抗壞血酸衍生物對(duì)質(zhì)粒DNA的氧化損傷：關(guān)于抗壞血酸的構(gòu)效關(guān)系

1、抗壞血酸衍生物對(duì)質(zhì)粒DNA的氧化損傷：關(guān)于抗壞血酸的構(gòu)效關(guān)系與其對(duì)質(zhì)粒DNA的氧化損傷能力的初步研究劉培巖a，韋曦b，蔣寧c，林宏輝c*，余孝其a*四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，綠色化學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064b中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院， 廣州 510055c 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064摘 要：為了研究抗壞血酸氧化損傷質(zhì)粒DNA的損傷機(jī)理，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一系列不同羥基被封閉的抗壞血酸衍生物，研究了其對(duì)質(zhì)粒DNA pUC19的氧化損傷作用。結(jié)果表明：分子中包含有未被封閉的2-OH和3-OH的衍生物，很好的保留了抗壞血酸氧化損傷質(zhì)粒DNA的能力；2-OH和3-OH之

2、一被封閉的衍生物氧化損傷的能力被大大地削弱；而那些2-OH和3-OH都被封閉的衍生物，幾乎完全喪失了氧化損傷質(zhì)粒DNA的能力。本文還測(cè)定了這些衍生物產(chǎn)生的羥基自由基的量，得到的結(jié)果與電泳實(shí)驗(yàn)基本吻合。據(jù)此推斷，2-OH和3-OH是抗壞血酸氧化損傷質(zhì)粒DNA的主要活性位點(diǎn)。關(guān)鍵詞：抗壞血酸衍生物，羥基自由基，質(zhì)粒DNA，氧化損傷a1 引言在生命體系中，DNA是活性氧進(jìn)攻的目標(biāo)，尤其是羥基自由基(OH)13?；钚匝醯倪M(jìn)攻，會(huì)導(dǎo)致DNA的損傷，包括單鏈損傷、雙鏈損傷、釋放自由堿基以及戊糖環(huán)的損傷等。DNA的損傷會(huì)導(dǎo)致生物體的老化、癌變等多種病變47。關(guān)于Fenton反應(yīng)和類(lèi)Fenton反應(yīng)體系導(dǎo)致D

3、NA氧化損傷的研究，已經(jīng)有很多相關(guān)報(bào)道了812。這些報(bào)道中，最常見(jiàn)的自由基是羥基自由基。由于抗壞血酸本身具有的重要的生理作用，所以抗壞血酸-過(guò)渡金屬離子這一體系引起了我們的興趣。眾所周知，抗壞血酸是一個(gè)重要的抗氧化劑，可以直接清除活性氧，或者通過(guò)再生其它抗氧化劑間接地清除人體內(nèi)的活性氧1。但是，在某些過(guò)渡金屬離子存在等特定條件下，抗壞血酸也會(huì)表現(xiàn)出氧化劑的性質(zhì)，損傷核酸等生物大分子1316?？箟难岱肿又?，存在四個(gè)羥基官能團(tuán)，其中兩個(gè)是烯醇。我們?cè)噲D了解的一個(gè)重要問(wèn)題是，在氧化損傷質(zhì)粒DNA的過(guò)程中，究竟是哪個(gè)或哪些羥基官1能團(tuán)是最重要的活性位點(diǎn)？關(guān)于抗壞血酸衍生物，已經(jīng)有一些合成方面的報(bào)道。

4、并研究了其產(chǎn)Yamamoto等1718合成了6-O-?；?2-O-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸，生羥基自由基的性質(zhì)。Frimee19， Schmid20和Nihro21等人也合成了一系列抗壞血酸衍生物，并且研究了它們抑止脂質(zhì)過(guò)氧化物等方面的生理性質(zhì)。在這些研究里，大多數(shù)都表明抗壞血酸分子中的兩個(gè)烯醇羥基在氧化損傷質(zhì)粒DNA的過(guò)程中，有重要作用。然而目前還沒(méi)有針對(duì)抗壞血酸分子中不同羥基被封閉的系列衍生物，對(duì)質(zhì)粒DNA氧化損傷作用的對(duì)比這一方面的研究見(jiàn)諸報(bào)道。有鑒于此，本文設(shè)計(jì)并合成了一系列用簡(jiǎn)單烷基封閉了不同羥基的抗壞血酸衍生物，隨后用這些衍生物進(jìn)行對(duì)DNA的損傷實(shí)驗(yàn)和羥基自由基的測(cè)定，研究了抗壞

