微生物染色液配制及染色法.

1、微生物染色液配制及染色法2.1 美藍(lán)染色法 2.1.1 呂氏堿性美藍(lán)染色液美藍(lán) 0.3g95% 乙醇 30mL0.01% 氫氧化鉀溶液 100mL 將美藍(lán)溶解于乙醇中，然后與氫氧化鉀溶液混合。 2.1.2 染色法將涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液， 染13min，水洗，待干，鏡檢。2.1.3結(jié)果菌體呈藍(lán)色。2.2革蘭氏染色法2.2.1結(jié)晶紫染色液結(jié)晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液 80mL將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。2.2.2革蘭氏碘液碘1g碘化鉀2g蒸餾水300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL 。 2.2.3

2、 沙黃復(fù)染液 沙黃0.25g95% 乙醇 10mL 蒸餾水 90mL 將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。 2.2.4 染色法 2.2.4.1 將涂 片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。2.2.4.2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。2.2.4.3滴加95%乙醇脫色，約30s ；或?qū)⒁掖嫉螡M(mǎn)整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿(mǎn)整個(gè)涂片，脫色10s。224.4 水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染 1min 。水洗，待干，鏡檢。 2.2.5 結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。革蘭氏陰性菌呈紅 色。注：亦可用 1 ：10 稀釋石炭酸復(fù)紅染色液作復(fù)染液，復(fù)染時(shí)間僅需 10s 。2.3 耐酸性染色法 （萎倪二

3、氏法 ）2.3.1 石炭酸品紅染色液堿性品紅 0.3g95% 乙醇 10mL5% 酚水溶液 90mL 將品紅溶解于乙醇中 ，然后與酚溶液混合 。 2.3.2 3% 鹽酸乙醇濃鹽酸 3mL95% 乙醇 97mL2.3.3 復(fù)染液呂氏堿性美藍(lán)染色液。 2.3.4 染色法 2.3.4.1 將涂片在火焰上加熱固定，滴加石炭酸品紅染色液，徐 徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，但切 不可使沸騰。染液如因蒸發(fā)減少時(shí)，應(yīng)隨時(shí)添加。染 5min ，傾去染液，水洗。 2.3.4.2滴加鹽酸乙醇脫色，直至無(wú)紅色脫落為止（所需時(shí)間視涂片厚薄而定，一般為 13min），水洗。2.3.4.3滴加呂氏堿性美藍(lán)染色液，復(fù)染30s1min，

4、水洗，待干，鏡檢。2.3.5結(jié)果：耐酸性細(xì)菌呈紅色，其他細(xì)菌、細(xì)胞等物質(zhì)呈藍(lán)色。2.4 柯氏染色法 2.4.1 染色液 2.4.1.1 0.5% 沙黃液。 2.4.1.2 0.5% 孔雀綠液。 2.4.2 染色法 2.4.2.1 將涂片在火焰上固定，滴加 0.5%沙黃液，并加熱至出現(xiàn)氣泡，約23min，水洗。2.4.2.2滴加0.5%孔雀綠液，復(fù)染4050s。水洗，待干，鏡檢。2.4.3結(jié)果布氏桿菌呈紅色，其他細(xì)菌及細(xì)胞呈綠色。2.5 奧爾特氏莢膜染色法 2.5.1 染色液沙黃 3g 蒸餾水 100mL 用乳缽研磨溶解。 2.5.2 染色法將涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加熱至產(chǎn)生蒸氣后，繼

5、續(xù)染3min。水洗，待干，鏡檢。2.5.3結(jié)果炭疽芽胞桿菌菌體呈赤褐色，莢膜呈黃色。2.6 瑞氏染色法 2.6.1 染色液瑞氏色素 0.1g 甲醇 60mL 用乳缽研磨溶解。 2.6.2 染色法 2.6.2.1 涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定1min。2.6.2.2加入等量蒸餾水（pH6.5），染色35min。2.6.2.3用蒸餾水沖洗，待干，鏡檢。2.7鞭毛染色法2.7.1染色液的配制2.7.1.1甲液：稱(chēng)丹寧酸5g、氯化高鐵（FeCI3）1.5g，溶于100mL 蒸餾水中，待溶解后加入 1%的氫氧化鈉溶液 1mL 和 15%的甲醛溶液 2mL。 2.7.1.2 乙液：稱(chēng) 2g 硝酸銀

6、溶于 100mL 蒸餾水中。在 90mL 乙液中滴加濃氫氧化銨溶液，到出現(xiàn)沉淀后，再滴加使其變?yōu)槌吻?，然?用其余 10mL 乙液小心滴加至澄清液中，至出現(xiàn)輕微霧狀為止（此為關(guān)鍵性操作，應(yīng)特別小心 ）。滴加氫氧化銨和用剩余乙液回滴時(shí)，要邊滴邊充分搖蕩，染液當(dāng)天配，當(dāng)天使用，23d基本無(wú)效。2.7.2染色法在風(fēng)干的載玻片上滴加甲液，46min后，用蒸餾水輕輕沖凈。再加乙液，緩緩加熱至冒汽，維持約半分鐘（加 熱時(shí)注意勿使出現(xiàn)干燥面 ）。在菌體多的部位可呈深褐色到黑色，停止加熱，用水沖凈，干后鏡檢，菌體及 鞭毛為深褐色到黑色。 2.8 堿性復(fù)紅染色法將 0.5g 堿性復(fù)紅染料溶解于 20mL95%

