蛋白序列測定

1、第三節(jié)蛋白質(zhì)的一級結構蛋白質(zhì)的相關概念肽的命名、書寫及特點測序過程一、相關概念一、相關概念 1.1.蛋白質(zhì)的一級結構（蛋白質(zhì)的一級結構（Primary structurePrimary structure）: :又稱為共價結構或化學結構。它是指蛋白質(zhì)中的氨基酸（殘基）的種類、排列順序及連接方式。 特點：具有部分雙鍵的性質(zhì),不可以旋轉肽鍵比一般的碳-氧鍵短；與肽鍵相連的氫原子和氮原子呈反式反式； 2 2. .肽鍵肽鍵(peptide bond)(peptide bond) 一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基縮水形成的酰胺鍵（共價）鍵，稱為肽鍵。3.肽肽(peptide)一個氨基酸的羧基羧基

2、與另一個氨基酸的氨基氨基縮水形成的化合物，稱為肽肽。在蛋白質(zhì)分子中，氨基酸借肽鍵連接起來，形成肽鏈肽鏈。肽和肽鍵的形成肽和肽鍵的形成肽單位肽單位肽鍵肽鍵肽平面肽平面4.4.殘基殘基(residue)(residue) 肽鏈分子中的每一個氨基酸，由于相互連接而失去一分子水，與原來的結構相比，分子稍有殘缺，因此通常把肽鏈分子中的每一個氨基酸單位稱為氨基酸殘基(128/110).二、二、 肽的命名及書寫肽的命名及書寫1.命名：習慣：按數(shù)量的多少、按來源系統(tǒng)：某氨基酰某氨基酰某氨基酸2.書寫：從N(H)到C (OH) ，具方向性三字母符號或單字母符號表示，中間用“”或“-”表示。例如例如:Gly-Gl

3、u-Lys-Ala (甘氨甘氨基基酰谷酰谷氨氨基基酰賴氨酰賴氨基基酰丙氨酸酰丙氨酸) 當兩個氨基酸通過肽鍵相互連接形成二肽，當兩個氨基酸通過肽鍵相互連接形成二肽，在在N N端仍然有游離的氨基和端仍然有游離的氨基和C C端有游離的羧基，每一端有游離的羧基，每一端連接更多的氨基酸。氨基酸能以肽鍵相互連接形端連接更多的氨基酸。氨基酸能以肽鍵相互連接形成長的、成長的、不帶支鏈不帶支鏈的寡肽和多肽。的寡肽和多肽。 多肽仍然有游離的多肽仍然有游離的-氨基和氨基和-羧基。羧基。 少于少于10AA稱為稱為寡肽寡肽，多于，多于10AA稱為稱為多肽多肽或聚肽。或聚肽。 分子量大于分子量大于10000d稱為稱為蛋白

4、質(zhì)蛋白質(zhì)，小于，小于10000d稱稱為多肽為多肽。 在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。質(zhì)的亞單位。 但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為稱為活性肽活性肽。 實例：谷胱甘肽實例：谷胱甘肽(glutathione,GSH) 短桿菌肽短桿菌肽;腦啡肽；腦啡肽； 促甲狀腺素釋放因子（促甲狀腺素釋放因子（TRH） -天冬氨酸天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯（甜味劑）苯丙氨酸甲酯（甜味劑） 激素類多肽；抗生素類多肽；蛇毒

5、多肽激素類多肽；抗生素類多肽；蛇毒多肽等。等。重要的肽GSH的作用解毒作用：解毒作用：與毒物或藥物結合，消除其毒性作用；參與氧化還原反應：參與氧化還原反應：作為重要的還原劑，參與體內(nèi)多種氧化還原反應；保護巰基酶的活性：保護巰基酶的活性：使巰基酶的活性基團-SH維持還原狀態(tài)； 維持紅細胞膜結構的穩(wěn)定：維持紅細胞膜結構的穩(wěn)定：消除氧化劑對紅細胞膜結構的破壞作用。3.肽的理化特點：肽鍵的酰氨氫不解離，肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鍵中的游離末端-NH2、-COOH及側鏈R基上的可解離基團；肽中末端-羧基的pKa值比游離氨基酸的大，末端 -氨基的pKa值比游離氨基酸的小(?)；游離的-氨基、 -羧基和R基可

