熒光分析法(2010)課件

1、實驗實驗5 熒光光度法測定熒光光度法測定維生素維生素B2含量含量光光譜譜分分析析原原子子光光譜譜（略略）分分子子光光譜譜分分子子吸吸收收U UV V- -V Vi is s（紫紫外外- -可可見見）I IR R（紅紅外外）分分子子發(fā)發(fā)光光光光致致發(fā)發(fā)光光其其它它發(fā)發(fā)光光形形式式如如：化化學(xué)學(xué)發(fā)發(fā)光光等等熒熒光光、磷磷光光(對光的吸收對光的吸收)21V=0321V=021V=0S0S1S2T1發(fā)生激發(fā)發(fā)生激發(fā)態(tài)反應(yīng)態(tài)反應(yīng)分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過程分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過程21V=0A1A2VRFiciscPVR激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉(zhuǎn)激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉(zhuǎn) 化的形式和速率：化的形式和速率：A1,A2 吸收吸收

2、: 10-15 sVR 振動松弛：振動松弛： 10-12 sic 內(nèi)轉(zhuǎn)化：內(nèi)轉(zhuǎn)化： 10-11 sisc 系間竄越：系間竄越： 10-6 10-2 sF 熒光：熒光： 10-9 10-6 sP 磷光：磷光： 10-6 100 s2503003504004505005506000200400600800 Ex.Wavelength (nm)Relative Fluorescence Intensity激發(fā)光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜發(fā)射光譜任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜(Excitation)和發(fā)射光(Emission)譜。組成、結(jié)構(gòu)與衍化信息組成、結(jié)構(gòu)與衍化信息 物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的化

3、學(xué)結(jié)構(gòu) 環(huán)境與介質(zhì)條件環(huán)境與介質(zhì)條件 與其它溶質(zhì)的相互作用與其它溶質(zhì)的相互作用 反應(yīng)動力學(xué)反應(yīng)動力學(xué)l 任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。l激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長l發(fā)射光譜發(fā)射光譜：固定激發(fā)波長固定激發(fā)波長 掃描發(fā)射波長掃描發(fā)射波長l激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關(guān)系200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003

4、600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004

5、008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550

6、 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 2

7、00 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IF 55056057058059060061062006001200180024003000360042004800C Fluorescence IntensityWavelength(nm)（注意：注意：在一定濃度范圍內(nèi)適用）在一定濃度范圍內(nèi)適用）激發(fā)分子總數(shù)激發(fā)分子總數(shù)發(fā)射熒光的分子數(shù)發(fā)射熒光的分子數(shù) F IF=2.30kF I0bcIF=KC?問題：問題：1 1）影響相對熒光強

8、度的因素有哪些？）影響相對熒光強度的因素有哪些？2 2）試比較熒光法與紫外）試比較熒光法與紫外- -可見分光光度法的分可見分光光度法的分析性能。析性能。？問題問題：熒光光度計與紫外熒光光度計與紫外- -可見分光光度計在光路設(shè)置可見分光光度計在光路設(shè)置 上有什么不同？為什么？上有什么不同？為什么？紫外紫外-可見分光光度計可見分光光度計測量池測量池(吸收池吸收池)I0ItI0ItIF,pl 常規(guī)分析應(yīng)用：常規(guī)分析應(yīng)用：l 定性分析：定性分析：f；ex；em；峰形等；峰形等 l 定量檢測：定量檢測： F = KI0fC l 其它（略）其它（略）l 高端生化研究：高端生化研究：l 分子相互作用研究；分