5、血酸分子中各個(gè)羥基對(duì)質(zhì)粒DNA氧化損傷作用分別的貢獻(xiàn)，初步研究了抗壞血酸對(duì)質(zhì)粒DNA氧化損傷能力的構(gòu)效關(guān)系。2 結(jié)果與討論2.1 抗壞血酸衍生物的合成 HO6543抗壞血酸2圖 1在抗壞血酸分子中，有四個(gè)羥基官能團(tuán)，具有不同的活性（圖1）。我們合成了一系列保護(hù)了不同羥基的衍生物，合成路線表示如圖2。首先，用異丙叉基保護(hù)5-OH和6-OH，得到化合物1，并作為合成其他衍生物的起始原料。用硫酸二甲酯與化合物1反應(yīng)，生成化合物2。除去異丙叉基，得到化合物3。由于1位羰基的吸電子作用，3-OH的活性較2-OH為高。所以可以通過(guò)控制加入硫酸二甲酯的量得到單甲基化產(chǎn)物化合物7，再除去異丙叉基得到化合物8。

6、為了2制備2-OH甲基化，3-OH不變的化合物5和化合物6，須先用甲氧甲基保護(hù)3-OH，再對(duì)2-OH進(jìn)行保護(hù)，之后脫去保護(hù)基。甲氧甲基和異丙叉基可在同一步反應(yīng)中去除，化合物5和6可同時(shí)得到。2.2質(zhì)粒DNA的氧化損傷和羥基自由基的測(cè)定用瓊脂糖電泳研究了這一系列的抗壞血酸衍生物對(duì)質(zhì)粒DNA的氧化損傷作用，并測(cè)量了各個(gè)泳道的開(kāi)鏈環(huán)狀DNA所占質(zhì)粒DNA總量的比例（圖3）。在經(jīng)過(guò)優(yōu)化的條件下，抗壞血酸幾乎可以將超螺旋DNA完全轉(zhuǎn)化為開(kāi)鏈環(huán)狀（85.15%, lane 2）。相同條件下，化合物1可以將這一轉(zhuǎn)化完成地更為徹底（100%, lane 3）。幾個(gè)被封閉了一個(gè)烯醇的衍生物5，6，7和化合物8，

7、具有類(lèi)似的氧化損傷能力，開(kāi)鏈環(huán)狀比例都在25%左右（lane 69）。5,6-OH上的異丙叉基對(duì)化合物5和7似乎沒(méi)有影響。3-OH被封閉的化合物7和8對(duì)質(zhì)粒DNA的氧化損傷能力較之2-OH被封閉的化合物5和6略強(qiáng)。兩個(gè)烯醇都被封閉的化合物2和3幾乎不能氧化損傷質(zhì)粒DNA（0%, 0%, lane 4&5）。3ascorbic acid56圖2 抗壞血酸衍生物的合成路線2.3 羥基自由基的測(cè)定用Halliwell的TBARS方法測(cè)定了抗壞血酸衍生物體系產(chǎn)生的羥基自由基22（圖4）。相同條件下，抗壞血酸給出了比諸衍生物都要多的羥基自由基（4.945 nmol/L TBARS, Entry 1），化