6、發(fā)生與氨基酸中相應的類似反應，如茚三酮反應等；蛋白質(zhì)部分水解后所得的肽若不發(fā)生消旋，則具有旋光性，短肽的旋光度約等于組成氨基酸的旋光度之和，較長的肽的旋光度則不是簡單加和。二、蛋白質(zhì)一級結構測定步驟二、蛋白質(zhì)一級結構測定步驟測序前提：測序前提：l樣品必須是均一的(純度大于97%)l必須知道它的相對分子量，其誤差允許在10%以內(nèi) 1. .測定測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 2.2.拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈 3.3.斷開鏈內(nèi)二硫鍵斷開鏈內(nèi)二硫鍵 4.4.分析每條多肽鏈的氨基酸組成比及數(shù)目分析每條多肽鏈的氨基酸組成比及數(shù)目 5.5.鑒定多肽鏈的鑒定多肽鏈的N

7、 N、C C瑞殘基瑞殘基 6.6.裂解多肽成小的肽段裂解多肽成小的肽段 7.7.測各肽段的氨基酸序列測各肽段的氨基酸序列 8.8.重建完整多肽鏈的一級結構重建完整多肽鏈的一級結構 9.9.確定二硫鍵的位置確定二硫鍵的位置測序過程測序過程(一一)N末端末端測定測定二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）法）法：肽游離末端NH2與DNFB反應生成DNP-肽黃色DNP-氨基酸丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）法：）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸苯異硫氰酸（苯異硫氰酸（PITC）法：）法：生成PTH-氨基酸，從肽上斷裂下來氨肽酶法：氨肽酶法：外切酶，但效果不好氨肽酶法氨肽酶法氨肽酶是一類外切酶，它從

8、肽鏈的N末端逐個向里切。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶 也會遇到N末端氨基封閉，用焦谷氨酸氨肽酶處理。 C-末端測定肼解法：最重要的化學方法，肽與肼反應，除C-末端氨基酸游離外，其他氨基酸轉變?yōu)榘被狨ｋ禄镞€原法：C-末端氨基酸用硼氫化鋰還原成相應的-氨基醇羧肽酶法：最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶Y羧肽酶C 氨基酸酰肼可以與苯甲醛苯甲醛作用變成水不溶性二苯基衍生物而沉淀 Gln Asn Cys等不易測出，末端Arg變成鳥氨酸羧肽酶法羧肽酶法本方法目前最有效。從羧基端開始向里逐一水解蛋白質(zhì) 羧肽酶A：釋放除Pro，Arg和Lys以個的所有C-末端殘基羧肽酶B：只水解以堿性Ar

9、g和Lys為C-末端的肽鍵羧肽酶C：羧肽酶Y：可以作用于任何一個C-末端殘基二硫二硫鍵的鍵的斷裂斷裂氧化法：過甲酸還原法：巰基化合物還原（-巰基乙醇，二硫蘇糖醇等） 此外還需要加8mol/L 尿素或6mol/L的鹽酸胍，使蛋白質(zhì)變性。 生成的巰基要用碘乙酸等烷化劑保護。(三三)氨基酸氨基酸組成的測組成的測定：定：酸水解：是主要方法，同時輔以堿水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破壞，Ser，Thr，Tyr部分破壞，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu,同時釋放出NH3；堿水解：多數(shù)氨基酸都被破壞，但Trp可定量回收(四四)多肽多肽鏈的鏈的部分部分裂解裂解酶裂解胰蛋白酶：專一性強，

