中草藥有效成分的提取、分離與鑒定

1、中草藥有效成分的提取、分離與鑒定A中草藥有效成分的提取：（一）溶劑提取法：1溶劑提取法的原理：溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對活性成分溶解度大，對不需要溶出成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來的方法。當溶劑加到中草藥原料（需適當粉碎）中時，溶劑由于擴散、滲透作用逐漸通過細胞壁透入到細胞內(nèi)，溶解了可溶性物質(zhì)，而造成細胞內(nèi)外的濃度差，于是細胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴散，溶劑又不斷進入藥材組織細胞中，如此多次往返，直至細胞內(nèi)外溶液濃度達到動態(tài)平衡時，將此飽和溶液濾出，繼續(xù)多次加入新溶劑，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。中草藥成分在溶劑中的溶解度直接與

2、溶劑性質(zhì)有關。溶劑可分為水、親水性有機溶劑及親脂性有機溶劑，被溶解物質(zhì)也有親水性及親脂性的不同。有機化合物分子結(jié)構(gòu)中親水性基團多，其極性大而疏于油；有的親水性基團少，其。極性小而疏于水。這種親水性、親脂性及其程度的大小，是和化合物的分子結(jié)構(gòu)直接相關。一般來說，兩種基本母核相同的成分，其分子中功能基的極性越大，或極性功能基數(shù)量越多，則整個分子的極性大，親水性強，而親脂性就越弱，其分子非極性部分越大，或碳鍵越長，則極性小，親脂性強，而親水性就越弱。各類溶劑的性質(zhì)，同樣也與其分子結(jié)構(gòu)有關。例如甲醇、乙醇是親水性比較強的溶劑，它們的分子比較小，有羥基存在，與水的結(jié)構(gòu)很近似，所以能夠和水任意混合。丁醇和

3、戊醇分子中雖都有羥基，保持和水有相似處，但分子逐漸地加大，與水性質(zhì)也就逐漸疏遠。所以它們能彼此部分互溶，在它們互溶達到飽和狀態(tài)之后，丁醇或戊醇都能與水分層。氯仿、苯和石油醚是烴類或氯烴衍生物，分子中沒有氧，屬于親脂性強的溶劑。這樣，我們就可以通過時中草藥成分結(jié)構(gòu)分析，去估計它們的此類性質(zhì)和選用的溶劑。例如葡萄糖、蔗糖等分子比較小的多羥基化合物，具有強親水性，極易溶于水，就是在親水性比較強的乙醇中也難于溶解。淀粉雖然羥基數(shù)目多，但分子大大，所以難溶解于水。蛋白質(zhì)和氨基酸都是酸堿兩性化合物，有一定程度的極性，所以能溶于水，不溶于或難溶于有機溶劑。甙類都比其甙元的親水性強，特別是皂甙由于它們的分子中

4、往往結(jié)合有多數(shù)糖分子，羥基數(shù)目多，能表現(xiàn)出較強的親水性，而皂甙元則屬于親脂性強的化合物。多數(shù)游離的生物堿是親脂性化合物，與酸結(jié)合成鹽后，能夠離子化，加強了極性，就變?yōu)橛H水的注質(zhì)，這些生物堿可稱為半極性化合物。所以，生物堿的鹽類易溶于水，不溶或難溶于有機溶劑；而多數(shù)游離的生物堿不溶或難溶于水，易溶于親脂性溶劑，一般以在氯仿中溶解度最大。鞣質(zhì)是多羥基的化臺物，為親水性的物質(zhì)。油脂、揮發(fā)油、蠟、脂溶性色素都是強親脂性的成分。總的說來，只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項性質(zhì)相當，就會在其中有較大的溶解度，即所謂“相似相溶”的規(guī)律。這是選擇適當溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。2溶劑的選擇

5、：運用溶劑提取法的關鍵，是選擇適當?shù)娜軇?。溶劑選擇適當，就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選擇溶劑要注意以下三點：溶劑對有效成分溶解度大，對雜質(zhì)溶解度??；溶劑不能與中藥的成分起化學變化；溶劑要經(jīng)濟、易得、使用安全等。常見的提取溶劑可分為以下三類：1）水：水是一種強的極性溶劑。中草藥中親水性的成分，如無機鹽、糖類、分子不太大的多糖類、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸鹽、生物堿鹽及甙類等都能被水溶出。為了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及堿水作為提取溶劑。酸水提取，可使生物堿與酸生成鹽類而溶出，堿水提取可使有機酸、黃酮、蒽醌、內(nèi)酯、香豆素以及酚類成分溶出。但用水提取易酶解甙類成分，且易霉壞變質(zhì)。

