高級生物化學(xué)PPT_蛋白質(zhì)的研究方法ppt課件

1、1 蛋白質(zhì)的研討方法蛋白質(zhì)的研討方法 2主要內(nèi)容v蛋白質(zhì)對象的選擇和樣品的獲取蛋白質(zhì)對象的選擇和樣品的獲取v蛋白質(zhì)的檢測和鑒定蛋白質(zhì)的檢測和鑒定v蛋白質(zhì)的構(gòu)造分析蛋白質(zhì)的構(gòu)造分析v蛋白質(zhì)生物功能檢測蛋白質(zhì)生物功能檢測 3 蛋白質(zhì)對象的選擇和樣品的蛋白質(zhì)對象的選擇和樣品的獲取獲取4 一、研討對象的選擇一、研討對象的選擇無論何種來源的生物資料普通都含有無論何種來源的生物資料普通都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)分子；成千上萬種不同的蛋白質(zhì)分子；在一種生物組織中，同時存在著多種在一種生物組織中，同時存在著多種蛋白質(zhì)組分。雖然它們都具有肽鏈構(gòu)蛋白質(zhì)組分。雖然它們都具有肽鏈構(gòu)造，但在分子大小、極性以造，但在分

2、子大小、極性以及電荷上會有所差別。及電荷上會有所差別。 5 選擇研討蛋白的原那么：選擇研討蛋白的原那么： 在組織中含量比較高在組織中含量比較高 相對比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)如血液中的相對比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)如血液中的HbHb；肌肉中；肌肉中的的 肌球蛋白和肌動蛋白等肌球蛋白和肌動蛋白等從方式生物基因組測序結(jié)果來看，每一種生物有機從方式生物基因組測序結(jié)果來看，每一種生物有機體體內(nèi)都還有大量的蛋白質(zhì)內(nèi)都還有大量的蛋白質(zhì)5050左右從來沒有被研左右從來沒有被研討討過。過。6獲取蛋白樣品的方法：獲取蛋白樣品的方法： 直接從生物組織中提純蛋白直接從生物組織中提純蛋白為主為主根據(jù)基因組測序獲得的信息根據(jù)基因組測序獲得

3、的信息 7運用各種分辨效果好的化學(xué)及物理化學(xué)運用各種分辨效果好的化學(xué)及物理化學(xué)方法方法8直接從生物組織中提純蛋白直接從生物組織中提純蛋白蛋白質(zhì)的分別純化包括以下過程：蛋白質(zhì)的分別純化包括以下過程：1.破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)抽提出來；破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)抽提出來； 2.將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級沉淀下來將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級沉淀下來; 鹽析法或有機溶劑鹽析法或有機溶劑法法3.運用層析法或電泳法使它們各自分開；運用層析法或電泳法使它們各自分開； 4.蛋白質(zhì)結(jié)晶；蛋白質(zhì)結(jié)晶；5.蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測定。蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測定。9u根據(jù)基因組測序獲得的信息根據(jù)基因組測序獲得的

4、信息u 1 1可以獲得所要研討的特定蛋白質(zhì)的可以獲得所要研討的特定蛋白質(zhì)的AAAA序列。序列。 u 先根據(jù)推出的先根據(jù)推出的AAAA序列合成對象蛋白中的一段序列合成對象蛋白中的一段肽，用它去獲肽，用它去獲 得有關(guān)的抗體，然后用抗體去探得有關(guān)的抗體，然后用抗體去探測蛋白質(zhì)的存在，甚至可以用抗體經(jīng)過親和層析測蛋白質(zhì)的存在，甚至可以用抗體經(jīng)過親和層析純化對象蛋白純化對象蛋白102 2去獲得有關(guān)基因的去獲得有關(guān)基因的cDNAcDNA全序列，然后全序列，然后經(jīng)過重組經(jīng)過重組DNADNA技術(shù)去表達重組蛋白。技術(shù)去表達重組蛋白。 有偏向，甚至完全是假象。有偏向，甚至完全是假象。 即使推測得到的蛋白質(zhì)編碼信息

5、是對的，即使推測得到的蛋白質(zhì)編碼信息是對的，在細胞內(nèi)還存在轉(zhuǎn)錄后的在細胞內(nèi)還存在轉(zhuǎn)錄后的RNARNA加工，翻譯后加工，翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾和加工等基因序列上目前的蛋白質(zhì)的修飾和加工等基因序列上目前還無法反映的信息。還無法反映的信息。11制備過程中本卷須知：制備過程中本卷須知： 要求自始至終堅持在天然形狀要求自始至終堅持在天然形狀 防止一切過激要素防止一切過激要素-如過酸或過堿，高溫，如過酸或過堿，高溫， 重金屬等的影響。重金屬等的影響。2. 2. 通常都在低溫條件下操作。通常都在低溫條件下操作。3. 3. 盡能夠使樣品中蛋白質(zhì)的濃度維持在較盡能夠使樣品中蛋白質(zhì)的濃度維持在較高高 程度。程度。1

6、2二、細胞的破碎二、細胞的破碎 少數(shù)蛋白質(zhì)少數(shù)蛋白質(zhì)-存在于細胞外面如血液存在于細胞外面如血液和體液中和體液中 大多數(shù)蛋白質(zhì)大多數(shù)蛋白質(zhì)-都存在于細胞的里面。都存在于細胞的里面。 普通固形生物資料首先都必需加以破碎，普通固形生物資料首先都必需加以破碎，以釋放出細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組分。以釋放出細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組分。 生物資料生物資料 必需新穎必需新穎要求：要求： 1. 資料資料 -80 2. 或者制成干粉或者制成干粉 3. 低溫存放低溫存放 破碎的方法：破碎的方法：機械破碎法：機械破碎法： 利用機械力的攪切作用，使細胞利用機械力的攪切作用，使細胞研碎研碎高速攪切器、玻璃勻漿器、家用高速攪切器、玻璃勻漿

7、器、家用攪肉器、研缽、攪肉器、研缽、玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器高壓破碎。高壓破碎。2.浸透破碎法：浸透破碎法： 利用低滲條件，使細胞溶脹破碎。利用低滲條件，使細胞溶脹破碎。 紅血球放于水中，便發(fā)生自溶。紅血球放于水中，便發(fā)生自溶。143.3.交替凍融法：交替凍融法： 生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細胞脹破。而使細胞脹破。 4. 4.超聲波法：超聲波法： 利用超聲波震蕩，使細胞膜上所受張利用超聲波震蕩，使細胞膜上所受張力不均而解體。力不均而解體。 5. 5.酶消化法：酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復(fù)合酶等利用蛋白酶、溶菌酶

