三磷酸腺苷二鈉氯化鈉注射液的質(zhì)量控制及安全性研究

1、    三磷酸腺苷二鈉氯化鈉注射液的質(zhì)量控制及安全性研究  三磷酸腺苷二鈉氯化鈉注射液的質(zhì)量控制及安全性研究   摘要   目的：研究三磷酸腺苷二鈉(ATP)氯化鈉注射液的質(zhì)量控制方法及其特殊安全性。方法：結(jié)合紫外分光光度法和高效液相色譜法控制ATP氯化鈉注射液的質(zhì)量；過敏性、溶血性及血管刺激性試驗評價該制劑的特殊安全性。結(jié)果：三批ATP氯化鈉注射液有關(guān)物質(zhì)為4.8,含量為102.9；該注射液對受試豚鼠無致敏作用,對家兔紅細胞無明顯體外溶血和凝聚作用,對家兔耳緣靜脈亦無明顯刺激性。結(jié)論：ATP氯化鈉注射液安全、有效

2、、質(zhì)量可控。   關(guān)鍵詞   三磷酸腺苷二鈉  紫外分光光度法  高效液相色譜法  溶血作用  刺激性  過敏性 Abstract  Objective:To develop quality control and to study safety evaluation of ATP and sodium chloride injection. Methods:Quality of ATP and sodium chloride injection was analyzed by combining UV

3、and HPLC. Safety evaluation included irritability, hemolysis and stimulation tests. Results:The average total of impurities was 4.8% and the content of ATP was 102.9% in preparation. No hypersensitive action was found on Guinea pig, neither the hemolysis and agglomeration on red cell nor the stimula

4、tion on blood vessel was observed in rabbit. Conlusion: ATP and sodium chloride injection is safe,effective and quality controllable. Key    Words  ATP  UV  HPLC  irritablity  hemolysis  stimulation     三磷酸腺苷二鈉(Adenosine Disodium Triphospha

5、te,ATP)廣泛存在于人體細胞內(nèi),是一種具有多種重要生理活性的輔酶,參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖、磷脂及核酸的合成與代謝,也是體內(nèi)一切生命活動的主要能量來源。ATP適應(yīng)于因細胞損傷后細胞酶功能減退引起的疾病,臨床上主要用于心律失常、心力衰竭、心肌炎的治療1,以及腦出血后遺癥和肝炎疾病的輔助治療2，3。目前市場上供注射用的ATP劑型為水針和粉針,海南新隆藥業(yè)有限公司聯(lián)合江西科倫藥業(yè)有限公司解決了ATP不穩(wěn)定的工藝難題4,首次研究申報了大容量氯化鈉注射液,減少了藥物配液交叉污染的機會,提高了該藥的臨床應(yīng)用水平。本文對ATP氯化鈉注射液質(zhì)量可控性和制劑安全性進行了探討。   1  試驗

6、材料    高效液相色譜儀(SPD-10A檢測器,LC-10AT泵,日本島津公司),PHs-25酸度計。ATP對照品(含量>99.5%)；ATP氯化鈉注射液(規(guī)格：100mL:20mg,批號：050601、050602、050603,江西科倫藥業(yè)有限公司),甲醇(色譜純),其他試劑(分析純)。 豚鼠,雄性,體重250350g；家兔,雌雄不限,體重2.02.5Kg,中國醫(yī)科大學第二臨床學院實驗動物中心提供。   2  方法與結(jié)果  2.1  質(zhì)量控制 2.1.1  總核苷酸測定  精密量取本品5mL,

7、置50 mL量瓶中,加0.1mol·L1磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉35.8g,加水至1000mL,無水磷酸二氫鉀13.6g,加水至1000mL,互調(diào)pH值至7.0)至刻度,振搖使混勻,以上述緩沖液為空白溶液,照分光光度法測定,在259nm的波長處測定吸收度,按ATP的百分吸收系數(shù)為279計算總核苷酸。 2.1.2  ATP的重量比  KromasilC18色譜柱(250mm×46mm,5m),流動相0.2mol·L1磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉35.8g,磷酸二氫鉀13.6g,加水900mL溶解,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.0,加入四丁基溴化銨1.

8、61g,加水至1000mL)-甲醇(95:5),柱溫35,流速為1.0mL·min1,檢測波長為259nm,理論板數(shù)按ATP峰計算應(yīng)大于2000,各色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。按出峰次序依次記錄一磷酸腺苷,二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的峰面積,HPLC分析見圖1。參照中國藥典5計算ATP的重量比。HJ ATP含量(%)總核苷酸×ATP的重量比(%)標示量。 有關(guān)物質(zhì)(%)1-ATP的重量比(%)。 A. ATP對照品  B. ATP氯化鈉注射液 a.一磷酸腺苷 b.二磷酸腺苷 c.三磷酸腺苷 2.1.3  標準曲線  紫外分光光度法：精密稱取ATP對

9、照品20mg,置100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度。精密吸取0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL分別至10mL量瓶中,加0.1mol·L1磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度,照分光光度法測定。結(jié)果表明,在1228g·mL1的范圍內(nèi),濃度與吸收度具有良好的線性關(guān)系,Y =0.0322 X -0.0335,R0.9994。高效液相色譜法：精密稱取ATP對照品20mg,置10mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度。精密吸取0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL分別至10mL量瓶中,加水稀釋至刻度。分別取20l注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)果表明,在0.

