普羅布考對冠狀動脈球囊損傷后管壁原癌基因c-myc表達的影響(一)

1、普羅布考對冠狀動脈球囊損傷后管壁原癌基因c-myc表達的影響(一)    摘要目的：通過建立豬冠狀動脈球囊損傷模型，觀察普羅布考對血管內(nèi)膜增生及管壁原癌基因c-myc表達的影響。方法：選用雌性NewYorkshire良種豬19頭，隨機分為兩組，對照組11頭，普羅布考組8頭，均行冠狀動脈球囊擴張術(shù)，術(shù)后喂飼6周，重復冠狀動脈造影后處死動物。普羅布考組于術(shù)前4周給予普羅布考1g,bid,至實驗結(jié)束。常規(guī)病理制片，觀察形態(tài)學變化，采用RT-PCR的方法檢測c-mycmRNA的表達強度。結(jié)果:對照組損傷動脈內(nèi)膜可見大量平滑肌細胞增生，呈偏心性增厚，普羅布考組內(nèi)膜

2、增厚程度明顯減低。對照組c-mycmRNA相對表達強度（2.73±0.51）明顯高于正常動脈（0.82±0.09，P0.05），普羅布考組c-mycmRNA相對表達強度（1.44±0.25）較對照組減弱（P0.05），但仍高于正常動脈（P0.05）。結(jié)論:普羅布考具有抑制冠狀動脈球囊損傷后c-myc表達和內(nèi)膜增生的作用。 關(guān)鍵詞普羅布考；經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成形術(shù)；c-myc基因 Effectsofprobucolontheexpressionofc-mycmRNAandneointimalhyperplasiaaftercoronaryangioplastyinas

3、winemodel YUExin1,PANQi-xing1,LIJi-fu1,ZHANGWei1,TIANFeng-zheng2,LIUChun-sheng1,MADao-xin1,LIGui-shuang1,CHENYu-guo1,YUAi-qin3,MAYu-lin3,YANGKai3 (1DepartmentofCardiology,theQiLuHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China;2TheQiLupharmaceuticalfactory,Jinan250000,China;3TheZichuanhospital,Zibo255

4、000,China) AbstractObjective:Toobservetheeffectofprobucolontheexpressionofc-mycmRNAandneointimalhyperplasiaaftercoronaryangioplastyinaswinemodel.Methods:19femaleNewYorkshirepigswererandomlyassignedtoreceive2g.d-1ofprobucolorcontroltherapyfor4weeksbeforepercutaneoustransluminalcoronaryangioplasty(PTC

5、A),thenPTCAwasunderwentinallthepigs,Probucolwascontinueduntilfollow-upangiography6weeksafterPTCA.Thentheanimalswerekilledandtakenhistopathologicexamination.RT-PCRmethodwasusedtodetecttheexpressionofc-mycmRNAintheinjuredarteries.Results:Theinjuredarteryofthecontrolgrouphadeccentrichyperplasticneointi

6、maandtheexpressionofthec-mycmRNA(2.730.51)washigherthanthenormalartery(0.820.09,P0.05),Theinjuredarteryoftheprobucolgrouphadlesshyperplasticneointimaandlowerexpressionofthec-mycmRNA(1.440.25)thanthecontrolgroup(P0.05),buthigherthanthenormalartery(P0.05).Conclusion:Probucolcandecreasetheexpressionofc

7、-mycmRNAandtheneointimalhyperplasiaafterPTCA. KeywordsProbucol；Percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty；C-mycgenes, 近年的研究表明抗氧化劑普羅布考（probucol,丙丁酚）具有抑制經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成形術(shù)(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty,PTCA)后再狹窄的作用1，但機制尚不清楚。本實驗建立豬冠狀動脈球囊損傷模型,觀察普羅布考對損傷血管壁內(nèi)原癌基因c-myc表達的影響，為其防治再狹窄提供依據(jù)。 材料與方法 1主要材料與