8、、蝸牛復(fù)合酶等對對細胞膜或細胞壁的分解作用，使它們解體細胞膜或細胞壁的分解作用，使它們解體15按其所在位置大體可分為：按其所在位置大體可分為：兩種類型外周蛋白經(jīng)過次級鍵和外膜脂質(zhì)兩種類型外周蛋白經(jīng)過次級鍵和外膜脂質(zhì)的的極性頭螯合在一極性頭螯合在一同同 固有蛋白固有蛋白外周蛋白外周蛋白-選擇適當(dāng)離子強度及選擇適當(dāng)離子強度及pHpH的含有的含有EDTAEDTA的的 緩沖液抽提高鹽溶液緩沖液抽提高鹽溶液固有蛋白固有蛋白-嵌合在膜雙層中，它經(jīng)過疏水作嵌合在膜雙層中，它經(jīng)過疏水作用與用與 膜內(nèi)部脂質(zhì)層的疏水性尾部相膜內(nèi)部脂質(zhì)層的疏水性尾部相結(jié)合，結(jié)合， 具有具有螺旋構(gòu)造。螺旋構(gòu)造。三、去污劑處置溶解膜蛋

9、白三、去污劑處置溶解膜蛋白膜蛋白的處置：復(fù)雜膜蛋白的處置：復(fù)雜 細胞膜的構(gòu)造細胞膜的構(gòu)造17 膜固有蛋白的提取與細胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，根本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。 去污劑：去污劑：一類具有一類具有 親水性頭部親水性頭部 疏性尾巴疏性尾巴 的雙親性的雙親性amphipathic脂類分子脂類分子作用：作用： 既可以破壞細胞的磷脂雙層構(gòu)造，又可以與既可以破壞細胞的磷脂雙層構(gòu)造，又可以與具有疏水性外表的膜蛋白結(jié)合，從而阻止釋放具有疏水性外表的膜蛋白結(jié)合，從而阻止釋放出來的膜蛋白經(jīng)過疏水相互作用構(gòu)成大的、可出來的膜

10、蛋白經(jīng)過疏水相互作用構(gòu)成大的、可沉淀的聚集體。沉淀的聚集體。 19有的去污劑的親水性頭部可離子化即含有一帶電有的去污劑的親水性頭部可離子化即含有一帶電基團基團 如：如： 脫氧膽酸鈉脫氧膽酸鈉sodium deoxycholatesodium deoxycholate 十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉sodium dodecylsulfatesodium dodecylsulfate，SDSSDS有的去污劑不能解離，所以分子中短少帶電基團，有的去污劑不能解離，所以分子中短少帶電基團， 如：如： Triton X-100 Triton X-100， 辛基葡萄糖苷辛基葡萄糖苷( octylglucosi

11、de( octylglucoside20臨界微團濃度臨界微團濃度critical micelle concentration，CMC)： 每一種去污劑都具有一特征性的每一種去污劑都具有一特征性的CMC。 CMC值與其分子中疏水部分與親水部分的構(gòu)造有值與其分子中疏水部分與親水部分的構(gòu)造有 關(guān)。關(guān)。 當(dāng)當(dāng)去污劑去污劑低于此值的時候，去污劑分子在水溶液中低于此值的時候，去污劑分子在水溶液中將不構(gòu)成微團，到達此值的時候，微團開場構(gòu)成。將不構(gòu)成微團，到達此值的時候，微團開場構(gòu)成。 21 離子化去污劑離子化去污劑SDS：其其“疏水尾巴破壞蛋白質(zhì)分子的疏水尾巴破壞蛋白質(zhì)分子的疏水性部分的構(gòu)造，其帶電的疏水性

12、部分的構(gòu)造，其帶電的“頭頭部破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和離部破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和離子鍵。子鍵。作用的結(jié)果是：作用的結(jié)果是： 使任何蛋白不論是膜蛋白還使任何蛋白不論是膜蛋白還是水溶性蛋白都發(fā)生完全變性，是水溶性蛋白都發(fā)生完全變性，并溶解在水溶液中，同時失去生物并溶解在水溶液中，同時失去生物活性?；钚浴Ｔ诓糠智闆r下，當(dāng)去污劑被透析掉在部分情況下，當(dāng)去污劑被透析掉后，蛋白質(zhì)可以復(fù)性并恢復(fù)生物活后，蛋白質(zhì)可以復(fù)性并恢復(fù)生物活性。性。 22SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-SDS-polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide

13、gel electrophoresis，SDS-SDS-PAGEPAGE：就是利用就是利用SDSSDS的這種結(jié)合在整個蛋白分子上，并的這種結(jié)合在整個蛋白分子上，并使蛋白完全變性的特性。使蛋白完全變性的特性。這樣經(jīng)過這樣經(jīng)過SDSSDS變性的蛋白質(zhì)在電場中完全按大小變性的蛋白質(zhì)在電場中完全按大小別分開。別分開。 23非離子去污劑：非離子去污劑：相對溫暖，普通不會使蛋白量變性。只是將相對溫暖，普通不會使蛋白量變性。只是將蛋白質(zhì)分子從膜上溶解下來而已。蛋白質(zhì)分子從膜上溶解下來而已。當(dāng)當(dāng) 去污劑去污劑 其其CMCCMC值的時候，去污劑分子與值的時候，去污劑分子與膜蛋白外表的疏水區(qū)域結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水膜

14、蛋白外表的疏水區(qū)域結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水溶液中溶解而不聚集。溶液中溶解而不聚集。當(dāng)當(dāng) 去污劑去污劑 其其CMCCMC值的時候，去污劑分子將值的時候，去污劑分子將與膜磷脂一同構(gòu)成混合微團，膜蛋白以整合與膜磷脂一同構(gòu)成混合微團，膜蛋白以整合在微團中的方式存在。在微團中的方式存在。普通選擇非離子去污劑來堅持膜蛋白生物活普通選擇非離子去污劑來堅持膜蛋白生物活性性 25 四、蛋白分子的穩(wěn)定四、蛋白分子的穩(wěn)定防止蛋白質(zhì)分子能夠被同時釋放的蛋白防止蛋白質(zhì)分子能夠被同時釋放的蛋白質(zhì)水解酶降解、質(zhì)水解酶降解、Pr空間構(gòu)造能夠被溫度空間構(gòu)造能夠被溫度或化學(xué)試劑等環(huán)境要素破壞而喪失生物或化學(xué)試劑等環(huán)境要素破壞而喪失生物