10、040.36mg·mL1的范圍內(nèi),濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系,Y=2×107X+2×104,R0.9996。 2.1.4  回收率試驗  精密稱取16、20和24mg的ATP對照品各三份,分別加入處方量輔料,置100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。測定總核苷酸和ATP的重量比,計算回收率(n=3)分別為99.1、100.8和99.3。 2.1.5  精密度和穩(wěn)定性試驗  取同一份ATP氯化鈉注射液測定6次,測定總核苷酸和ATP重量比,計算含量和RSD%分別為102.8和0.85。于0、2、4、6、

11、8和12小時測定同一份樣品,結(jié)果在樣品在12小時穩(wěn)定。 2.1.6  重復性試驗  取ATP氯化鈉注射液6份,測定總核苷酸和ATP重量比,計算含量和RSD%分別為102.8和1.15。 2.1.7  含量測定和有關(guān)物質(zhì)  取本品3批樣品,測定總核苷酸和ATP重量比,計算有關(guān)物質(zhì)和標示含量結(jié)果見下表。      表1  ATP氯化鈉注射液有關(guān)物質(zhì)和含量測定(n=3)   批 號     有關(guān)物質(zhì)(%)  標示含量(%) 050601 &#

12、160;    4.7        102.7 050602    4.6        102.9 050603      5.1        103.0 平均值    4.8        1

13、02.9   2.2  安全性試驗 2.2.1  過敏性試驗  取健康豚鼠18只,體重250350g,隨機平均分成3組,分別為生理鹽水組、陽性對照組和ATP氯化鈉注射液組,隔日腹腔注射各組受試藥物0.5mL只,共3次。首次注射后的第14天和第21天,各組分別取3只豚鼠,分別給予對應(yīng)的受試藥物1.0mL只進行攻擊,觀察過敏反應(yīng)現(xiàn)象。陽性對照組豚鼠在注射后共有5只出現(xiàn)呼吸困難、噴嚏、干嘔、咳嗽等過敏反應(yīng),給藥組及陰性對照組兩次攻擊后均未見異常表現(xiàn),結(jié)果均為陰性。 2.2.2  體外溶血試驗  取兔血,離心、洗滌后,制備體積分數(shù)為

14、2%的紅細胞混懸液。取試管7支,分別加入2.5mL紅細胞混懸液,其中兩支分別加入2.5 mL蒸餾水和生理鹽水,作為陽性對照和陰性對照,其他5只試管中依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL ATP氯化鈉注射液,各試管分別補加生理鹽水至5mL,搖勻,置37水浴保溫,連續(xù)觀察4h。陽性對照管加入蒸餾水后,立即出現(xiàn)溶血現(xiàn)象；各供試藥液管及陰性對照管未發(fā)生溶血現(xiàn)象,紅細胞逐漸沉于管底,經(jīng)振搖后可均勻散開,說明亦無紅細胞凝聚現(xiàn)象。 2.2.3  血管刺激性試驗  家兔8只,分2組,每組4只,分別于耳緣靜脈滴注ATP氯化鈉注射液和0.9氯化鈉注射液,滴注量均為4mL

15、3;kg1,滴速為1.0mL·min1,每天1次,連續(xù)3d,給藥期間每日觀察血管注射部位及整個外耳廓有無變化。在第三次給藥后24h將動物處死,取給藥處血管及周邊組織,以5%甲醛溶液固定、切片、染色,切片部位為進針部位向心端1cm及2cm處。給藥組、生理鹽水注射液對照組血管均未見異常病理改變,耳緣靜脈內(nèi)無血栓形成,血管內(nèi)皮細胞及周圍組織未見水腫、炎性浸潤或壞死等異常改變。   3  討論    含量和有關(guān)物質(zhì)是衡量藥物有效性和內(nèi)在品質(zhì)最重要的指標,一般來說,越接近標示含量,有關(guān)物質(zhì)越少,則藥物的品質(zhì)越高。ATP化學結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,高溫和長期

16、存放時容易分解成ADP和AMP,這兩種物質(zhì)不具有毒副作用,體內(nèi)與ATP存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。但是,藥品注冊管理辦法規(guī)定有關(guān)物質(zhì)作為藥品質(zhì)量控制的指標,必須規(guī)定限度。中國藥典標準和部頒生化藥品標準對ATP原料和制劑有關(guān)物質(zhì)未作要求,僅對原料含量要求分別為大于95和85。測定了上市多個廠家的ATP水針制劑,有關(guān)物質(zhì)均在10左右,ATP氯化鈉注射液采用精制高純度原料,含量高,制劑有關(guān)物質(zhì)低,確保了臨床應(yīng)用的有效性。   本文提供的質(zhì)量控制方法,能夠控制ATP氯化鈉注射液的質(zhì)量。按照中國藥典2005版二部注射劑項下有關(guān)要求,質(zhì)量標準還增加鑒別、細菌內(nèi)毒素和氯化鈉含量測定等項目,確保藥品的安全有效。特殊安全性試驗表明,ATP氯化鈉注射液對受試豚鼠無致敏作用,對家兔紅細胞無明顯體外溶血和凝聚作用,對家兔耳緣靜脈亦無明顯刺激性,符合臨床安全性方面的要求。由此可見,ATP氯化鈉注射液安全、有效、質(zhì)量可控。 參考文獻