6、某些含果膠、粘液質(zhì)類成分的中草藥，其水提取液常常很難過濾。沸水提取時，中草藥中的淀粉可被糊化，而增加過濾的困難。故含淀粉量多的中草藥，不宜磨成細粉后加水煎煮。中藥傳統(tǒng)用的湯劑，多用中藥飲片直火煎煮，加溫可以增大中藥成分的溶解度外，還可能有與其他成分產(chǎn)生“助溶”現(xiàn)象，增加了一些水中溶解度小的、親脂性強的成分的溶解度。但多數(shù)親脂性成分在沸水中的溶解度是不大的，既使有助溶現(xiàn)象存在，也不容易提取完全。如果應用大量水煎煮，就會增加蒸發(fā)濃縮時的困難，且會溶出大量雜質(zhì)，給進一步分離提純帶來麻煩。中草藥水提取液中含有皂甙及粘液質(zhì)類成分，在減壓濃縮時，還會產(chǎn)生大量泡沫，造成濃縮的困難。通?？稍谡麴s器上裝置一個汽

7、一液分離防濺球加以克服，工業(yè)上則常用薄膜濃縮裝置。2）親水性的有機溶劑：也就是一般所說的與水能混溶的有機溶劑，如乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比較好，對中草藥細胞的穿透能力較強。親水性的成分除蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。難溶于水的親脂性成分，在乙醇中的溶解度也較大。還可以根據(jù)被提取物質(zhì)的性質(zhì)，采用不同濃度的乙醇進行提取。用乙醇提取比用水量較少，提取時間短，溶解出的水溶性雜質(zhì)也少。乙醇為有機溶劑，雖易燃，但毒性小，價格便宜，來源方便，有一定設備即可回收反復使用，而且乙醇的提取液不易發(fā)霉變質(zhì)。由于這些原因，用乙醇提取的方法是歷來最

8、常用的方法之一。甲醇的性質(zhì)和乙醇相似，沸點較低（64），但有毒性，使用時應注意。3）親脂性的有機溶劑：也就是一般所說的與水不能混溶的有機溶劑，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。這些溶劑的選擇性能強，不能或不容易提出親水性雜質(zhì)。但這類溶劑揮發(fā)性大，多易燃（氯仿除外），一般有毒，價格較貴，設備要求較高，且它們透入植物組織的能力較弱，往往需要長時間反復提取才能提取完全。如果藥材中含有較多的水分，用這類溶劑就很難浸出其有效成分，因此，大量提取中草藥原料時，直接應用這類溶劑有一定的局限性。3提取方法：用溶劑提取中草藥成分，、常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。同時，原

9、料的粉碎度、提取時間、提取溫度、設備條件等因素也都能影響提取效率，必須加以考慮。1）浸漬法：浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝人適當?shù)娜萜髦?，加入適宜的溶劑（如乙醇、稀醇或水），浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡單易行，但浸出率較差，且如用水為溶劑，其提取液易于發(fā)霉變質(zhì)）須注意加入適當?shù)姆栏瘎?）滲濾法：滲濾法是將中草藥粉末裝在滲濾器中，不斷添加新溶劑，使其滲透過藥材，自上而下從滲濾器下部流出浸出液的一種浸出方法，當溶劑滲進藥粉溶出成分比重加大而向下移動時，上層的溶液或稀浸液便置換其位置，造成良好的濃度差，使擴散能較好地進行，故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應控制流速，在滲濾過程中隨時自藥面上補充新

10、溶劑，使藥材中有效成分充分浸出為止。或當滲濾液顏色極淺或滲濾液的體積相當于原藥材重的10倍時，便可認為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀滲濾液作為另一批新原料的溶劑之用。3）煎煮法：煎煮法是我國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿，不宜用鐵鍋，以免藥液變色。直火加熱時最好時常攪拌，以免局部藥材受熱太高，容易焦糊。有蒸汽加熱設備的藥廠，多采用大反應鍋、大銅鍋、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。還可將數(shù)個煎煮器通過管道互相連接，進行連續(xù)煎浸。4）回流提取法：應用有機溶劑加熱提取，需采用回流加熱裝置，以免溶劑揮發(fā)損失。小量操作時，可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器

11、。瓶內(nèi)裝藥材約為容量的，溶劑浸過藥材表面約12cm。在水浴中加熱回流，一般保持沸騰約一小時后放冷過濾，再在藥渣中加溶劑，作第二、三次加熱回流分別約半小時，或至基本提凈有效成分為止。此法提取效率較冷浸法高，大量生產(chǎn)中多采用連續(xù)提取法。5）連續(xù)提取法：應用揮發(fā)性有機溶劑提取中草藥有效成分，不論小型實驗或大型生產(chǎn)，均以連續(xù)提取法為好，而且需用溶劑量較少，提取成分也較完全。實驗室常用脂肪提取器或稱索氏提取器。連續(xù)提取法，一般需數(shù)小時才能提取完全。提取成分受熱時間較長，遇熱不穩(wěn)定易變化的成分不宜采用此法。（二）水蒸氣蒸餾法：。水蒸氣蒸餾法，適用于能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞的中草藥成分的提取。此類成分的沸點