8、合物1也給出了大量的羥基自由基（3.932 nmol/L TBARS, Entry 2）。相比之下，化合物5、6、7和8給出的羥基自由基就少多了（分別為0.817, 0.205, 1.367, 0.131 nmol/L TBARS，Entries 58）。兩個(gè)烯醇都被封閉的化合物2和3幾乎不能產(chǎn)生羥基自由基（0, 0 nmol/L TBARS, Entries 3 & 4）。4A圖 3B100plasmid relaxation (%)8060402023456789lane圖3. 不同抗壞血酸衍生物導(dǎo)致質(zhì)粒DNA氧化損傷 (A) pUC19 DNA經(jīng)如下處理: lane 1: DNA 空白;

9、 lane 2: 抗壞血酸; lane 39: 抗壞血酸衍生物 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8; 各化合物濃度均為0.286 mM, Cu2+ 0.25 M, 120 min, pH值7.4 (B) 開(kāi)鏈比的測(cè)定432112345678TBARS(nmol/L)entry圖4. 不同抗壞血酸衍生物產(chǎn)生羥基自由基的測(cè)定。 Entry 1:抗壞血酸; entries 28: 抗壞血酸衍生物 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8; 各化合物濃度均為0.286 mM, Cu2+ 0.25 M, 120 min, pH值7.4。3 討論從電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，化合物1對(duì)質(zhì)粒DNA的氧化損傷與

10、抗壞血酸同樣高效?？勺C明，抗壞血酸分子中的5-OH和6-OH對(duì)于氧化損傷并非必需?；衔?、6、7、8也可以氧化損傷DNA，但是程度弱得多。這就表明，被封閉了一個(gè)烯醇的衍生物只保留了一部分抗壞血酸的氧化損傷DNA的能力?；衔?2和3不能氧化損傷DNA，這就指示我們，沒(méi)有游離的烯醇的衍生物就沒(méi)有氧化損傷DNA的活性。此外，3-OH被封閉的化合物7和8氧化損傷DNA的活性略高于2-OH被封閉的化合物5和6。這一結(jié)果表明2-OH和3-OH，尤其是2-OH，在抗壞血酸對(duì)質(zhì)粒DNA的氧化損傷過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。從羥基自由基測(cè)定的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的趨勢(shì)。具有兩個(gè)未被封閉的烯醇的衍生物給出最多的羥

11、基自由基；只有一個(gè)未被封閉的烯醇的衍生物只能給出相對(duì)少量的羥基自由基；而兩個(gè)烯醇均被封閉的衍生物不能給出羥基自由基。這些結(jié)果與瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果聯(lián)系起來(lái)（表1），可以表明，給出羥基自由基更多的抗壞血酸衍生物，便能夠?qū)⒏嗟某菪鼶NA經(jīng)單鏈損傷轉(zhuǎn)化為開(kāi)鏈環(huán)狀。Compound Form II(%) TBARS（nmol/L）Ascorbic acid 85.2 4.9450 1 100 3.932 2 0 3 05 23.2 0.8176 20.9 0.2057 26.4 1.3678 27.0 0.131表1 不同抗壞血酸衍生物氧化損傷質(zhì)粒DNA的開(kāi)鏈比與產(chǎn)生的羥基自由基4 實(shí)驗(yàn)部分4.1

12、 儀器與藥品抗壞血酸經(jīng)去離子水重結(jié)晶。2-脫氧-D-核糖和硫代巴比妥酸購(gòu)自Fluka公司。瓊脂糖和pUC19質(zhì)粒DNA購(gòu)自Takara生物技術(shù)公司。TBARS的紫外吸收使用TU-1901紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中所使用ICP儀器為T(mén)hermo elemental公司的IRIS advantage型。電泳儀使用Biomeans公司的Stack II電泳系統(tǒng)，6PPSV-010。凝膠的拍照和泳道的掃描使用Olympus公司的Grab-IT 2.0 AnnotatingGC-MS數(shù)據(jù)Image Campture System。ESI-MS數(shù)據(jù)來(lái)自Finnigan LCQDECA質(zhì)譜儀。使用Ag

