柱層析法分離純化大豆磷脂酰膽堿

1、基礎(chǔ)研究食品研究與開(kāi)發(fā)2010年3月第31卷第3期19柱層析法分離純化大豆磷脂酰膽堿*韓雪1，汪勇1，胡長(zhǎng)鷹1，王興國(guó)2，劉元法2（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）摘要：利用硅膠柱層析法，通過(guò)梯度洗脫對(duì)大豆粉末磷脂中的磷脂酰膽堿進(jìn)行分離純化。比較氯仿/甲醇和異丙醇/甲醇兩個(gè)洗脫體系所得磷脂酰膽堿的純度和回收率。梯度洗脫時(shí)，在氯仿/甲醇體系中氯仿：甲醇的比例為32（體積甲醇的比例為11（體積分?jǐn)?shù)）洗脫，是獲得磷脂酰膽堿的最佳洗脫條件。結(jié)果表明：分?jǐn)?shù)），異丙醇/甲醇體系異丙醇：在氯仿/甲醇洗脫體系獲得磷脂酰膽堿的純度為97.0%、回收

2、率為86.5%。異丙醇/甲醇洗脫體系獲得磷脂酰膽堿的回收率為83.0%。純度為95.0%、關(guān)鍵詞：磷脂酰膽堿；硅膠；柱層析；純化SeparationandPurificationthePhosphatidylcholinefromSoyLecithinPowderbyColumnChromatography*HANXue1,WANGYong1，,HUChang-ying1,WANGXing-guo2,LIUYuan-fa2（1DepartmentofFoodScienceandEngineering，JinanUniversity，Guangzhou510632,Guangdong,China

3、；2CollegeofJiangnanUniversity，Wuxi214122,Jiangsu,China）FoodScience，Abstract:Separationandpurificationthephosphatidylcholine（PC）fromsoylecithinpowderbygradientelutionusingthesilicagelcolumnchromatographywasstduied.Purityandrecoveryofphosphatidylcholine,whichobtainedfromchloroform/methanolandisopropyl

4、alcohol/methanolelutionsystemwerecompared.Theoptimalconditionsforelutionofphosphatidylcholinewerechloroform/methanol（32）andisopropylalcohol/methanol（11）forchloroform/methanolandisopropylalcohol/methanolsystem，respectively.Thepuritiesofphosphatidylcholinewere97.0%withrecoveryof86.5%,and95.0%withrecov

5、eryof83.0%forchloroform/methanolandisopropylalcohol/methanolsystem,respectively.Keywords:phosphatidylcholine（PC）；silica；columnchromatography；purification基金項(xiàng)目：國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃(2006BAD05A08)作者簡(jiǎn)介：韓雪（1984），女（漢），碩士研究生，研究方向：功能性食品研究。*通訊作者：汪勇（1977），男（漢），講師，博士。777777777777777777777777777777777777777777777777報(bào)，2

6、003，38(1)：71-74短，半衰期短，易被蛋白酶及胃酸破壞，因此對(duì)SOD分子進(jìn)行改造和修飾是十分必要的。經(jīng)修飾后的SOD在腸液中半衰期顯著增加，且不被破壞，易為模擬胃液、人體吸收。本試驗(yàn)采用右旋糖苷溶液，使其氧化后形成的醛基化合物在玉米SOD上形成一層保護(hù)膜，SOD就被修飾了。通過(guò)右旋糖苷修飾玉米SOD后不僅保留天然酶活性，而且其溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶的酶解耐受力有不同程度增加，右旋糖苷是一種優(yōu)良的玉米SOD修飾劑，通過(guò)修飾為玉米的廣泛應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1張翊，王軍志，吳勇杰.超氧化物歧化酶藥用研究進(jìn)展J.藥學(xué)學(xué)收稿日期：2009-09-0152