15、學(xué)活性等。學(xué)活性等。處置：需求在緩沖液中參與蛋白酶抑制處置：需求在緩沖液中參與蛋白酶抑制劑；劑； 在低溫下操作；在低溫下操作； 參與穩(wěn)定劑參與穩(wěn)定劑(如甘油等如甘油等26五、細胞碎片的去除五、細胞碎片的去除離心離心( centrifugation) ( centrifugation) 原理：懸浮在溶液中的兩個或多個不同質(zhì)量原理：懸浮在溶液中的兩個或多個不同質(zhì)量或密度的顆粒如細胞、細胞器、大分子復(fù)或密度的顆粒如細胞、細胞器、大分子復(fù)合體、或分子等沉降到試管的底部的速度合體、或分子等沉降到試管的底部的速度是不一樣的，質(zhì)是不一樣的，質(zhì)量越大、或密度越高沉降的速度越快。量越大、或密度越高沉降的速度越快

16、。沉淀：固體性的細胞碎片和細胞器沉降到離沉淀：固體性的細胞碎片和細胞器沉降到離心管的心管的底部構(gòu)成；底部構(gòu)成；上清：絕大多數(shù)蛋白分子或蛋白復(fù)合體保管上清：絕大多數(shù)蛋白分子或蛋白復(fù)合體保管在細胞在細胞抽提液中即上清中抽提液中即上清中 27 六、目的蛋白質(zhì)的分別、純化六、目的蛋白質(zhì)的分別、純化 -蛋白質(zhì)的分級沉淀和層析分蛋白質(zhì)的分級沉淀和層析分別別將不同蛋白質(zhì)分開的性質(zhì)主要包括：將不同蛋白質(zhì)分開的性質(zhì)主要包括： 分子量的大小分子量的大小 帶電情況帶電情況 水溶性水溶性 與某種物質(zhì)的特異高親和與某種物質(zhì)的特異高親和力等力等 28蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)：蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)： 蛋白質(zhì)顆粒外表多為親水基團，可吸引

17、水分子，使顆粒外表成有一層水膜，蛋白質(zhì)顆粒相互隔開，不會聚集成大顆粒而沉淀。蛋白質(zhì)顆粒外表多為親水基團，可吸引水分子，使顆粒外表成有一層水膜，蛋白質(zhì)顆粒相互隔開，不會聚集成大顆粒而沉淀。 此外，蛋白質(zhì)外表可帶有電荷，可起膠粒穩(wěn)定的此外，蛋白質(zhì)外表可帶有電荷，可起膠粒穩(wěn)定的作用。作用。 假設(shè)去除蛋白質(zhì)膠體外表電荷和水化膜兩個穩(wěn)定要素假設(shè)去除蛋白質(zhì)膠體外表電荷和水化膜兩個穩(wěn)定要素 ，蛋白質(zhì)極易從溶液中析出，蛋白質(zhì)極易從溶液中析出 29#30 一蛋白質(zhì)的分級沉淀一蛋白質(zhì)的分級沉淀 常用的方法有：常用的方法有： 鹽析法鹽析法 有機溶劑法有機溶劑法31 鹽析法鹽析法 概念：將中性鹽參與蛋白質(zhì)溶液，破壞水

18、化膜概念：將中性鹽參與蛋白質(zhì)溶液，破壞水化膜和電荷而使蛋白質(zhì)沉淀，叫鹽析。各種蛋白質(zhì)和電荷而使蛋白質(zhì)沉淀，叫鹽析。各種蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度及鹽析所需的鹽濃度及pH不同，參與不同濃度的不同，參與不同濃度的中性鹽可使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀出來。中性鹽可使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀出來。 優(yōu)點：操作簡便優(yōu)點：操作簡便 對易變性的蛋白質(zhì)有一定的維護作用，對易變性的蛋白質(zhì)有一定的維護作用， 適用范圍非常廣泛。適用范圍非常廣泛。 缺陷：分辨才干差缺陷：分辨才干差32 1.根本原理根本原理在蛋白質(zhì)水溶液中添加無機鹽，可以產(chǎn)生兩種在蛋白質(zhì)水溶液中添加無機鹽，可以產(chǎn)生兩種影響：影響： (1)鹽離子與鹽離子與Pr分

19、子中的分子中的 極性基團極性基團 離子基團離子基團 作用作用 降低降低Pr分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度 。(2)鹽離子也與水這種偶極分子作用，使水分子的活鹽離子也與水這種偶極分子作用，使水分子的活 度降低，導(dǎo)致度降低，導(dǎo)致Pr水合程度的減少，從而趨使水合程度的減少，從而趨使Pr溶溶 解度解度 。33 * *鹽溶鹽溶salting in)-salting in)-當(dāng)溶液中的鹽離子強度比較當(dāng)溶液中的鹽離子強度比較低的時候，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的添加而低的時候，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的添加而添加，這種景象叫做添加，這種景象叫做. .* *鹽析鹽析salting

20、out )-salting out )-但當(dāng)溶液中的鹽離子強度但當(dāng)溶液中的鹽離子強度比較高的時候，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的添比較高的時候，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的添加而降低，這種景象叫做加而降低，這種景象叫做 . .一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有一不同的特異溶一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有一不同的特異溶解度。解度。 34 影響鹽析作用的要素影響鹽析作用的要素 1鹽的種類鹽的種類 2pH和溫度和溫度# 3蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度%351鹽的種類鹽的種類對同一種對同一種Pr而言，價數(shù)愈高的鹽離子，鹽析而言，價數(shù)愈高的鹽離子，鹽析才干才干也愈強也愈強: PO3-4SO42-C2O42-CHOHC

21、OO-2 ACCLNO3-Br -I- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ 負(fù)離子價數(shù)較高的中性鹽如硫酸鹽、磷酸負(fù)離子價數(shù)較高的中性鹽如硫酸鹽、磷酸鹽等的鹽等的Ks值常較一價中性鹽的值常較一價中性鹽的Ks值高。值高。 Ks:鹽析常數(shù)價數(shù)較高時，鹽析常數(shù)價數(shù)較高時，Ks 值也較大。值也較大。代表鹽析的效率，代表鹽析的效率， 是與是與Pr及鹽種類有關(guān)的特及鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。性常數(shù)。36硫酸銨常用鹽析劑硫酸銨常用鹽析劑 優(yōu)點：鹽析才干較強優(yōu)點：鹽析才干較強 具有較高的溶解度具有較高的溶解度 價錢低廉價錢低廉 不產(chǎn)生副作用。不產(chǎn)生副作用。 缺陷：緩沖才干較差缺陷：緩沖才干較差 pH難控制難控制3

22、72 2pHpH和溫度和溫度S S。代表蛋白質(zhì)在無機鹽溶液中的溶解度。代表蛋白質(zhì)在無機鹽溶液中的溶解度 除取決于除取決于PrPr的種類，還受的種類，還受pHpH及溫度影響及溫度影響: : pH=pI pH=pI時，時，S S。的數(shù)值極小。的數(shù)值極小 S S。隨溫度添加而減低。隨溫度添加而減低。鹽析過程中，假設(shè)增高溫度，有助于鹽析過程中，假設(shè)增高溫度，有助于PrPr的析出。的析出。# #383蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度 Pr較高，在較低無機鹽濃度時較高，在較低無機鹽濃度時,蛋白質(zhì)便蛋白質(zhì)便開開 始析出，鹽析界限比較寬。始析出，鹽析界限比較寬。 Pr較低，需求無機鹽的濃度也高，即鹽較低，需求無機鹽的濃度