9、子相互作用研究； l 代謝動力學(xué)跟蹤；代謝動力學(xué)跟蹤；l 顯微成像（物理遷移與化學(xué)衍化的原位顯微成像（物理遷移與化學(xué)衍化的原位“顯跡顯跡”）維生素維生素B2含量的熒光光度法測定含量的熒光光度法測定l標(biāo)準(zhǔn)曲線法l 將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)過和樣品同樣處理后，配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測其熒光強度，以熒光強度對熒光物質(zhì)含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定樣品溶液的熒光強度后即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品溶液中熒光物質(zhì)的含量。實驗原理l維生素維生素B2的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)結(jié)構(gòu)C17H20N4O6l 在近中性的水溶液中有較強的熒光發(fā)射在近中性的水溶液中有較強的熒光發(fā)射: （535nm 附近）附近） l在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定且熒光消失（在堿性

10、介質(zhì)中不穩(wěn)定且熒光消失（pH=11）l易發(fā)生光降解，對熱穩(wěn)定易發(fā)生光降解，對熱穩(wěn)定實驗步驟l、試液配制：配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、試液配制：配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液取取VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液(5ug/ml) 1.00ml,2.00ml ,3.00ml,4.00ml,5.00ml于于25ml比色管中比色管中,稀釋至刻度稀釋至刻度.l2、樣品藥片的處理及未知液的配制、樣品藥片的處理及未知液的配制 取取2片藥片置于洗凈的小燒杯中片藥片置于洗凈的小燒杯中,加加20-30ml去離子水中去離子水中,水浴中加熱水浴中加熱30min,冷至室溫后冷至室溫后,轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到250ml容量瓶中容量瓶中,稀釋至刻度稀釋至刻度.過濾過濾

11、,棄取初濾棄取初濾液液,取取0.5ml到到25ml比色管中比色管中,稀釋至刻度稀釋至刻度.l3、VB2的熒光光譜的繪制的熒光光譜的繪制掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長,找出最大激發(fā)波長和發(fā)射波長找出最大激發(fā)波長和發(fā)射波長.l4、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作及樣品測定、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作及樣品測定固定激發(fā)波長和發(fā)射波長固定激發(fā)波長和發(fā)射波長,測定每管標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的熒光強度測定每管標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的熒光強度.試液的移取與稀釋試液的移取與稀釋系列標(biāo)液的測定順序系列標(biāo)液的測定順序即放即測，防光降解即放即測，防光降解熒光儀的開關(guān)機(jī)順序熒光儀的開關(guān)機(jī)順序從熒光光譜圖上讀出最大激發(fā)（從熒光光譜圖上讀出最大

12、激發(fā)（ex）和發(fā)射波長（）和發(fā)射波長（ em）用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法算出所配實測試液的濃度用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法算出所配實測試液的濃度計算藥片中維生素計算藥片中維生素B2的含量，的含量， 并計算測定量占并計算測定量占 標(biāo)示量標(biāo)示量 的百分?jǐn)?shù)的百分?jǐn)?shù)日立日立F-2500型熒光光度計的使用型熒光光度計的使用“波長掃描波長掃描”操作步驟操作步驟 Start Method setting Sample name Pre-scan Measurement Data processing Print End Method 鍵的使用General Measurement Wavelength scanOperator

13、姓名(1)Instrument Scan mode Excitation (做激發(fā))Data mode FluorescenceEM WL 523nmEX Start WL 300nmEX End WL 500nmScan speed 3000nm/minEX Slit 5.0nmEM Slit 5.0nmPMT Voltage 700V(2)Instrument Scan mode Emission (做發(fā)射)Data mode FluorescencEX WL 354nmEM Start WL 360nmEM End WL 700nmScan speed 3000nm/minEX Slit

14、 5.0nmEM Slit 5.0nmPMT Voltage 700VSamples 輸入樣品數(shù)輸入樣品數(shù) Updata okPre-scan 按Pre-scan 鍵Measurement按Measurement 鍵YesokData processing顯示最大強度值 Print 打印波長掃描圖“定量分析定量分析”操作步驟操作步驟lMethod 鍵的使用 Start Method setting Sample name Measurement Print End General save as存放文件地址 MeasurementPhotometry Operator姓名Quantitation Quantitation type WavelengthCalibration type 1st orderInstrument D