12、多在100以上，與水不相混溶或僅微溶，且在約100時存一定的蒸氣壓。當與水在一起加熱時，其蒸氣壓和水的蒸氣壓總和為一個大氣壓時，液體就開始沸騰，水蒸氣將揮發(fā)性物質(zhì)一并帶出。例如中草藥中的揮發(fā)油，某些小分子生物堿一麻黃堿、蕭堿、檳榔堿，以及某些小分子的酚性物質(zhì)。牡丹酚（paeonol）等，都可應用本法提取。有些揮發(fā)性成分在水中的溶解度稍大些，常將蒸餾液重新蒸餾，在最先蒸餾出的部分，分出揮發(fā)油層，或在蒸餾液水層經(jīng)鹽析法并用低沸點溶劑將成分提取出來。例如玫瑰油、原白頭翁素（protoanemonin）等的制備多采用此法。（三）升華法：固體物質(zhì)受熱直接氣化，遇冷后又凝固為固體化合物，稱為升華。中草藥中

13、有一些成分具有升華的性質(zhì)，故可利用升華法直接自中草藥中提取出來。例如樟木中升華的樟腦（camphor），在本草綱目中已有詳細的記載，為世界上最早應用升華法制取藥材有效成分的記述。茶葉中的咖啡堿在178以上就能升華而不被分解。游離羥基蒽醌類成分，一些香豆素類，有機酸類成分，有些也具有升華的性質(zhì)。例如七葉內(nèi)酯及苯甲酸等。升華法雖然簡單易行，但中草藥炭化后，往往產(chǎn)生揮發(fā)性的焦油狀物，粘附在升華物上，不易精制除去，其次，升華不完全，產(chǎn)率低，有時還伴隨有分解現(xiàn)象。B分離和純化：上述提取法所得到的中草藥提取液或提取物仍然是混合物，需進一步除去雜質(zhì)，分離并進行精制。具體的方法隨各中草藥的性質(zhì)不同而異，以后將

14、通過實例加以敘述，此處只作一般原則性的討論。（一）溶劑分離法：一般是將上述總提取物，選用三、四種不同極性的溶劑，由低極性到高極性分步進行提取分離。水浸膏或乙醇浸膏常常為膠狀物，難以均勻分散在低極性溶劑中，故不能提取完全，可拌入適量惰性填充劑，如硅藻土或纖維粉等，然后低溫或自然干燥，粉碎后，再以選用溶劑依次提取，使總提取物中各組成成分，依其在不同極性溶劑中溶解度的差異而得到分離。例如粉防己乙醇浸膏，堿化后可利用乙醚溶出脂溶性生物堿，再以冷苯處理溶出粉防己堿，與其結(jié)構(gòu)類似的防己諾林堿比前者少一甲基而有一酚羥基，不溶于冷苯而得以分離。利用中草藥化學成分，在不同極性溶劑中的溶解度進行分離純化，是最常用

15、的方法。廣而言之，自中草藥提取溶液中加入另一種溶劑，析出其中某種或某些成分，或析出其雜質(zhì)，也是一種溶劑分離的方法。中草藥的水提液中常含有樹膠、粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)、糊化淀粉等，可以加入一定量的乙醇，使這些不溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出，而達到與其它成分分離的目的。例如自中草藥提取液中除去這些雜質(zhì)，或自白及水提取液中獲得白及膠，可采用加乙醇沉淀法；自新鮮括樓根汁中制取天花粉素，可滴入丙酮使分次沉淀析出。目前，提取多糖及多肽類化合物，多采用水溶解、濃縮、加乙醇或丙酮析出的辦法。此外，也可利用其某些成分能在酸或堿中溶解，又在加堿或加酸變更溶液的pH后，成不溶物而析出以達到分離。例如內(nèi)酯類化合物不溶于水，

16、但遇堿開環(huán)生成羧酸鹽溶于水，再加酸酸化，又重新形成內(nèi)酯環(huán)從溶液中析出，從而與其它雜質(zhì)分離；生物堿一般不溶于水，遇酸生成生物堿鹽而溶于水，再加堿堿化，又重新生成游離生物堿。這些化合物可以利用與水不相混溶的有機溶劑進行萃取分離。一般中草藥總提取物用酸水、堿水先后處理，可以分為三部分：溶于酸水的為堿性成分（如生物堿），溶于堿水的為酸性成分（如有機酸），酸、堿均不溶的為中性成分（如甾醇）。還可利用不同酸、堿度進一步分離，如酸性化臺物可以分為強酸性、弱酸性和酷熱酚性三種，它們分別溶于碳酸氫鈉、碳酸鈉和氫氧化鈉，借此可進行分離。有些總生物堿，如長春花生物堿、石蒜生物堿，可利用不同pH值進行分離。但有些特殊

17、情況，如酚性生物堿紫董定堿（corydine）在氫氧化鈉溶液中仍能為乙醚抽出，蝙蝠葛堿（dauricins）在乙醚溶液中能為氫氧化鈉溶液抽出，而溶于氯仿溶液中則不能被氫氧化鈉溶液抽出；有些生物堿的鹽類，如四氫掌葉防己堿鹽酸鹽在水溶液中仍能為氯仿抽出。這些性質(zhì)均有助于各化合物的分離純化。（二）兩相溶劑萃取法：1萃取法：兩相溶劑提取又簡稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離的方法。萃取時如果各成分在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高、如果在水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機溶劑，如苯、氯仿或乙醚進行兩相萃取，如果有效成分是偏于親水性