8、試劑 普羅布考由齊魯制藥廠提供，批號951205；RNA提取試劑盒、PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)；RT-PCR試劑均購自美國Promega公司。 2動物模型的制備 健康雌性NewYorkshire良種豬19只,體重（64±5）kg，隨機分為對照組(n=11)和普羅布考組(n=8)。普羅布考組于術(shù)前4周開始給予普羅布考1g，bid，至實驗結(jié)束。所有動物均于局麻下分離右側(cè)股動脈,在X線透視下將8FJR大腔引導導管插入左或右冠狀動脈開口處,行冠狀動脈造影,選用3.54mm的球囊置于左冠狀動脈前降支中段,回旋支中段或右冠狀動脈中遠段,于810個大氣壓下擴張30s,放氣1m

9、in,重復2或3次,球囊與管腔直徑比約為1.1：11.3：1,重復冠狀動脈造影,使管腔保持通暢。以另外一支未損傷的冠狀動脈作為正常對照。術(shù)后結(jié)扎股動脈,縫合傷口。普通飼料喂養(yǎng)6周,重復行冠狀動脈造影,靜脈注射過量戊巴比妥鈉處死動物。迅速取出心臟,分離冠狀動脈,根據(jù)造影結(jié)果切取損傷段血管,選取一部分置10%中性福爾馬林中固定,常規(guī)染色觀察形態(tài)學變化；剩余部分封入1.5mL凍存管，置液氮中保存。 3損傷動脈壁內(nèi)原癌基因c-mycmRNA的檢測 采用RT-PCR（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）方法。 31動脈壁組織RNA的提取參照試劑盒說明書

10、進行。 32cDNA的合成取提取的RNA10L，冰上依次加入OligodT(0.5g.L-1)0.2L,dNTP(10mmol.L-1)2.5L,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200u.L-1）0.5L,RT緩沖液(5×)4L,RNA酶抑制劑(40u.L-1)0.5L,加DEPC(1%焦碳酸二乙酯)處理的三蒸水將總體積補至20L。37水浴30min,95放置10min以滅活M-MLV,0放置5min。置于-20備用。 3.3PCR產(chǎn)物擴增C-myc和GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶）的引物序列及擴增片段2如表1所示。取0.2mL離心管，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5L為模板，分別加入上游引物（50mmol?L

11、-1）0.5L，下游引物(50mmol?L-1)0.5L，dNTP(10mmol?L-1)1L，TaqDNA聚合酶(5u?L-1)0.5L，PCR緩沖液(10×)5L，MgCl2(25mmol?L-1)5L，加三蒸水將總體積補至50L。加入液體石蠟50L，短暫離心混勻，放入PCR儀，95變性5min,然后按下述條件擴增35個循環(huán)：9445s,5545s,7245s，最后72延伸5min。 表1引物序列及擴增片段 引物引物序列擴增片段 c-myc上游5CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG3下游5AATTGTGCTGGTGCGTGGAC5398bp GAPDH上游5CATCACCAT

12、CTTCCAGGAGCG3下游5TGACCTTGCCCACAGCCTTG3443bp 3.4PCR產(chǎn)物的鑒定及定量分析取PCR擴增產(chǎn)物10L，與2L上樣緩沖液（6×）混勻，在2%瓊脂糖凝膠中以5V.cm-1的電壓電泳2h，紫外透射儀下觀察，出現(xiàn)特異性條帶為陽性。采用復日FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)進行瓊脂糖凝膠的掃描和擴增條帶光密度分析。因為GAPDH在組織中穩(wěn)定表達2，所以以GAPDH作為內(nèi)參照，并按照下列公式計算c-myc的相對表達強度：被測基因表達強度=被測基因光密度/GAPDH光密度。4統(tǒng)計學處理采用EXCEL軟件做統(tǒng)計學處理,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x