23、也高，即鹽析析 界限變窄。界限變窄。 39 蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。 但蛋白質(zhì)濃度愈高時，其他蛋白質(zhì)的共沉淀作用但蛋白質(zhì)濃度愈高時，其他蛋白質(zhì)的共沉淀作用 也愈強也愈強 所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液太濃時，應(yīng)適當(dāng)稀釋，所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液太濃時，應(yīng)適當(dāng)稀釋， 通常在通常在2.53.0之間比較適宜。之間比較適宜。401.1.根本原理根本原理1 1在在pIpI附近，附近，PrPr主要以中性離子方式存在。主要以中性離子方式存在。此時假設(shè)添加此時假設(shè)添加 有機溶劑，由于有機溶劑可使溶液電有機溶劑，由于有機溶劑可使溶液電離常數(shù)減小，加強了離常數(shù)減小，加強了 中性離

24、子間靜電引力，從而使分集中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來。合而沉淀出來。2 2有機溶劑本身的水協(xié)作用會破壞有機溶劑本身的水協(xié)作用會破壞PrPr外表的外表的水合層，也水合層，也 促使促使PrPr變得不穩(wěn)定而聚集析出變得不穩(wěn)定而聚集析出. .常用的有機溶劑：乙醇和丙酮常用的有機溶劑：乙醇和丙酮 有機溶劑法有機溶劑法 分辨力比鹽析方法高，提純效果好分辨力比鹽析方法高，提純效果好 41 2. 影響有機溶劑沉淀Pr的要素 1 pH值 pH=pI時 蛋白質(zhì)的溶解度最低。按pI來調(diào)理pH值， 有利于分別。 2蛋白質(zhì)濃度 Pr越高，參與一定量有機溶劑后，Pr析出越多。 此時溶液的介電常數(shù)也相應(yīng)提高，

25、可以減少Pr的變性。 Pr越高,Pr分子間作用引起的共沉淀景象也顯著 加強，這樣分別效果差，不利于分級沉淀。 只需選擇恰當(dāng)?shù)腜r才有能夠獲得良好的分別效果。423 3離子強度離子強度 中性鹽的參與能促使中性鹽的參與能促使PrPr在有機溶劑中溶解，在有機溶劑中溶解， 并且能防止并且能防止PrPr的變性。但含鹽過多，卻會使的變性。但含鹽過多，卻會使PrPr 過度析出，不利于分級沉淀。過度析出，不利于分級沉淀。 普通普通0.05M0.05M的稀鹽溶液。的稀鹽溶液。4 4多價陽離子多價陽離子 Pr Pr與多價的陽離子如與多價的陽離子如 Zn2+ Zn2+、 Cu2+ Cu2+等能結(jié)等能結(jié) 合成復(fù)合物。

26、這種復(fù)合物在有機溶劑中往往使合成復(fù)合物。這種復(fù)合物在有機溶劑中往往使PrPr 溶解度變小。溶解度變小。 43v常溫下有機溶劑可使蛋白量變性，低溫條件下可減慢變性速常溫下有機溶劑可使蛋白量變性，低溫條件下可減慢變性速度。因此用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)時應(yīng)在低溫條件下進展。度。因此用有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)時應(yīng)在低溫條件下進展。v如利用丙酮沉淀蛋白質(zhì)時，必需在如利用丙酮沉淀蛋白質(zhì)時，必需在0 044低溫下進展，丙酮低溫下進展，丙酮用量用量- -般般1010倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立刻分別，否那么蛋白質(zhì)會變性。立刻分別，否那么蛋白質(zhì)會變性。v缺陷：缺陷

27、：v 易使酶和具有活性的蛋白量變性。故操作時要求條件比鹽易使酶和具有活性的蛋白量變性。故操作時要求條件比鹽析嚴(yán)厲。對于某些敏感的酶和蛋白質(zhì)，運用有機溶劑沉淀尤析嚴(yán)厲。對于某些敏感的酶和蛋白質(zhì)，運用有機溶劑沉淀尤其要小心。其要小心。 44 (二蛋白質(zhì)的層析分別法二蛋白質(zhì)的層析分別法 色譜法色譜法 原理原理層析法是利用不同物質(zhì)理化層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差別而建立起來的技術(shù)。一切性質(zhì)的差別而建立起來的技術(shù)。一切的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，另一是流動相。當(dāng)待分別的混定相，另一是流動相。當(dāng)待分別的混合物隨流動相經(jīng)過固定相時，由于各合物隨流動相經(jīng)過固定相時

28、，由于各組分的理化性質(zhì)存在差別，與兩相發(fā)組分的理化性質(zhì)存在差別，與兩相發(fā)生相互作用吸附、溶解、結(jié)合等生相互作用吸附、溶解、結(jié)合等的才干不同，在兩相中的分配含量的才干不同，在兩相中的分配含量比不同，且隨流動相向前挪動，各比不同，且隨流動相向前挪動，各組分不斷地在兩相中進展再分配。分組分不斷地在兩相中進展再分配。分部搜集流出液，可得到樣品中所含的部搜集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而到達將各組分分別各單一組分，從而到達將各組分分別的目的。的目的。45 層析分別才干的本質(zhì)層析分別才干的本質(zhì)物質(zhì)的分配問題物質(zhì)的分配問題 *分配系數(shù)：分配系數(shù)： 當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定

29、相和當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定相和挪動相兩相內(nèi)的濃度之比是一個常數(shù)，這稱為分配系數(shù)。挪動相兩相內(nèi)的濃度之比是一個常數(shù)，這稱為分配系數(shù)。 Cs Cm *質(zhì)量分配系數(shù)：質(zhì)量分配系數(shù)：假設(shè)不用濃度而用物質(zhì)的絕對量的比值來表示，那么稱為質(zhì)量假設(shè)不用濃度而用物質(zhì)的絕對量的比值來表示，那么稱為質(zhì)量分配系數(shù)即：分配系數(shù)即： Vs Vm Vs : 固定相的體積固定相的體積 Vm : 流動相的體積流動相的體積K =D= K*46 種類：種類： 氣相層析氣相層析 按兩相形狀來分按兩相形狀來分 液相層析液相層析 吸附層析吸附層析 分配層析分配層析 按層析機理來分按層析機理來分 離子交換層析離子