18、的物質(zhì)，在親脂性溶劑中難溶解，就需要改用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。還可以在氯仿、乙醚中加入適量乙醇或甲醇以增大其親水性。提取黃酮類成分時，多用乙酸乙脂和水的兩相萃取。提取親水性強的皂甙則多選用正丁醇、異戊醇和水作兩相萃取。不過，一般有機溶劑親水性越大，與水作兩相萃取的效果就越不好，因為能使較多的親水性雜質(zhì)伴隨而出，對有效成分進一步精制影響很大。兩相溶劑萃取在操作中還要注意以下幾點：1）先用小試管猛烈振搖約1分鐘，觀察萃取后二液層分層現(xiàn)象。如果容易產(chǎn)生乳化，大量提取時要避免猛烈振搖，可延長萃取時間。如碰到乳化現(xiàn)象，可將乳化層分出，再用新溶劑萃取；或?qū)⑷榛瘜映闉V，或?qū)⑷榛瘜由陨约訜?；?/p>

19、較長時間放置并不時旋轉(zhuǎn)，令其自然分層。乳化現(xiàn)象較嚴重時，可以采用二相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置。2） 水提取液的濃度最好在比重1112之間，過稀則溶劑用量太大，影響操作。3） 溶劑與水溶液應保持一定量的比例，第一次提取時，溶劑要多一些，一般為水提取液的1/3，以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6。4）一般萃取34次即可。但親水性較大的成分不易轉(zhuǎn)入有機溶劑層時，須增加萃取次數(shù)，或改變萃取溶劑。萃取法所用設備，如為小量萃取，可在分液漏斗中進行；如系中量萃取，可在較大的適當?shù)南驴谄恐羞M行。在工業(yè)生產(chǎn)中大量萃取，多在密閉萃取罐內(nèi)進行，用攪拌機攪拌一定時間，使二液充分混合，再放置令其分層；有時將兩相溶液噴

20、霧混含，以增大萃取接觸，提高萃取效率，也可采用二相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置。2逆流連續(xù)萃取法：是一種連續(xù)的兩相溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多的萃取管。管內(nèi)用小瓷圈或小的不銹鋼絲圈填充，以增加兩相溶劑萃取時的接觸面。例如用氯仿從川楝樹皮的水浸液中萃取川楝素。將氯仿盛于萃取管內(nèi)，而比重小于氯仿的水提取濃縮液貯于高位容器內(nèi)，開啟活塞，則水浸液在高位壓力下流入萃取管，遇瓷圈撞擊而分散成細粒，使與氯仿接觸面增大，萃取就比較完全。如果一種中草藥的水浸液需要用比水輕的苯、乙酸乙酯等進行萃取，則需將水提濃縮液裝在萃取管內(nèi)，而苯、乙酸乙酯貯于高位容器內(nèi)。萃取是否完全，可取樣品用薄層層析、紙層析及顯色反應或

21、沉淀反應進行檢查。3逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）：逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法與兩相溶劑逆流萃取法原理一致，但加樣量一定，并不斷在一定容量的兩相溶劑中，經(jīng)多次移位萃取分配而達到混合物的分離。本法所采用的逆流分布儀是由若干乃至數(shù)百只管子組成。若無此儀器，小量萃取時可用分液漏斗代替。預先選擇對混合物分離效果較好，即分配系數(shù)差異大的兩種不相混溶的溶劑。并參考分配層析的行為分析推斷和選用溶劑系統(tǒng)，通過試驗測知要經(jīng)多少次的萃取移位而達到真正的分離。逆流分配法對于分離具有非常相似性質(zhì)的混合物，往往可以取得良好的效果。但操作時間長

22、，萃取管易因機械振蕩而損壞，消耗溶劑亦多，應用上常受到一定限制。4液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法。為近年來在逆流分配法基礎上改進的兩相溶劑萃取法。對溶劑系統(tǒng)的選擇基本同逆流分配法，但要求能在短時間內(nèi)分離成兩相，并可生成有效的液滴。由于移動相形成液滴，在細的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進溶質(zhì)在兩相溶劑中的分配，故其分離效果往往比逆流分配法好。且不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，用氮氣壓驅(qū)動移動相，被分離物質(zhì)不會因遇大氣中氧氣而氧化。本法必須選用能生成液滴的溶劑系統(tǒng)，且對高分子化合物的分離效果較差，處理樣品量小（1克以下），并要有一定設備。應用液滴逆流分配法曾有效地分

23、離多種微量成分如柴胡皂甙原小檗堿型季銨堿等。液滴逆流分配法的裝置，近年來雖不斷在改進，但裝置和操作較繁。目前，對適用于逆流分配法進行分離的成分，可采用兩相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置或分配柱層析法進行。（三）沉淀法：是在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。1 鉛鹽沉淀法：鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。由于醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇溶液中，能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。中性醋酸鉛可與酸性物質(zhì)或某些酚性物質(zhì)結(jié)合成不溶性鉛鹽。因此，常用以沉淀有機酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等。