13、77;s）表示,組間比較采用t檢驗，P0.05表示有顯著性差異。 結(jié)果 1常規(guī)形態(tài)學觀察 實驗中動物死亡5只,對照組4只,其中1只死于術(shù)后血栓形成,2只死于麻醉意外,1只于術(shù)中發(fā)生室顫致死；普羅布考組1只，死于術(shù)中室顫。術(shù)后所有存活動物恢復良好。 未損傷段冠狀動脈柔軟、有彈性,與周圍組織無粘連；鏡下內(nèi)彈力板完整,內(nèi)膜和中膜無增生,平滑肌細胞排列規(guī)則,形態(tài)一致,細胞外基質(zhì)少見。對照組損傷段動脈成灰白色,僵硬,與周圍組織粘連；鏡下可見內(nèi)膜成偏心性增厚,主要由平滑肌細胞和膠原構(gòu)成,此外尚可見泡沫細胞和少量的炎性細胞,內(nèi)彈力板多處斷裂,中膜局部變薄,平滑肌細胞大量增生,排列紊亂無序。普羅布考組損傷段動

14、脈與周圍組織無明顯的粘連；鏡下內(nèi)膜增厚程度明顯減低。 2對c-myc表達的影響 正常組、對照組和普羅布考組損傷動脈壁內(nèi)c-mycmRNA的相對表達強度分別為(0.82±0.09),(2.73±0.51),(1.44±0.25)。對照組c-mycmRNA的表達明顯高于正常動脈（P0.05）；與對照組相比，普羅布考組c-mycmRNA表達減弱（P0.05），但仍高于正常動脈(P0.05)。表明普羅布考可抑制損傷動脈壁原癌基因c-myc的表達。 討論 許多研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞（VSMC）增殖與原癌基因c-myc密切相關(guān)。C-myc基因表達增加，其編碼蛋白與DNA結(jié)合

15、，可促進與細胞增殖有關(guān)的基因開放，從而產(chǎn)生細胞增殖效應(yīng)，提示c-myc基因的激活可能是VSMC增殖的始動因素。本研究發(fā)現(xiàn)，球囊損傷后6周，動脈壁c-myc表達強度明顯高于正常動脈，進一步證實了c-myc在再狹窄中的重要作用。 普羅布考廣泛應(yīng)用于降血脂和抗氧化治療。近來研究表明，它可以抑制平滑肌細胞的增殖和PTCA術(shù)后再狹窄的發(fā)生。Miyauchid等3的研究發(fā)現(xiàn)普羅布考可使球囊損傷的兔頸動脈內(nèi)膜面積減少20%，內(nèi)膜中VSMC的數(shù)目及PCNA(增殖細胞核抗原)陽性細胞顯著減少，并降低血小板源生長因子（plateletderivedgrowthfactor,PDGF）的表達，表明普羅布考抑制平滑肌

16、細胞的增生及生長因子的表達。Watanabe等4將118例行PTCA術(shù)的患者隨機分成普羅布考治療組（P組）和對照組，P組從術(shù)前7d開始服用普羅布考0.5g.d-1，術(shù)后3個月再次行冠狀動脈造影，其殘余管腔內(nèi)徑增加，再狹窄發(fā)生率下降。MVP(MultivitaminsandProbucolTrial)試驗和PART試驗（theProbucolAngioplastyRestenosisTrial）也得到了相似的結(jié)果1，5。本實驗亦證實普羅布考可抑制冠狀動脈球囊損傷后內(nèi)膜增生，并降低損傷動脈壁內(nèi)c-myc表達強度，表明普羅布考可在一定程度上抑制c-myc的表達，可能是其防治再狹窄的機制之一。 參考文

17、獻 1TarifJC,CoteG,LesperanceJ,etal.ProbucolandmultivitaminsinthepreventionofrestenosisaftercoronaryangioplastyJ.NEnglJMed,1997,337(6):365-372. 2BartlingB,HoffmannJ,Holtz,J,etal.Quantificationofcardioprotectivegeneexpressioninporcineshort-termhibernatingmyocardiumJ.JMolCellCardiol,1999,31(1):147-158.

18、3MiyauchiK,AikawaM,TaniT,etal.Effectofprobucolonsmoothmusclecellproliferationanddedifferentiationaftervascularinjuryinrabbits:possibleroleofPDGFJ.CardiovascDrugsTher,1998,12(3):251-260. 4WatanabeK,SekiyaM,IkedaS,etal.PreventioneffectsofprobucolonrestenosisafterpercutaneoustransluminalcoronaryangioplastyJ.AmHeartJ,1996,132（1Pt1）:23-29. 5YokoiH,Da