13、ilent 6890-5973N質(zhì)譜儀測(cè)定。HRMS數(shù)據(jù)由Bruker Daltonics Bio TOF質(zhì)譜儀測(cè)定。1H NMR使用Varian INOVA-400 spectrometer (400MHz)測(cè)定?；瘜W(xué)位移用(ppm)表示，耦合常數(shù)用Hertz (Hz)表示，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷或氘代水。未經(jīng)說(shuō)明的化學(xué)藥品均為直接購(gòu)買(mǎi)，未經(jīng)純化直接使用。4.2 瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)pUC19質(zhì)粒DNA在100mM磷酸混鹽緩沖溶液中維持特定條件。低溫中止反應(yīng)。隨后每個(gè)樣品加入4微升上樣緩沖溶液（0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖）。1%的瓊脂糖凝膠在TAE緩沖溶液中進(jìn)行電泳，溴乙錠加入膠中。照相，掃描。4.3

14、羥基自由基的測(cè)定羥基自由基的測(cè)定，是通過(guò)對(duì)被羥基自由基氧化的脫氧核糖與硫代巴比妥酸隨后加入生成的產(chǎn)物TBARS的測(cè)定來(lái)完的。脫氧核糖在特定體系中維持37 oC.，1%硫代巴比妥酸（w/v）和2.8%三氟乙酸（w/v）。加熱至100 oC維持10分鐘。冷卻后測(cè)定532nm處吸收22。4.4 抗壞血酸衍生物的合成15,6-O-異丙叉-抗壞血酸（1）：文獻(xiàn)方法合成23，白色固體，收率90%。H NMR(DMSO) 2CH(CH)O), 4.08-4.12 (m, 1H 22CH(O)CH), 4.72 (d, J = 2.8 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 239.0

15、528 M + Na+, C9H12Na1O6 requires 239.0526。72,3-O-二甲基-5,6-異丙叉-抗壞血酸（2）：100ml圓底燒瓶?jī)?nèi)加入2.16克化合物1（10 mmol），溶于50ml丙酮，再加入3.86克K2CO3 （28 mmol）。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入溶于5ml丙酮的2.27ml硫酸二甲酯（24 mmol）。回流4小時(shí)。固體過(guò)濾并以丙酮洗滌，濾液濃縮后，經(jīng)柱層析分離（洗脫劑：石油醚（沸程60-90 oC）:1H NMR (CDCl3) 丙酮:乙酸乙酯10:1:1）可得到化合物2。白色固體，收率93%。: 1.35 (d, J3), 3.81 (d, J3OC(C=

16、O), 3.93-4.03, (m, 1H OCH2CH(O)CH), 4.09-4.11 (m, 1H OCH2CH(O)CH), 4.13 (d, J = 3.2 Hz, 3H 3OC(CH)=C), 4.24-4.28 (m, 1H CH2J = 2.8 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 267.0839 M + Na+, C11H16Na1O6 requires 267.0839。2,3-O-二甲基-抗壞血酸（3）：50ml圓底燒瓶中，加入1.22克化合物2（5 mmol），溶于25ml甲醇，再加入2N鹽酸5ml，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。減壓蒸去溶劑，得黃色無(wú)定型固

17、體，用乙酸乙酯/石油醚（沸程60-90 oC）重結(jié)晶可得化合物3。白色固體，收率62%。1H NMR (CDCl3) CH(OH)CH), 3.80 (s, 3H 3OC(C=O), 3.88-3.95 (m, 1H CH23OC(CH)=C),4.67 (d, J = 1.6 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 227.0526 M + Na+, C8H12Na1O6 requires 227.0526。3-O-甲氧甲基-5,6-異丙叉-抗壞血酸（4）：100ml三頸燒瓶中加入2.16克化合物1（10 mmol），溶于50ml丙酮。加入2.07克K2CO3（15