24、可與堿式醋酸鉛產(chǎn)生不溶性鉛鹽或絡合物的范圍更廣。通常將中草藥的水或醇提取液先加入醋酸鉛濃溶液，靜置后濾出沉淀，并將沉淀洗液并入濾液，于濾液中加堿式醋酸鉛飽和溶液至不發(fā)生沉淀為止，這樣就可得到醋酸鉛沉淀物、堿式醋酸鉛沉淀物及母液三部分。 然后將鉛鹽沉淀懸浮于新溶劑中，通以硫化氫氣體，使分解并轉(zhuǎn)為不溶性硫化鉛而沉淀。含鉛鹽母液亦須先如法脫鉛處理，再濃縮精制。硫化氫脫鉛比較徹底，但溶液中可能存有多余的硫化氫，必須先通人空氣或二氧化碳讓氣泡帶出多余的硫化氫氣體，以免在處理溶液時參與化學反應。新生態(tài)的硫化鉛多為膠體沉淀，能吸咐藥液中的有效成分，要注意用溶劑處理收回。脫鉛方法，也可用硫酸、磷酸、硫酸鈉、磷

25、酸鈉等除鉛，但硫酸鉛、磷酸鉛在水中仍有一定的溶解度，除鉛不徹底。用陽離子交換樹脂脫鉛快而徹底，但要注意藥液中某些有效成分也可能被交換上去，同時脫鉛樹脂再生也較困難。還應注意脫鉛后溶液酸度增加，有時需中和后再處理溶液，有時可用新制備的氫氧化鉛、氫氧化鋁、氫氧化銅或碳酸鉛、明礬等代替醋酸鉛、堿式醋酸鉛。例如在黃芩水煎液中加入明礬溶液，黃芩甙就與鋁鹽絡合生成難溶于水的絡化物而與雜質(zhì)分離，這種絡化物經(jīng)用水洗凈就可直接供藥用。2 試劑沉淀法：例如在生物堿鹽的溶液中，加入某些生物堿沉淀試劑（見生物堿性質(zhì)下），則生物堿生成不溶性復鹽而析出。水溶性生物堿難以用萃取法提取分出，常加入雷氏銨鹽使生成生物堿雷氏鹽沉

26、淀析出。又如橙皮甙、蘆丁、黃芩甙、甘草皂甙均易溶于堿性溶液，當加入酸后可使之沉淀析出。某些蛋白質(zhì)溶液，可以變更溶液的pH值利用其在等電點時溶解度最小的性質(zhì)而使之沉淀析出。此外，還可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質(zhì)；膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂甙等。可根據(jù)中草藥有效成分和雜質(zhì)的性質(zhì)，適當選用。（四）鹽析法：鹽析法是在中草藥的水提液中、加入無機鹽至一定濃度，或達到飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用作鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。例如三七的水提取液中加硫酸鎂至飽和狀態(tài)，三七皂甙乙即可沉淀析出，自黃藤中提取掌葉防己堿，自三顆針中提取小檗堿在生產(chǎn)上都

27、是用氯化鈉或硫酸按鹽析制備。有些成分如原白頭翁素、麻黃堿、苦參堿等水溶性較大，在提取時，亦往往先在水提取液中加入一定量的食鹽，再用有機溶劑萃取。（五）透析法：透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達到分離的方法。例如分離和純化皂甙、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等物質(zhì)時，可用透析法以除去無機鹽、單糖、雙糖等雜質(zhì)。反之也可將大分子的雜質(zhì)留在半透膜內(nèi)，而將小分子的物質(zhì)通過半透膜進入膜外溶液中，而加以分離精制：透析是否成功與透析膜的規(guī)格關系極大。透析膜的膜孔有大有小，要根據(jù)欲分離成分的具體情況而選擇。透析膜有動物性膜、火棉膠膜、羊皮紙膜（硫酸紙膜）、蛋白質(zhì)膠膜、玻璃紙膜等

28、。油常多用市售的玻璃紙或動物性半透膜扎成袋狀，外面用尼龍網(wǎng)袋加以保護，小心加入欲透析的樣品溶液，懸掛在清水容器中。經(jīng)常更換清水使透析膜內(nèi)外溶液的濃度差加大，必要時適當加熱，并加以攪拌，以利透析速度加快。為了加快透析速度，還可應用電透析法，即在半在半透膜旁邊純?nèi)軇﹥啥朔胖枚€電極，接通電路，則透析膜中的帶有正電荷的成分如無機陽離子、生物堿等向陰極移動，而帶負電共荷的成分如無機陰離子、有機酸等則向陽極移動，中性化合物及高分子化合物則留在透析膜中。透析是否完全，須取透析膜內(nèi)溶液進行定性反應檢查。一般透析膜可以自制：動物半透膜如豬、牛的膀胱膜、用水洗凈，再以乙醚脫脂，即可供用；羊皮紙膜可將濾紙浸入50