7、劉劍利，孟鑫，張強(qiáng)，等.金屬螯合親和層析純化玉米SOD及其酶學(xué)性質(zhì)研究J.糧食與飼料工業(yè)，2005（10）：25-273呂淑霞.基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003：77-824張龍翔，張庭芳，李令媛.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)M.北京：高等教育出版社，1997：138-140張海悅，李曉玲，張鳳清，等.高活性小白菜SOD口服液的研制J.食品科學(xué)，2003，24(4)：66-686季波，徐瀅波，趙樹(shù)進(jìn).聚乙二醇修飾超氧化物歧化酶及其穩(wěn)定2002，30(3)：16-17性研究J.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，202010年3月第31卷第3期食品研究與開(kāi)發(fā)膏狀備用。1.3.2層析柱的制備基礎(chǔ)研究大

8、豆磷脂是商品化大豆卵磷脂的主要來(lái)源，約占90%的市場(chǎng)份額。大豆磷脂主要由磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）等組成1。由于磷脂是一種表面活性劑，具有良好的乳化特性。因而它被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)2-5。由于磷脂酰膽堿的親水性強(qiáng)，適合做水包油（O/W）型乳化劑，因而應(yīng)用更為廣泛，國(guó)內(nèi)需求量逐年增加。但是目前我國(guó)高純度磷脂酰膽堿的產(chǎn)量和質(zhì)量都比較低，很多都依賴于進(jìn)口，尤其是醫(yī)藥注射用磷脂酰膽堿6。為了提高我國(guó)高純度磷脂酰膽堿的產(chǎn)品質(zhì)量，許多學(xué)者在分離純化磷脂酰膽堿上做了很多的研究7-8。因?yàn)榱字Ｄ憠A是極性比較大的物質(zhì)，在提純過(guò)程中糖酯等極性物質(zhì)，分離純化難度容易

9、伴隨有溶血磷脂、較大。目前用于的卵磷脂精制的方法主要有：溶劑萃取法9、柱層析法10-12、超臨界流體萃取法13-14等。其中柱層析是應(yīng)用較廣且能工業(yè)化生產(chǎn)的一種獲得高純度物質(zhì)的方法。在以往的柱層析法純化磷脂酰膽堿的方法中，常用的洗脫體系是氯仿/甲醇體系，然而氯仿毒性較大，不僅對(duì)人體健康有很大的危害，而且得到的產(chǎn)品有溶劑殘留的危險(xiǎn)。本文先用乙醇初步濃縮大豆粉末磷脂中的磷脂酰膽堿，然后再用毒性較小的異丙醇代替氯仿柱層析洗脫純化磷脂酰膽堿，比較氯仿/甲醇洗脫體系和異丙醇/甲醇洗脫純化磷脂酰膽堿的分離效果和得率，為工業(yè)化生產(chǎn)高純度磷脂酰膽堿提供參考。1材料和方法大豆粉末磷脂：美國(guó)ADM公司；柱層析硅膠

10、（100目）：青島海洋化工廠分廠；硅膠板：煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)200目研究所；正己烷、異丙醇為色譜純；甲醇、氯仿、乙醇、異丙醇為分析純。1.2儀器設(shè)備LC-20AT高效液相色譜儀：島津公司；RE-52型F5H型反應(yīng)器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海嘉鵬科技有限公司；上海申生科技有限公司；DT5-4型高速離心機(jī)：北京時(shí)JB50-D型電磁攪拌器：上海代北利離心機(jī)有限公司；滬西分析儀器廠；層析柱（20cm×40cm）：上海精科實(shí)業(yè)有限公司。1.3方法1.3.1乙醇濃縮磷脂酰膽堿稱取100.0g大豆粉末磷脂于圓底燒瓶中，加入500mL無(wú)水乙醇，在30下攪拌萃取1h。萃取液離心（3000r/min）20min分層，