30、交換層析 凝膠排阻層析凝膠排阻層析 親和層析親和層析 柱層析柱層析 按操作方式來分按操作方式來分 薄層層析薄層層析 紙層析紙層析層析法分別、純化：層析法分別、純化：Pr、多肽和、多肽和AA47 離子交換層析法離子交換層析法*原理：陰陽離子交換樹脂顆粒作為固定相原理：陰陽離子交換樹脂顆粒作為固定相 填充在層析柱內(nèi)，由于陰陽離子交換樹填充在層析柱內(nèi)，由于陰陽離子交換樹 脂顆粒上帶正負(fù)電荷，能吸引溶液中的脂顆粒上帶正負(fù)電荷，能吸引溶液中的 陰陽離子。然后再用含陰陽離子的陰陽離子。然后再用含陰陽離子的 溶液洗柱。含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫溶液洗柱。含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫 下來，添加陰離子濃度，

31、含負(fù)電量多的蛋白下來，添加陰離子濃度，含負(fù)電量多的蛋白 質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。4849固定相：固定相：1.1.纖維素纖維素- - 二乙基氨基乙基纖維素二乙基氨基乙基纖維素DEAEDEAE纖維纖維素、素、 羧甲基纖維素羧甲基纖維素CMCM纖維素纖維素2.2.葡聚糖葡聚糖50纖維素纖維素 : 骨架為柔性長鏈骨架為柔性長鏈1. 參與量參與量 ： 參與層析柱的蛋白質(zhì)量通常為纖維參與層析柱的蛋白質(zhì)量通常為纖維素量的素量的 非常之一。非常之一。2. 提高分辨率，樣品體積應(yīng)盡能夠地提高分辨率，樣品體積應(yīng)盡能夠地少。少。3. 在洗脫時，可以經(jīng)過改動洗脫緩沖

32、在洗脫時，可以經(jīng)過改動洗脫緩沖液的液的pH， 而使蛋白質(zhì)分子電荷減少而被解吸下而使蛋白質(zhì)分子電荷減少而被解吸下來，也來，也 可以經(jīng)過提高洗脫緩沖液中離子強度，可以經(jīng)過提高洗脫緩沖液中離子強度，減弱減弱 蛋白質(zhì)分子與載體親和力的方法，將蛋白質(zhì)分子與載體親和力的方法，將蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 組分逐一洗脫下來。組分逐一洗脫下來。51葡聚糖的離子交換樹脂葡聚糖的離子交換樹脂 :骨架為三維網(wǎng)狀構(gòu)造骨架為三維網(wǎng)狀構(gòu)造 優(yōu)點：優(yōu)點：1.同時具有分子篩的作用同時具有分子篩的作用2. 因其高度的網(wǎng)狀構(gòu)造，所帶有的交換基團也比纖維因其高度的網(wǎng)狀構(gòu)造，所帶有的交換基團也比纖維 素多得多。交換容量為離子交換纖維素的素多得多。

33、交換容量為離子交換纖維素的35倍。倍。 缺陷：缺陷： 它的床體積常受它的床體積常受pH或鹽濃度影響而變化，對分別或鹽濃度影響而變化，對分別效果有一定程度的干擾。效果有一定程度的干擾。 52凝膠排阻層析凝膠排阻層析又稱分子篩或凝膠過濾又稱分子篩或凝膠過濾gel filtration原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。凝膠。 當(dāng)分子大小不同的混合物經(jīng)過這種凝當(dāng)分子大小不同的混合物經(jīng)過這種凝膠柱時，膠柱時， 直徑大于孔徑的分子將不能進入凝膠直徑大于孔徑的分子將不能進入凝膠內(nèi)部，內(nèi)部， 便直接沿膠粒間隙流出全排出。便直接沿膠粒間隙流出全排出。較小的較小的 分子

34、進入能包容它的孔穴，繞道而行，分子進入能包容它的孔穴，繞道而行，在柱在柱 內(nèi)保管時間就比較長。這樣，較大的內(nèi)保管時間就比較長。這樣，較大的分子被先分子被先 洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而來，從而 到達相互分別的目的到達相互分別的目的.5354用作凝膠的載體物質(zhì)有三類：用作凝膠的載體物質(zhì)有三類： 交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠 商品名為商品名為 Sephadex G Sephadex G 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 商品名為商品名為Bio-gel PBio-gel P ( (丙烯酰胺丙烯酰胺 + N + N，N N- -次甲基二丙烯酰次甲基二丙烯酰胺聚合

35、而成胺聚合而成 P P值表示不同的交聯(lián)度值表示不同的交聯(lián)度) ) 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 商品名為商品名為 Sepharose Sepharose或或 Bio-gel A Bio-gel A 從海藻瓊脂中分別除去瓊脂膠后從海藻瓊脂中分別除去瓊脂膠后的中性級成分的中性級成分 是是D-D-半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脫水脫水-L-L-半半乳糖相間反復(fù)結(jié)乳糖相間反復(fù)結(jié) 合而成的鏈狀化合物合而成的鏈狀化合物55常用過濾層析凝膠的截留分子量范圍56瓊脂糖凝膠優(yōu)點：瓊脂糖凝膠優(yōu)點：1.1.其機械強度比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝其機械強度比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝 膠好得多。膠好得多。2.2.對蛋白質(zhì)等高分

36、子的吸附作用也小得多對蛋白質(zhì)等高分子的吸附作用也小得多3.3.適用分子量的范圍寬，最大可以到適用分子量的范圍寬，最大可以到108108。57吸附層析法吸附層析法原理：柱層析中，含有原理：柱層析中，含有Pr分子的混合物隨流分子的混合物隨流動相通動相通 過由吸附劑組成的固定相時，過由吸附劑組成的固定相時，Pr分子分子經(jīng)過各經(jīng)過各 種次級作用可以吸附在吸附劑上種次級作用可以吸附在吸附劑上,由于由于不同分不同分 子的吸附才干不同，可以經(jīng)過洗脫使子的吸附才干不同，可以經(jīng)過洗脫使它們逐它們逐 一解脫出來，而使混合物得以分別。一解脫出來，而使混合物得以分別。優(yōu)點：優(yōu)點：1. 物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也

37、比較物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。容易。2.操作簡便，吸附劑容易獲得，價錢較低廉操作簡便，吸附劑容易獲得，價錢較低廉 58固定相：固定相：吸附劑吸附劑磷酸鈣凝膠磷酸鈣凝膠磷酸鈣膠磷酸鈣膠Ca3Ca3PO4PO42 2磷酸氫鈣膠磷酸氫鈣膠CaHPO42H2OCaHPO42H2O羥基磷酸鈣膠羥基磷酸鈣膠Ca5Ca5PO4PO43OH 3OH 羥基磷灰石羥基磷灰石 磷酸鈣膠對蛋白質(zhì)的吸附作用原理磷酸鈣膠對蛋白質(zhì)的吸附作用原理: :主要是由于主要是由于 . Ca2+. Ca2+與與PrPr負(fù)電荷性基團負(fù)電荷性基團 結(jié)合。結(jié)合。 . . 磷酸基團與磷酸基團與PrPr正電荷基團正電荷基團59