7、乙醇中，然后用蒸餾水 稀釋至 100mL 。如有不溶物時(shí)，可用濾紙過(guò)濾，或靜置后取上清液備用。注：本染色液系用于蘇云金芽胞 內(nèi)蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶的染色，藉以與蠟樣芽胞桿菌相區(qū)別實(shí)驗(yàn)用染色液及試劑的配制1黑色素液 水溶性黑素 10g ，蒸餾水 100mL, 甲醛（福爾馬林） 0.5mL ?？捎米髑v膜的背景染色。2墨汁染色液 國(guó)產(chǎn)繪圖墨汁 40mL ，甘油 2mL ，液體石炭酸 2mL 。先將墨汁用多層紗布過(guò)濾，加 甘油混勻后，水浴加熱，再加石炭酸攪勻，冷卻后備用。用作莢膜的背景染色。3 呂氏 (Loeffier) 美藍(lán)染色液A 液：美藍(lán) (methylene blue, 又名甲烯藍(lán) )0.3g, 9

8、5% 乙醇 30mL;B 液： 0.0l% KOH l00mL 。混合 A 液和 B 液即成，用于細(xì)菌單染色，可長(zhǎng)期保存。根據(jù)需要可配制成稀釋美藍(lán)液，按1：10 或1 ： 100 稀釋均可。4革蘭氏染色液(1) 結(jié)晶紫 (crystal violet) 液：結(jié)晶紫乙醇飽和液 (結(jié)晶紫 2g 溶于 20mL95% 乙醇中 )20mL ，1% 草酸銨 水溶液 80mL 將兩液混勻置 24h 后過(guò)濾即成。此液不易保存，如有沉淀出現(xiàn)，需重新配制。(2) 盧戈(Lugol)氏碘液：碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300mL。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，然后加 入碘使之完全溶解，再加蒸餾水至 300mL 即成。

9、配成后貯于棕色瓶?jī)?nèi)備用，如變?yōu)闇\黃色即不能使用。(3) 95% 乙醇：用于脫色，脫色后可選用以下 (4)或(5)的其中一項(xiàng)復(fù)染即可。稀釋石炭酸復(fù)紅溶液：堿性復(fù)紅乙醇飽和液(堿性復(fù)紅1g, 95%乙醇l0mL, 5%石炭酸90mL混合溶解即成堿性復(fù)紅乙醇飽和液 )，取石炭酸復(fù)紅飽和液 l0mL 加蒸餾水 90mL 即成。(5)番紅溶液：番紅 O(safranine ，又稱(chēng)沙黃 O)2.5g, 95% 乙醇 100mL ，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶 中，用時(shí)取 20mL 與 80mL 蒸餾水混勻即可。以上染液配合使用，可區(qū)分出革蘭氏染色陽(yáng)性(G+)或陰性(G-)細(xì)菌，G-被染成藍(lán)紫色，G+被染成淡

10、紅色5. 鞭毛染色液A 液：丹寧酸 5.0g, FeCl3 1.5g ， 15% 甲醛(福爾馬林 )2.0mL ， l%NaOH 1.0mL ，蒸餾水 l00mL;B 液： AgNO3 2.0g, 蒸餾水 100mL 。待 AgNO3 溶解后，取出 l0mL 備用，向其余的 90mLAgNO3 中滴加 NH4OH ，即可形成很厚的沉 淀，繼續(xù)滴加 NH4OH 至沉淀剛剛?cè)芙獬蔀槌吻迦芤簽橹?，再將備用?AgNO3 慢慢滴入，則溶液出現(xiàn)薄 霧，但輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀的沉淀又消失，繼續(xù)滴入 AgNO3 ，直到搖動(dòng)后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀 為止，如霧重，說(shuō)明銀鹽沉淀出，不宜再用。通常在配制當(dāng)天便

11、用，次日效果欠佳，第3 天則不能使用。6. 0.5%沙黃(Safranine)液：2.5%沙黃乙醇液20mL，蒸餾水80mL。將2.5%沙黃乙醇液作為母液保 存于不透氣的棕色瓶中，使用時(shí)再稀釋。7. 5%孔雀綠水溶液：孔雀綠 5.0g，蒸餾水100mL。8. 0.05% 堿性復(fù)紅：堿性復(fù)紅 0.05g ， 95%乙醇 100mL 。9. 齊氏(Ziehl)石炭酸復(fù)紅液：堿性復(fù)紅0.3g溶于95%乙醇l0mL中為A 液: 0.01%K0H溶液l00mL為B液。混合A、B液即成。10 姬姆薩 (Giemsa) 染液（1）貯存液：稱(chēng)取姬姆薩粉 0.5g ，甘油 33mL ，甲醇 33mL 。先將姬姆

12、薩粉研細(xì)，再逐滴加入甘油，繼續(xù)研磨，最后加入甲醇，在56 C放置1 24h后即可使用。（2）應(yīng)用液 （臨用時(shí)配制 ）：取 1mL 貯存液加 19mL pH7.4 磷酸緩沖液即成。亦可取貯存液：甲醇=1：4 的比例配制成染色液。11 乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液（用于真菌固定和染色）石炭酸（結(jié)晶酚）20g，乳酸20mL，甘油40mL , 棉藍(lán) 0.05g ，蒸餾水 20mL 。將棉藍(lán)溶于蒸餾水中，再加入其他成分，微加熱使其溶解，冷卻后用。滴少量 染液于真菌涂片上，加上蓋玻片即可觀察。霉菌菌絲和孢子均可染成藍(lán)色。染色后的標(biāo)本可用樹(shù)脂封固，能長(zhǎng)期保存。12. 1%瑞氏（Wright 染色液：稱(chēng)取瑞氏染色粉 6g，放研缽內(nèi)磨細(xì)，不斷滴加甲醇 （共600mL）并繼續(xù)研磨使溶解。經(jīng)過(guò)濾后染液須貯存一年以上才可使用