11、取上層清液真空濃縮至稱取30g左右的硅膠加入一定的氯仿攪拌成漿狀，采用濕法裝柱法將硅膠裝入到層析柱中，靜置一夜，使填料充分沉降。進(jìn)樣前要用氯仿充分清洗柱子。1.3.3進(jìn)樣和梯度洗脫將1.0g乙醇萃取濃縮的膏狀磷脂用2mL氯仿溶解后緩慢加入層析柱內(nèi)，用不同比例的氯仿/甲醇和異丙醇/甲醇洗脫，收集洗脫液，通過(guò)薄層層析鑒定樣品組成。1.4分析方法1.4.1薄層層析收集的洗脫液用硅膠薄層板進(jìn)行層析，展開(kāi)劑為（65254，體積分?jǐn)?shù)），層析完畢后，取出薄氯仿甲醇水板，干燥，放入碘缸內(nèi)蓋好。1min后可看到黃色的斑點(diǎn)。1.4.2液相色譜法分析磷脂純度將收集的洗脫液按照層析結(jié)果合并濃縮成膏狀，配成1.0mg/

12、mL樣品，用LC-20AT高效液相色譜儀測(cè)定磷脂組成。色譜條件為：LichrosorbSi60色譜柱，流動(dòng)相為正己烷異丙醇1.8%醋酸溶液=39538，流速為1.0mL/min，柱溫是32，進(jìn)樣量為20L，檢測(cè)波長(zhǎng)為206nm。磷脂酰膽堿的純度以峰面積百分比計(jì)算。1.4.3回收率的計(jì)算因此可以通過(guò)計(jì)算分離由于磷脂都含有P原子，作為磷脂酰膽堿的回收純化前后總的P含量的變化，率。磷脂樣品總磷含量按照國(guó)標(biāo)GB/T5537-85植物油檢驗(yàn)，磷脂測(cè)定法中的鉬藍(lán)比色法測(cè)定。磷脂酰膽堿回收率=×100%濃縮樣品磷脂的總磷含量×磷脂酰膽堿的純度2結(jié)果與討論濃縮前后大豆粉末磷脂先用乙醇提取濃

13、縮15-17，的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。1.1材料和試劑2.1乙醇濃度磷脂酰膽堿（a）基礎(chǔ)研究食品研究與開(kāi)發(fā)2010年3月第31卷第3期21（b）到較好的分離效果。在梯度洗脫的過(guò)程中，通過(guò)薄層層析檢測(cè)是否有PC洗出，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。（a）(a)粉末磷脂；(b)乙醇濃縮磷脂。圖1磷脂的HPLC圖譜Fig.1TheHPLCchromatogramoflecithin(a)Thepowderlecithin(b)Ethanolconcentrationlecithin從圖1中可看出通過(guò)乙醇提取濃縮的樣品中的磷脂酰膽堿的含量從26.0%提高到97.4%，提取得率為37.37%。極性的乙醇可以溶解極性相對(duì)較

14、大的磷脂酰膽堿，而對(duì)極性較小的PI溶解度較低，這樣可以用乙醇預(yù)濃縮磷脂酰膽堿，為后續(xù)的柱分離預(yù)先除去一些非極性物質(zhì)。2.2柱層析法純化磷脂酰膽堿利用硅膠對(duì)需要分離的各種物質(zhì)的吸附性的不同，來(lái)分離純化磷脂酰膽堿。在乙醇濃縮的磷脂中，磷脂酰膽堿的極性很大，用氯仿、異丙醇和甲醇配成不同比例的洗脫劑進(jìn)行洗脫，考察了洗脫劑配比對(duì)磷脂酰膽堿純度和得率的影響，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。表1流動(dòng)相組成對(duì)分離效果的影響(氯仿甲醇體系)Table1TheinfluenceofMobilePhasecomposesontheseparationeffect(chloroform/methanolsystem)流動(dòng)相的組成氯