38、流動相：流動相： 洗脫劑洗脫劑-檸檬酸鹽檸檬酸鹽作用：檸檬酸離子因與作用：檸檬酸離子因與Ca2+有更強的相互有更強的相互作用，作用， 它能大大降低蛋白質(zhì)和凝膠的吸附才干。它能大大降低蛋白質(zhì)和凝膠的吸附才干。 NaCl，KCl甚至濃度高達甚至濃度高達3M時，也不影時，也不影響響Pr負(fù)電荷的吸附，相反這些鹽可以大大負(fù)電荷的吸附，相反這些鹽可以大大降低降低Pr正電荷的吸附。因此在高濃度的這正電荷的吸附。因此在高濃度的這些鹽溶液中運用羥基磷灰石進展層析時，可些鹽溶液中運用羥基磷灰石進展層析時，可以專門吸附酸性蛋白質(zhì)及中性蛋白質(zhì)而排除以專門吸附酸性蛋白質(zhì)及中性蛋白質(zhì)而排除堿性蛋白質(zhì)。堿性蛋白質(zhì)。60親和

39、層析法親和層析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相對原理：利用生物高分子具有能和某些相對應(yīng)的專注應(yīng)的專注 分子可逆結(jié)合的特性。分子可逆結(jié)合的特性。 如，酶的活性部位能和底物如，酶的活性部位能和底物抑制劑抑制劑輔助輔助因子專因子專 一性地結(jié)合一性地結(jié)合,改動條件又能使這種結(jié)合改動條件又能使這種結(jié)合解除解除. 酶的變構(gòu)中心與變構(gòu)因子或稱效應(yīng)酶的變構(gòu)中心與變構(gòu)因子或稱效應(yīng)物之物之 間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結(jié)結(jié) 合蛋白與結(jié)合物之間合蛋白與結(jié)合物之間。 這些被作用的對象物質(zhì)稱之為配基這些被作用的對象物質(zhì)稱之為配基ligand) 。 61固定相固定相-配

40、基固定在固相載體上配基固定在固相載體上62632.2.優(yōu)點：具有高度的吸附專注性優(yōu)點：具有高度的吸附專注性 層析過程簡便、快速層析過程簡便、快速3.3.載體的選擇：載體的選擇：(1)(1)必需具有高度親水性，使必需具有高度親水性，使PrPr分子容易與它接近分子容易與它接近. .(2)(2)非專注性吸附要非常小。非專注性吸附要非常小。(3)(3)必需具有大量可供活化而能與配基結(jié)合的基團。必需具有大量可供活化而能與配基結(jié)合的基團。 常用載體：纖維素、常用載體：纖維素、 葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、 聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃等。聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃等。 64高效液相層析法高效

41、液相層析法High Performance High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatography ，HPLCHPLC又稱又稱“高壓液相色譜，是色譜法的一個高壓液相色譜，是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分別后，進入檢測器在柱內(nèi)各成分被分別后，進入檢測器進展檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析

42、。進展檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。 65HPLC包括： 輸液系統(tǒng)：驅(qū)動流動相和樣品經(jīng)過色譜分別柱和檢測系統(tǒng) 層析柱：分別樣品中的各個物質(zhì) 進樣器：將待分析樣品引入色譜系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)：將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號 ，并分析顯示出來6667 蛋白質(zhì)的檢測和鑒定蛋白質(zhì)的檢測和鑒定68 普通可經(jīng)過以下幾個方面進展：普通可經(jīng)過以下幾個方面進展： 光譜學(xué)特性光譜學(xué)特性 電泳行為電泳行為 特異抗體反響特異抗體反響 特異生物學(xué)活性特異生物學(xué)活性 N一末端氨基酸序列測定一末端氨基酸序列測定 質(zhì)譜檢測質(zhì)譜檢測 排阻層析排阻層析 69 一、光譜學(xué)特性一、光譜學(xué)特性 光譜特性的總原那么是：光譜

43、特性的總原那么是： 當(dāng)一定波長的光即電磁波與當(dāng)一定波長的光即電磁波與Pr分子接觸時，所吸收的或反射的輻分子接觸時，所吸收的或反射的輻射能量與射能量與Pr分子構(gòu)造特征和濃度是分子構(gòu)造特征和濃度是親密相關(guān)的。親密相關(guān)的。 70 不同波長范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反不同波長范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反映的是蛋白質(zhì)分子的不同特征映的是蛋白質(zhì)分子的不同特征: :190 -200nm190 -200nm波長范圍的光吸收反映的是蛋白質(zhì)主鏈波長范圍的光吸收反映的是蛋白質(zhì)主鏈上的酰胺鍵中電子的被激發(fā)；上的酰胺鍵中電子的被激發(fā)；230 - 300nm230 - 300nm波長范圍的光吸收譜最大吸收

44、值在波長范圍的光吸收譜最大吸收值在280nm280nm波優(yōu)點反映的是蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸波優(yōu)點反映的是蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸側(cè)鏈上電子的被激發(fā)。側(cè)鏈上電子的被激發(fā)。所以普通情況下，溶液在所以普通情況下，溶液在280nm280nm波優(yōu)點屬紫外波優(yōu)點屬紫外光范圍的光吸收才干被當(dāng)做是存在蛋白質(zhì)的證據(jù)。光范圍的光吸收才干被當(dāng)做是存在蛋白質(zhì)的證據(jù)。71二、電泳檢測二、電泳檢測 蛋白質(zhì)分子為兩性電解質(zhì)，在不同蛋白質(zhì)分子為兩性電解質(zhì)，在不同pH的溶液中帶有不同的電荷，從而在直的溶液中帶有不同的電荷，從而在直流電場中可以泳動，這就是電泳景象。流電場中可以泳動，這就是電泳景象。按介質(zhì)形狀來分按介質(zhì)形狀來分

45、:自在電泳自在電泳 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳按操作原理可分為按操作原理可分為: 普通電泳普通電泳 等電電泳等電電泳 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 免疫電泳等免疫電泳等 72自在電泳自在電泳-以溶液為介質(zhì)，在溶液中將蛋白質(zhì)分別以溶液為介質(zhì)，在溶液中將蛋白質(zhì)分別 缺陷缺陷:自在電泳過程中分散嚴(yán)重，分辨率有限自在電泳過程中分散嚴(yán)重，分辨率有限區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳-在固體支持物上所進展的電泳在固體支持物上所進展的電泳 固體支持物有固體支持物有:濾紙、濾紙、 醋酸纖維薄膜、醋酸纖維薄膜、 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 優(yōu)點優(yōu)點:分辨率很高。分辨率很高。73SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰

46、胺凝膠電泳 SDSSDS ( (十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉) )是是陰離子型去污劑陰離子型去污劑(Sodium dodecyl sulfate, (Sodium dodecyl sulfate, SDS)SDS)SDSSDS一凝膠電泳可以按蛋白一凝膠電泳可以按蛋白質(zhì)分子大小的不同將其分開。質(zhì)分子大小的不同將其分開。 這時，假設(shè)以分子量的對數(shù)這時，假設(shè)以分子量的對數(shù)logMlogM對相對于染料前沿對相對于染料前沿的遷移率的遷移率RfRf作圖，呈現(xiàn)作圖，呈現(xiàn)線性關(guān)系。線性關(guān)系。 ab7475 這種關(guān)系，對一種膠濃度時，只適用于一定的這種關(guān)系，對一種膠濃度時，只適用于一定的分子量范圍：分子量范圍：

47、 5 5膠濃度時，適用于分子量膠濃度時，適用于分子量6 6200200萬的區(qū)間；萬的區(qū)間； 10 10膠濃度時，適用于分子量膠濃度時，適用于分子量1.61.67 7萬的區(qū)間；萬的區(qū)間； 15 15膠濃度時，適用于分子量膠濃度時，適用于分子量1.21.24.54.5萬的區(qū)間。萬的區(qū)間。 等電聚焦電泳等電聚焦電泳isoelectric focusing, isoelectric focusing, IEFIEF 是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在們在pHpH梯度中相互分別的一種電泳技術(shù)。梯度中相互分別的一種電泳技術(shù)。 利用特殊的一種緩沖液兩性電解質(zhì)利用特殊的一種緩

48、沖液兩性電解質(zhì)在凝膠常用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)制造一個在凝膠常用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)制造一個pHpH梯度。梯度。 pH pH梯度制造利用的兩性電解質(zhì)梯度制造利用的兩性電解質(zhì)ampholyteampholyte，商品名為商品名為ampholineampholine，是脂肪族多胺和多羧，是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的類的同系物，他們具有相近但不同的pKapKa和和pIpI值。在外電場作用下，自然構(gòu)成值。在外電場作用下，自然構(gòu)成pHpH梯度。梯度。凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等葡聚糖凝膠等77Pr分子有一定的pI，它處在一個由陽極到

49、陰極梯度逐漸添加的介質(zhì)中，并經(jīng)過以直流電時，它便“聚焦在與其pI一樣的pH位置上。pI不同的蛋白質(zhì)泳動后構(gòu)成位置不同的區(qū)帶而得到分別。78優(yōu)點：優(yōu)點：1.1.有很高的分辨率；有很高的分辨率；2.2.可以區(qū)分等電點只需可以區(qū)分等電點只需 0.01 pH 0.01 pH單位差別的蛋白質(zhì)；單位差別的蛋白質(zhì)；3.3.根據(jù)其所在位置還可以測定蛋白質(zhì)的分子量；根據(jù)其所在位置還可以測定蛋白質(zhì)的分子量；4.4.對很稀的樣品，最后到達高度的濃縮。對很稀的樣品，最后到達高度的濃縮。79雙向電泳雙向電泳two-dimensional gel electrophoresis 第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳第一向

50、采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳-pI第二向采用第二向采用SDS一一PAGE電泳電泳 -分子量分子量 由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的等電點和分子量兩種由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的等電點和分子量兩種完全不完全不同的特一性來進展分別，因此具有非常高的同的特一性來進展分別，因此具有非常高的分辨率分辨率可同時分析成千上萬個蛋白，分辨率高，分可同時分析成千上萬個蛋白，分辨率高，分別度好。別度好。是蛋白質(zhì)組學(xué)研討的中心技術(shù)。是蛋白質(zhì)組學(xué)研討的中心技術(shù)。80雙向PAGE81 雙向電泳技術(shù)缺陷，具有以下特征雙向電泳技術(shù)缺陷，具有以下特征的蛋白質(zhì)在二維電泳中還很難被檢的蛋白質(zhì)在二維電泳中還很難被檢測到：測到：等電點等電點pI)值很大或

51、很小的，比值很大或很小的，比如大于如大于8和小于和小于4的那些蛋白質(zhì)；的那些蛋白質(zhì)；分子質(zhì)量很大的蛋白質(zhì)，比如大分子質(zhì)量很大的蛋白質(zhì)，比如大于于l00kDa的蛋白的蛋白質(zhì)就比實踐的少了，而大于質(zhì)就比實踐的少了，而大于150kDa的蛋白質(zhì)就幾的蛋白質(zhì)就幾乎完全探測不到了雖然在一維乎完全探測不到了雖然在一維電泳凝膠上這些電泳凝膠上這些大蛋白質(zhì)都能清楚地被察看到；大蛋白質(zhì)都能清楚地被察看到；疏水性蛋白質(zhì)。疏水性蛋白質(zhì)。 免疫電泳免疫電泳 將電泳分別和專注性免疫沉淀相結(jié)合的分將電泳分別和專注性免疫沉淀相結(jié)合的分析方法：析方法： 免疫電泳法是指利用凝膠電泳與雙向免疫電泳法是指利用凝膠電泳與雙向免疫分散兩

52、種技術(shù)結(jié)合的實驗方法。在電免疫分散兩種技術(shù)結(jié)合的實驗方法。在電場作用下標(biāo)本中各組分因電泳遷移率不同場作用下標(biāo)本中各組分因電泳遷移率不同而分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向?qū)⒛z而分成區(qū)帶，然后沿電泳平行方向?qū)⒛z挖一溝槽，將抗體參與溝槽內(nèi)，使抗原與挖一溝槽，將抗體參與溝槽內(nèi)，使抗原與抗體相互分散而構(gòu)成沉淀線。根據(jù)沉淀線抗體相互分散而構(gòu)成沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置及外形，以分析標(biāo)本中所含的數(shù)量、位置及外形，以分析標(biāo)本中所含組分的性質(zhì)。組分的性質(zhì)。由于免疫反響有由于免疫反響有很高的專注性，很高的專注性，可用于鑒定可用于鑒定PrPr的的純度，分析樣品純度，分析樣品中蛋白質(zhì)的組分。中蛋白質(zhì)的組分。PH

53、8.6本實驗常用于抗原分析及免疫性疾病的診斷。本實驗常用于抗原分析及免疫性疾病的診斷。8384三、測定純化蛋白質(zhì)的分子大小三、測定純化蛋白質(zhì)的分子大小 測定蛋白處于非變性條件下的大小普通可經(jīng)過：測定蛋白處于非變性條件下的大小普通可經(jīng)過：凝膠層析凝膠層析沉降平衡超速離心沉降平衡超速離心sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 動態(tài)光散射動態(tài)光散射dynamic light scattering)孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳孔徑梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳pore gradient polyacrylamide gel electrophoresis 85