29、的硫酸1560分鐘，取出鋪在板上，以水沖洗制得。其膜孔大小與硫酸濃度、浸泡時間以及用水沖洗速度有關；火棉膠膜系將火棉膠溶于乙醚及無水乙醇，涂在板上，干后放置水中即可供用，其膜孔大小與溶劑種類、溶劑揮發(fā)速度有關，溶劑中加入適量水可使膜孔增大，加入少量醋酸可使膜孔縮?。坏鞍踪|(zhì)膠（明膠）膜可用20明膠涂于細布上，陰干后放水中，再加甲醛使膜凝固，沖洗干凈即可供用。近來商品有透析膜管成品出售，國外習稱“ViskingDialysisTubing”，有各種大小厚度規(guī)格，可供不同大小分子量的多糖、多肽透析時選用。（六）結(jié)晶、重結(jié)晶和分步結(jié)晶法：鑒定中草藥化學成分，研究其化學結(jié)構(gòu)，必須首先將中草藥成分制備成單

30、體純品。在常溫下，物質(zhì)本身性質(zhì)是液體的化臺物，可分別用分餾法或?qū)游龇ㄟM行分離精制。一般他說，中草藥化學成分在常溫下多半是固體的物質(zhì)，都具有結(jié)晶他的通性，可以根據(jù)溶解度的不同用結(jié)晶法來達到分離精制的目的。研究中草藥化學成分時，一旦獲得結(jié)晶，就能有效地進一步精制成為單體純品。純化臺物的結(jié)晶有一定的熔點和結(jié)晶學的特征，有利于鑒定。如果鑒定的物質(zhì)不是單體純品，不但不能得出正確的結(jié)論，還會造成工作上的浪費。因此，求得結(jié)晶并制備成單體純品，就成為鑒定中草藥成分、研究其分子結(jié)構(gòu)重要的一步。1雜質(zhì)的除去：中草藥經(jīng)過提取分離所得到的成分，大多仍然含有雜質(zhì)，或者是混合成分。有時即使有少量或微量雜質(zhì)存在，也能阻礙或

31、延緩結(jié)晶的形成。所以在制備結(jié)晶時，必須注意雜質(zhì)的干擾，應力求盡可能除去。有時可選用溶劑溶出雜質(zhì)，或只溶出所需要的成分。有時可用少量活性炭等進行脫色處理，以除去有色雜質(zhì)。有時可通過氧化鋁，硅膠或硅藻土短柱處理后，再進行制備結(jié)晶。但應用吸附劑除去雜質(zhì)時，要注意所需要的成分也可能被吸附而損失。此外，層析法更是分離制備單體純品所常用的有效方法。 如果一再處理仍未能使近于純品的成分結(jié)晶化，則可先制備其晶態(tài)的衍生物，再回收原物，可望得到結(jié)晶。例如游離生物堿可制備各種生物堿鹽類，羥基化合物可轉(zhuǎn)變成乙酸化物，碳基化臺物可制備成苯蹤衍生物結(jié)晶。美登堿在原料中含量少，且反復分離精制難以得到結(jié)晶，但制備成3一滇丙基

32、美登堿結(jié)晶后，再經(jīng)水解除去澳丙基，美登堿就能制備成為結(jié)晶。2溶劑的選擇；制備結(jié)晶，要注意選擇合宜的溶劑和應用適量的溶劑。合宜的溶劑，最好是在冷時對所需要的成分溶解度較小，而熱時溶解度較大。溶劑的沸點亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋等。但有些化合物在一般溶劑中不易形成結(jié)晶，而在某些溶劑中則易于形成結(jié)晶。例如葛根素、逆沒食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成結(jié)晶，大黃素（emodin）在吡啶中易于結(jié)晶，萱草毒素（hemerocallin）在N，N一二甲基甲酞胺（DMF）中易得到結(jié)晶，而穿心蓮亞硫酸氫鈉加成物在丙酮一水中較易得到結(jié)晶。又如蝙蝠葛堿通常為無定形粉未，但能和

33、氯仿或乙醚形成為加成物結(jié)晶。3結(jié)晶溶液的制備：制備結(jié)晶的溶液，需要成為過飽和的溶液。一般是應用適量的溶劑在加溫的情況下，將化合物溶解再放置冷處。如果在室溫中可以析出結(jié)晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴隨結(jié)晶析出更多的雜質(zhì)?！靶律鷳B(tài)”的物質(zhì)即新游離的物質(zhì)或無定形的粉未狀物質(zhì)，遠較晶體物質(zhì)的溶解度大，易于形成過飽和溶液。一般經(jīng)過精制的化合物，在蒸去溶劑抽松為無定形粉未時就是如此，有時只要加入少量溶劑，往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出結(jié)晶。例如長春花總?cè)鯄A部分抽松后加入15倍量的甲醇溶解，放置后很訣析出長春堿結(jié)晶。又如蝙蝠葛堿在乙醚中很難溶解，但當其鹽的水溶液用氨液堿化，并立即用乙醚萃取，所得的乙醚

