液中可以分化為多種細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等9。一種理論認(rèn)為組織及器官損傷可以被干細(xì)胞感知，遷移到損傷部位并分化為器官特異的細(xì)胞，以修復(fù)損傷器官的結(jié)構(gòu)和功能10。本研究通過非接觸共培養(yǎng)，采用聚碳酸脂膜將損傷肺組織與干細(xì)胞分開，使損傷肺組織細(xì)胞不能通過，而細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以自由通過，成功建立了體外非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肺泡上皮細(xì)胞的模型，驗證了該理論的正確性。研究報道，之所以損傷細(xì)胞能夠誘導(dǎo)MSCs分化為損傷特異性的細(xì)胞，可能是因為損傷細(xì)胞分泌的特殊的細(xì)胞因子刺激MSCs或者是損傷細(xì)胞激活某個信號傳導(dǎo)2。本研究中MSCs分化為肺泡上皮細(xì)胞的具