54、凝膠層析 1.凝膠是一類多孔性高分子聚合物,每個顆粒猶如一個篩子.當(dāng)樣品溶液經(jīng)過凝膠柱時,相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨著溶劑流動,因此流程較短,向前挪動速度快而首先流出層析柱; 2. 反之,相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔,可自在地進出凝膠顆粒的網(wǎng)孔,在向下挪動過程中,它們從凝膠內(nèi)分散到膠?？紫逗笤龠M入另一凝膠顆粒,如此不斷地進入與逸出,使流量增長,挪動速率慢而最后流出層析柱.863. 而中等大小的分子,它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布,部分進入顆粒,從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫.這樣,經(jīng)過層析柱,使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被

55、分別 。 VeblogMw C其中b,C為常數(shù)。即Ve為洗脫體積，與logMw也成線性關(guān)系。我們可以經(jīng)過在一凝膠柱上分別多種知分子量的蛋白質(zhì)后，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出規(guī)范曲線，然后用同一凝膠柱測出其它未知蛋白的分子量。87沉降平衡超速離心沉降平衡超速離心sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 用該技術(shù)測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的時用該技術(shù)測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的時候，測定的是幾個絕對動力學(xué)參數(shù)。候，測定的是幾個絕對動力學(xué)參數(shù)。原理：當(dāng)原理：當(dāng)PrPr樣品在相對較低的離心速度但樣品在相對較低的離心速度但還是處于超速范圍下離心時，在一個從離還是處于超速范圍

56、下離心時，在一個從離心管頂部指向底部的、越往底部越大的沉降心管頂部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，力作用下，PrPr分子很快構(gòu)成一個從離心管頂分子很快構(gòu)成一個從離心管頂部往下逐漸添加的延續(xù)部往下逐漸添加的延續(xù)r r濃度梯度；與此同濃度梯度；與此同時，將有一個方向與離心力相反的分散力作時，將有一個方向與離心力相反的分散力作用于用于PrPr上；當(dāng)沉降離心進展一定時間之后，上；當(dāng)沉降離心進展一定時間之后，作用于作用于PrPr上的離心力和分散力前者與蛋白上的離心力和分散力前者與蛋白在離心管中所在位置離軸心的間隔成正比例，在離心管中所在位置離軸心的間隔成正比例，后者與后者與PrPr濃度成正比正好

57、相互消除，這樣濃度成正比正好相互消除，這樣使得蛋白樣品的外表處于一個平衡形狀而不使得蛋白樣品的外表處于一個平衡形狀而不再挪動再挪動. .在這種平衡條件下，不同部位在這種平衡條件下，不同部位PrPr濃度與所在濃度與所在部位離軸心的間隔之間的關(guān)系與蛋白質(zhì)分子部位離軸心的間隔之間的關(guān)系與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量成某種數(shù)學(xué)關(guān)系。正是經(jīng)過這種關(guān)系，質(zhì)量成某種數(shù)學(xué)關(guān)系。正是經(jīng)過這種關(guān)系，可以測定蛋白質(zhì)的分子量?？梢詼y定蛋白質(zhì)的分子量。89密度梯度離心90 動態(tài)彈性光散射動態(tài)彈性光散射 是經(jīng)過測定蛋白顆粒的直徑、然后是經(jīng)過測定蛋白顆粒的直徑、然后與規(guī)范蛋白樣品比較而推算蛋白分與規(guī)范蛋白樣品比較而推算蛋白分子質(zhì)量的方法

58、。子質(zhì)量的方法。這種測定技術(shù)也可經(jīng)過察看樣品是這種測定技術(shù)也可經(jīng)過察看樣品是單分散性的單分散性的monodispersed還是還是多分散性的多分散性的polydisper-sed而反映所測蛋白樣品能否均一。而反映所測蛋白樣品能否均一。 91 孔徑梯度電泳孔徑梯度電泳 這是經(jīng)過制備具有一定范圍的從這是經(jīng)過制備具有一定范圍的從大到小孔徑梯度的聚丙烯酸胺凝膠，大到小孔徑梯度的聚丙烯酸胺凝膠，然后讓蛋白在非變性條件下在這種然后讓蛋白在非變性條件下在這種凝膠上電泳而進展的。凝膠上電泳而進展的。經(jīng)過低電流條件下的較長時間的電經(jīng)過低電流條件下的較長時間的電泳，蛋白質(zhì)分子將在凝膠中與其直泳，蛋白質(zhì)分子將在凝膠

59、中與其直徑相等的孔徑處停下由于再往下徑相等的孔徑處停下由于再往下凝膠中的孔徑比蛋白直徑小。經(jīng)凝膠中的孔徑比蛋白直徑小。經(jīng)過與同時在膠中電泳的規(guī)范樣品比過與同時在膠中電泳的規(guī)范樣品比較我們就可以知道蛋白在這種非變較我們就可以知道蛋白在這種非變性條件下的分子質(zhì)量。性條件下的分子質(zhì)量。 優(yōu)點：優(yōu)點：.所獲得的是天然形狀下的所獲得的是天然形狀下的蛋白分子大小。蛋白分子大小。 2. 假設(shè)蛋白分子可以在這假設(shè)蛋白分子可以在這種低電流電場中長種低電流電場中長 時間堅持穩(wěn)定的話，這時間堅持穩(wěn)定的話，這種方法比種方法比 較經(jīng)濟。較經(jīng)濟。92 質(zhì)譜質(zhì)譜 質(zhì)譜是一種在化學(xué)中被廣泛采用質(zhì)譜是一種在化學(xué)中被廣泛采用的、

60、測定原子或分子質(zhì)量方法中最的、測定原子或分子質(zhì)量方法中最直接、最準(zhǔn)確的方法。直接、最準(zhǔn)確的方法。 93 用質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的用質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的總的原理：總的原理：首先純化好的蛋白樣品要被轉(zhuǎn)首先純化好的蛋白樣品要被轉(zhuǎn)變成揮發(fā)和帶電即解離形變成揮發(fā)和帶電即解離形狀，電離后的蛋白質(zhì)分子帶狀，電離后的蛋白質(zhì)分子帶有多個電荷然后進人一個真有多個電荷然后進人一個真空加速電場中，之后，不同質(zhì)空加速電場中，之后，不同質(zhì)荷比荷比m/z的蛋白分子表現(xiàn)的蛋白分子表現(xiàn)出的行為或者在外加磁場中出的行為或者在外加磁場中的偏轉(zhuǎn)、或者抵達固定探測器的偏轉(zhuǎn)、或者抵達固定探測器的所謂的所謂“飛行時間飛行時間time