34、溶液，放置后即可析出蝙蝠葛堿的乙醚加成物結(jié)晶。制備結(jié)晶溶液，除選用單一溶劑外，也常采用混合溶劑。一般是先將化合物溶于易溶的溶劑中，再在室溫下滴加適量的難溶的溶劑，直至溶液微呈渾濁，并將此溶液微微加溫，使溶液完全澄清后放置。例如J一細辛醚重結(jié)晶時，可先溶于乙醇，再滴加適量水，即可析出很好的結(jié)晶。又如自虎杖中提取水溶性的虎杖甙時，在已精制飽和的水溶液上添加一層乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性雜質(zhì)，又可降低水的極性，促使虎杖俄的結(jié)晶化。自秦皮中提取七葉甙（秦皮甲素），也可運用這樣的辦法。結(jié)晶過程中，一般是溶液濃度高，降溫訣，析出結(jié)晶的速度也快些。但是其結(jié)晶的顆粒較小，雜質(zhì)也可能多些。有時自溶液中

35、析出的速度太快，超過化合物晶核的形成勸分子定向排列的速度，往往只能得到無定形粉未。有時溶液太濃，粘度大反而不易結(jié)晶化。如果溶液濃度適當，溫度慢慢降低，有可能析出結(jié)晶較大而純度較高的結(jié)晶。有的化合物其結(jié)晶的形成需要較長的時間，例如鈴蘭毒甙等，有時需放置數(shù)天或更長的時間。4制備結(jié)晶操作：制備結(jié)晶除應注意以上各點外，在放置過程中，最好先塞緊瓶塞，避免液面先出現(xiàn)結(jié)晶，而致結(jié)晶純度較低。如果放置一段時間后沒有結(jié)晶析出，可以加入極微量的種晶，即同種化合物結(jié)晶的微小顆粒。加種晶是誘導晶核形成常用而有效的手段。一般他說，結(jié)晶化過程是有高度選擇性的，當加入同種分子或離子，結(jié)晶多會立即長大。而且溶液中如果是光學異

36、構(gòu)體的混合物，還可依種晶性質(zhì)優(yōu)先析出其同種光學異構(gòu)體。沒有種晶時，可用玻璃棒蘸過飽和溶液一滴，在空氣中任溶劑揮散，再用以磨擦容器內(nèi)壁溶液邊緣處，以誘導結(jié)晶的形成。如仍無結(jié)晶析出，可打開瓶塞任溶液逐步揮散，慢慢析晶?；蛄磉x適當溶劑處理，或再精制一次，盡可能除盡雜質(zhì)后進行結(jié)晶操作。5重結(jié)晶及分步結(jié)晶：在制備結(jié)晶時，最好在形成一批結(jié)晶后，立即傾出上層溶液，然后再放置以得到第二批結(jié)晶。晶態(tài)物質(zhì)可以用溶劑溶解再次結(jié)晶精制。這種方法稱為重結(jié)晶法。結(jié)晶經(jīng)重結(jié)晶后所得各部分母液，再經(jīng)處理又可分別得到第二批、第三批結(jié)晶。這種方法則稱為分步結(jié)晶法或分級結(jié)晶法。晶態(tài)物質(zhì)在一再結(jié)晶過程中，結(jié)晶的析出總是越來越快，純度

37、也越來越高。分步結(jié)晶法各部分所得結(jié)晶，其純度往往有較大的差異，但?？色@得一種以上的結(jié)晶成分，在未加檢查前不要貿(mào)然混在一起。6結(jié)晶純度的判定：化合物的結(jié)晶都有一定的結(jié)晶形狀、色澤、熔點和熔距，一可以作為鑒定的初步依據(jù)。這是非結(jié)晶物質(zhì)所沒有的物理性質(zhì)?；衔锝Y(jié)晶的形狀和熔點往往因所用溶劑不同而有差異。原托品堿在氯仿中形成棱往狀結(jié)晶，熔點207；在丙酮中則形成半球狀結(jié)晶，熔點203；在氯仿和丙酮混合溶劑中則形成以上兩種晶形的結(jié)晶。又如N一氧化苦參堿，在無水丙酮中得到的結(jié)晶熔點208，在稀丙酮（含水）析出的結(jié)晶為7780。所以文獻中常在化合物的晶形、熔點之后注明所用溶劑。一般單體純化合物結(jié)晶的熔距較窄

38、，有時要求在05左右，如果熔距較長則表示化合物不純。但有些例外情況，特別是有些化合物的分解點不易看得清楚。也有的化合物熔點一致，熔距較窄，但不是單體。一些立體異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)非常類似的混合物，常有這樣的現(xiàn)象。還有些化合物具有雙熔點的特性，即在某一溫度已經(jīng)全部融熔，當溫度繼續(xù)上升時又固化，再升溫至一定溫度又熔化或分解。如防己諾林堿在1760C時熔化，至200時又固化，再在2420C時分解。中草藥成分經(jīng)過同一溶劑進行三次重結(jié)晶，其晶形及熔點一致，同時在薄層層析或紙層層析法經(jīng)數(shù)種不同展開劑系統(tǒng)檢定，也為一個斑點者，一般可以認為是一個單體化合物。但應注意，有的化合物在一般層析條件下，雖然只呈現(xiàn)一個斑點，但