15、仿甲醇(91)氯仿甲醇(41)氯仿甲醇(13)氯仿甲醇(32)氯仿甲醇(11)甲醇洗脫體積/mL收集液/mL100100150100100300100100100150100300現(xiàn)象3個(gè)點(diǎn)1個(gè)點(diǎn)1個(gè)點(diǎn)1個(gè)點(diǎn)1個(gè)點(diǎn)無(wú)點(diǎn)收集液標(biāo)號(hào)12345(a)氯仿/甲醇洗脫體系；（b）異丙醇/甲醇洗脫體系。圖2各洗脫收集液的TLC圖Fig.2TLCofelutionliquid(a)chloroform/methanolsystem,(b)isopropanol/methanolsystem（b）在梯度洗脫中，開(kāi)始時(shí)要適當(dāng)調(diào)大極性，使一些小極性的物質(zhì)盡快流出來(lái)，當(dāng)用氯仿甲醇（41）、異丙（13），PE開(kāi)始被洗

16、脫下來(lái)，從圖2（a）的2號(hào)醇甲醇瓶和圖2（b）的2、3號(hào)瓶收集液中可以看出，這時(shí)PE的純度很高。隨著極性逐漸增加，當(dāng)氯仿/甲醇比例增加到32、異丙醇/甲醇比例增加到11時(shí)，磷脂酰膽堿被洗脫出來(lái)，收集液中大部分是PC。因?yàn)镻C極性較大，是最后才被洗脫出來(lái)的物質(zhì)，因此可以適當(dāng)增大洗脫劑的極性，使得PC更快的流出，節(jié)約洗脫時(shí)間和洗脫劑。根據(jù)薄層色譜圖，將收集液中含有PC的部分真空濃縮后，用HPLC檢測(cè)其純度。圖3是2種洗脫方法得到PC的HPLC譜圖。從圖3可以看出，在13min左右出的峰是PC，而應(yīng)用這2種洗脫溶劑洗脫都可以除去大部分醇溶磷脂中1min4min出峰的組分，僅留下幾個(gè)吸收較弱的紫外吸收

17、峰，使之得到的PC純度都在95%以上。這2種洗脫體系都可以使磷脂酰膽堿達(dá)到很好表2流動(dòng)相組成對(duì)分離效果的影響(異丙醇/甲醇體系)Table2TheinfluenceofMobilePhasecomposesontheseparationeffect(isopropanol/methanolsystem)流動(dòng)相的組成異丙醇甲醇(14)異丙醇甲醇(13)異丙醇甲醇(23)異丙醇甲醇(11)甲醇洗脫體積/mL收集液/mL505010050100555510060110現(xiàn)象3個(gè)點(diǎn)1個(gè)點(diǎn)1個(gè)點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)收集液標(biāo)號(hào)12345從表1和表2可以看出，洗脫時(shí)根據(jù)調(diào)節(jié)洗脫劑中甲醇的比例來(lái)增加溶劑的極性，隨著溶劑

18、極性的增加，混合物中的各物質(zhì)按照極性強(qiáng)弱逐個(gè)被分離出來(lái)，控制好洗脫劑的極性和洗脫體積就可以使PC達(dá)22（a）2010年3月第31卷第3期食品研究與開(kāi)發(fā)基礎(chǔ)研究被洗脫出來(lái)，最終可以得到的PC含量在97.0%以上的產(chǎn)品，其產(chǎn)品得率為86.5%。應(yīng)用異丙醇甲醇體系，）時(shí)，磷脂酰膽堿才被洗當(dāng)洗脫液中異丙醇：甲醇（11其產(chǎn)脫出來(lái)，可以得到PC含量在95.0%以上的產(chǎn)品，品得率為83.0%。2）綜合比較這2種洗脫體系，其PC的純度和回收率都相差不大，因此用異丙醇來(lái)代替氯仿作為流動(dòng)相洗脫是完全可行的。（b）參考文獻(xiàn)：1曹棟，裘愛(ài)泳，王興國(guó).磷脂結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能及研究現(xiàn)狀J.糧食與油脂，2004（5）：3-6

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