18、mmol）?；亓鳡顟B(tài)下，氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢滴加溶于10ml丙酮的0.93ml甲氧甲基氯（11.6 mmol）。滴加完畢之后，繼續(xù)回流攪拌4小時(shí)。固體過(guò)濾并以丙酮洗滌，濾液濃縮后，經(jīng)柱層析分離（洗脫劑：石油醚（沸程60-90 oC）:丙酮:乙酸乙酯6:1:1）可得到化合物4。81白色固體，收率68%。H NMR (CDCl3) : 1.37 (d, J), 3.61 (s, 3H 3OCH222CH(O)CH),4.30-4.35 (m, 1H CH2J = 3.2 Hz, 1H CH2(s, 2H CH3O) , GC-MS (m/z) = 260 (M+)。2-O-甲基-5,6-異丙叉-抗壞血酸

19、（5）和2-O-甲基-抗壞血酸（6）：100ml圓底燒瓶?jī)?nèi)加入2.60克化合物4（10 mmol），溶于50ml丙酮，再加入2.07克K2CO3 （15 mmol）。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入溶于5ml丙酮的1.14ml硫酸二甲酯（12 mmol）?；亓?小時(shí)。減壓蒸去濾液，得到黃色油狀中間產(chǎn)物2-O-甲基3-O-甲氧甲基-5,6-異丙叉-抗壞血酸。加入30ml甲醇，將該中間產(chǎn)物溶解，再加入1N鹽酸2ml，室溫下攪拌25分鐘。減壓蒸去溶劑，得黃色油狀液體，經(jīng)柱層析分離（洗脫劑：石油醚（沸程60-90 oC）:丙酮:乙酸乙酯3:1:1）可得到化合物5（29%）和化合物61H NMR (CDCl3) : 1

20、.43 (d, J3), （32%）。均為白色固體?；衔?：3CH(O)CH), 4.16-4.20 (m, 1H 2CH(O)CH), 4.45-4.49 (m, 1H CH2J = 3.2 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 253.0692 M + Na+, C10H14Na1O6 requires 253.0683?；衔?：1H NMR (D2O) : 3.79-3.85 (m, 2H 2CH(OH)CH33OC(C=O) ), 4.11-4.15 (m, 1H CH2J = 2.0 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 213

21、.0368 M + Na+, C7H10Na1O6 requires 213.0370。3-O-甲基-5,6-異丙叉-抗壞血酸（7）：100ml圓底燒瓶?jī)?nèi)加入2.16克化合物1（10 mmol），溶于50ml丙酮，再加入2.07克K2CO3 （15 mmol）?；亓鳡顟B(tài)下，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢滴加溶于10ml丙酮的1.14ml硫酸二甲酯（12 mmol）。回流49小時(shí)。固體過(guò)濾并以丙酮洗滌，濾液濃縮后，經(jīng)柱層析分離（洗脫劑：石油醚（沸1:丙酮:乙酸乙酯6:1:1）可得到化合物7。白色固體，收率71%。H NMR 程60-90 oC）(CDCl3) : 1.37 (d, J2CH(O)CH), 2O

22、C(CH)=C), 4.24-4.28, (m, 1H CH2J = 3.6 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 253.0670 M + Na+, C10H14Na1O6 requires 253.0683。3-O-甲基-抗壞血酸（8）：50ml圓底燒瓶中，加入1.15克化合物7（5 mmol），溶于25ml甲醇，再加入2N鹽酸5ml，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。減壓蒸去溶劑，得黃色無(wú)定型固體，用乙酸乙酯/石油醚（沸程60-90 oC）重結(jié)晶可得化合物3。白色固體，1H NMR (DMSO) 2CH(OH)CH), 3.62-3.65 (m, 1H 收率58%。CH23OC(C

23、H)=C), 4.75 (d, J = 1.6 Hz, 1H CH2+), HRMS: found m/z = 191.0557 M + H, C7H11O6 requires 191.0550。致謝感謝國(guó)家自然科學(xué)基金（20132020，20372051，20471038）和教育部博士點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)基金，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才基金，四川省青年科技基金資助。10參考文獻(xiàn)1. Halliwell, B., and Gutteridge, J. M. C. (1989) Free-radicals in biology and medicine 1st ed., pp 27-31, Oxford Unive

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