39、并不一定是單體成分。例如鹿含草中主成分為高熊果砍，異高熊果甙極難用一般方法分離，經(jīng)反復結(jié)晶后，在紙層及聚酞胺薄層上都只有一個斑點，易誤認為單一成分，但測其熔點在115125，熔距很長。經(jīng)制備其甲醚后，再經(jīng)紙層層析檢定，可以出現(xiàn)兩個斑點，異高熊果甙的比移值大于高熊果甙。又如水菖蒲根莖揮發(fā)油中的一細辛醚和一細辛醚，在一般薄層上均為一個斑點，前者為結(jié)晶，熔點63，后者為液體沸點296，用硝酸銀薄層或氣相層忻很容易區(qū)分。有時個別化合物（如氨基酸）可能部分地與層析紙或薄層上的微量金屬離子（如Cu）、酸或堿形成絡合物、鹽或分解而產(chǎn)生復斑。因此，判定結(jié)晶純度時，要依據(jù)具體情況加以分析。此外，高壓液譜、氣相層

40、析、紫外光譜等，均有助于檢識結(jié)晶樣品的純度。C.層析法：層析技術的應用與發(fā)展，對于植物各類化學成分的分離鑒定工作起到重大的推動作用。如中藥丹參的化學成分在30年代僅從中分離到3種脂溶性色素，分別稱為丹參酮、。但以后進一步的研究，發(fā)現(xiàn)除丹參酮為純品外，、均為混合結(jié)晶。此后通過各種層析方法，迄今已發(fā)現(xiàn)15種單體（其中有4種為我國首次發(fā)現(xiàn)）。目前新的層析技術不斷發(fā)展，隨著層析理論和電子學、光學、計算機等技術的應用，層析技術已日趨完善。一層析法的基本原理：層析過程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相”溶劑之間的分配系數(shù)之差（分配層析），組分對吸附劑吸附能力不同（吸附層析），和寓子交換，分子的大小（排阻層析

41、）而分離。通常又將一般的以流動相為氣體的稱為氣相層析，流動相為液體的稱為液相層析。一、 吸附層析法（AdsorptionChromatography）（一）吸附劑、溶劑與被分離物性質(zhì)的關系：液一固吸附層析是運用較多的一種方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)這三個因素。1 吸附劑：常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。（1） 硅膠：層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，

42、同時在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量多少有關。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17，吸附力極弱不能用作為吸附劑，但可作為分配層析中的支持劑。對硅膠的活化，當硅膠加熱至100110時，硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當溫度升高至500時，硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往，就不再有吸附劑的性質(zhì)，雖用水處理亦不能恢復其吸附活性。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進行（一般在170cC以上即有少量結(jié)合水失去）。硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。同時硅膠又是一種弱酸

43、性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當遇到較強的堿注化臺物，則可因離子交換反應而吸附堿性化合物。（2）氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離。因為有時堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級反應，如異構(gòu)化、氧化、消除反應等。除去氧化鋁中絢堿性雜質(zhì)可用水洗至中性，稱為中性氧化鋁。中性氧化鋁仍屬于堿性吸附劑的范疇，本適用于酸性成分的分離。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì)，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3一或CI一的陰離子，從而具有離于交換

44、劑的性質(zhì)，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁，用于拄層析的，其粒度要求在100160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小于160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴散。樣品與氧化鋁的用量比，一般在1：2050之間層析柱的內(nèi)徑與柱長比例在1：10-20之向。在用溶劑沖洗柱時，流速不宜過快，洗脫液的流速一般以每半1小時內(nèi)流出液體的毫升數(shù)與所用吸附劑的重量（克）相等為合適。（3）活性炭：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，最好選用顆?；钭⑻浚魹榛钚蕴考毞?，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并

45、裝柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分離水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙?；钚蕴康挠袨槲阶饔?，在水溶液中最強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔?，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。2溶劑：層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關系極大。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者

46、結(jié)合起來加以考慮在用極性吸附劑進行層析時，當被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數(shù)（）來表示

47、。介電常數(shù)高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強。3被分離物質(zhì)的性質(zhì)：被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強。當然，中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團的數(shù)目愈多，被吸附的住能就會更大些，在同系物中碳原子數(shù)目少些，被吸附也會強些?？傊?，只要兩個成分在結(jié)構(gòu)上存在差別，就有可能分離，關鍵在于條件的選擇

48、。要根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，吸附劑的吸附強度，與溶劑的性質(zhì)這三者的相互關系來考慮。首先要考慮被分離物質(zhì)的極性。如被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團，則需選用吸附性較強的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進行洗脫。但多數(shù)中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般級）。采用的洗脫劑極性應由小到大按某一梯度遞增，或可應用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關系?，F(xiàn)以實例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當以硅

49、膠為吸附劑時，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。又如對于C-27甾體皂甙元類成分，能因其分字中羥基數(shù)目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應降低，亦即采用苯或含5氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來。這一例子說明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時，需用不同的溶劑才能達到相同的分離效果，從而說明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關系。（二）簿層層析：薄層層析是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進行層析時一即稱薄層層析。其原理與柱層析基本相似。1薄層層析的特點：薄層層析在應用與操作方面的特點與柱層析的比較。2吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層