10、斷裂Lys或Arg的羧基羧基參與形成的肽鍵糜蛋白酶：斷裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基羧基參與形成的肽鍵嗜熱菌蛋白酶：專一性差，斷裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基氨基參與形成的肽鍵胃蛋白酶：在酸性條件穩(wěn)定酸性條件穩(wěn)定，肽鍵兩側兩側均為疏水氨基酸。在確定二硫鍵位置時常用，專一性與糜蛋白質(zhì)酶類似化學裂解溴化氰（CNBr）：只斷裂Met羧基羧基形成的肽鍵羥氨（NH2OH）：在pH9時，專一斷裂Asn-Gly之間的肽鍵，其它條件下不專一 今有一個七肽，經(jīng)分析它的氨基酸組成是Lys，Pro, Arg, Phe, Ala,Tyr和Ser，該肽未經(jīng)糜蛋白酶處理時，與DNFB反

11、應不產(chǎn)生-DNP-氨基酸，經(jīng)糜蛋白酶作用后，此肽斷裂成兩肽段。其氨基酸組成分別是Ala, Ser, Tyr和Lys，Pro, Arg, Phe。這兩個肽段分別與DNFB反應可分別生成DNP-Ser和DNP-Lys。此肽與胰蛋白酶反應，同樣能生成兩個肽段，它們的氨基酸組成分別是Arg, Pro和Phe, Tyr, Lys, Ser, Ala。試問此七肽的一級結構序列是怎樣？(五五)肽肽段段的的氨氨基基酸酸測測序序Edman化學降解法：用Edman試劑PITC與游離氨基作用生成PTH- 氨基酸，并可用各種層析技術分離；現(xiàn)改用蛋白質(zhì)測序儀。酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困難質(zhì)譜法：質(zhì)譜儀由

12、核苷酸序列推定法：mRNA，cDNA，推出 cDNA的核苷酸序列，然后推測出蛋白質(zhì)的氨基酸序列(六六)肽段在多肽段在多肽鏈中次肽鏈中次序的決定序的決定(七七)二硫鍵位置的確定：二硫鍵位置的確定： 對角線電流法： 一般采用胃蛋白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質(zhì)。一是胃蛋白酶專一低，切點多，得到含有二硫鍵的肽段較小，易分離鑒定；二是在酸性條件下，有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應。 對角線電泳過程對角線電泳過程 ：把水解后的混合肽段點到：把水解后的混合肽段點到濾紙的中央，在濾紙的中央，在pH6.5條件下進行第一向電泳，肽條件下進行第一向電泳，肽段將按大小及電荷不同分離開，然后段將按大小及電荷不同分離開，然后

13、 把濾紙暴露把濾紙暴露在過甲酸蒸氣中，使在過甲酸蒸氣中，使S-S氧化成一對含磺酸基丙氨氧化成一對含磺酸基丙氨酸的肽。濾紙旋轉酸的肽。濾紙旋轉90度，在與第一向完全相同的條度，在與第一向完全相同的條件下進行第二向電泳。這時大多數(shù)氨基酸的遷移率件下進行第二向電泳。這時大多數(shù)氨基酸的遷移率未變，將位于濾紙的一條對角線上，而含磺基丙氨未變，將位于濾紙的一條對角線上，而含磺基丙氨酸的成對肽段將比原來含二硫鍵的肽小而負電荷增酸的成對肽段將比原來含二硫鍵的肽小而負電荷增加，結果它們都偏離了對角線。加，結果它們都偏離了對角線。 問題： 有一個A肽，經(jīng)酸水解分析得知由Lys、Asp、Glu、Arg、Ala、Val 和Tyr組成 。當A肽與DNFB反應后，得DNP-Glu，當用羧肽酶羧肽酶處理后得游離Asp。如果我們在實驗中將A肽用胰胰蛋白酶蛋白酶降解時，得到三個肽，其中一種(Arg、Gln、Tyr),在pH6.4時凈電荷為+1，另一種(Ala、Lys) 第三種為（Val和Asn）在pH6.4