熒光原位雜交檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞hTERC基因?qū)嶒?yàn)方法比較觀察

1、熒光原位雜交檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞hTERC基因?qū)嶒?yàn)方法比較觀察【摘要】目的：探討熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)端粒酶基因(hTERC)實(shí)驗(yàn)方法的最佳方案。方法：采集海醫(yī)附院收治的140例患者的宮頸脫落細(xì)胞,分別應(yīng)用液基取材刷、無菌棉簽取材法;生理鹽水低滲、TCT低滲、直接取液滴片、TCT直接低滲4種制片方法;水浴和直接消化法;甲酰胺法和共變性法,通過檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞hTERC基因表達(dá)成功率,對(duì)比實(shí)驗(yàn)方法的最佳方案。結(jié)果：取材方法中液基取材刷與無菌棉簽的細(xì)胞數(shù)量滿意率分別為95.5%、14.3%，2種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) ;生理鹽水低滲、TCT低滲、直接取液滴片、TCT直接低滲4種方法雜交成功率

2、分別是80.0%、84.8%、46.2%、82.1%,其中直接取液滴片與其他法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.05);2種消化法中水浴和直接法雜交成功率分別為88.9%、94.1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，雜信號(hào)比例分別為16.7%、45.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2種變性法中甲酰胺法和共變性法雜交成功率分別為72.3%、96.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞hTERC基因時(shí),以液基取材刷取材細(xì)胞數(shù)量多，TCT低滲方法制片效果最好，水浴法和共變性雜交成功率最高。 【關(guān)鍵詞】 熒光原位雜交;宮頸脫落細(xì)胞;TERC基因 Experiment

3、al comparison of fluorescence in situ hybridization in cervical exfoliated cell hTERC gene detectionZENG Rongrong1,2, JIN Song1(1 Department of Gynaecology and Obstetrics, Affiliated Hospital of Hainan Medical College Haikou 571101, China;2 Guiyang Traditional Chinese Medical College Guiyang 550002,

4、 China)ABSTRACT Objective: To investigate the optimal methods of fluorescence in situ hybridization on hTERC gene detection. Methods： 140 samples of cervical exfoliated cells were gathered by fluidbase brush sampling and aseptic cotton sampling in the Affiliated Hospital of Hainan Medical College; m

5、ovies were made by physiological saline infiltration, TCT infiltration, direct dropping and direct TCT infiltration. All experimental methods, bath and direct digestion, formamide and denaturation law, were compared by detecting the success expression of cervix castoff cells hTERC gene. Results： In

6、sampling methods, the satisfactory rate of cell quantity in fluidbase brush and aseptic cotton were 95.5% and 14.3%( P0.05); In hybridization technique, the success rate of 4 methods were 80.0%,84.8%,46.2%,82.1%, respectively, compared to direct dropping method, other three methods were preferable (

7、P0.05). But hybridization signal ratio were 16.7% and 45.6%， with significant difference(P0.05). In two denaturation methods, the success rate were 72.3% and 96.0%，with significant difference(P0.05). Conclusion： Detecting hTERC gene by fluorescence in situ hybridization, fluidbase brush is better sa

8、mpling of quantity cells, TCT infiltration is preferable in making movies, bath and hybridization variability have higher success rate.KEY WORDS Fluorescence in situ hybridization; Cervical exfoliated cells; TERC gene隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們運(yùn)用熒光原位雜交( fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中3號(hào)染色體長(zhǎng)臂2

9、6. 3位點(diǎn)端粒酶基因( human telomerase RNA component,hTERC)的擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)它與宮頸病變有著密切的關(guān)系1。FISH的原理是以已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針,按堿基互補(bǔ)原則,與待檢材料中未知單鏈核酸進(jìn)行結(jié)合,形成熒光顯微鏡下可檢測(cè)的熒光信號(hào),本實(shí)驗(yàn)從取材、制片、消化、變性4個(gè)方面,探討實(shí)驗(yàn)方法對(duì)FISH雜交率的影響。1 材料與方法1. 1 材料來源收集2007年11月2009年3月在海南醫(yī)學(xué)院臨床附屬醫(yī)院就診的140例婦科患者的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本(排除嚴(yán)重內(nèi)科疾病及生殖系統(tǒng)炎癥)。1. 2 方法FISH檢測(cè)均以細(xì)胞學(xué)檢查和組織病理學(xué)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)。1. 2. 1 取材

10、 (1)液基取材刷：患者取膀胱結(jié)石位，暴露宮頸，干棉簽擦拭分泌物，使用一次性TCT毛刷插入宮頸口,在宮頸外口鱗柱狀上皮交界處,以宮頸外口為中心,均勻按順(逆)時(shí)針旋轉(zhuǎn)5周,停留10 s左右，將宮頸刷置于TCT液基中保存;(2)無菌棉簽：取材方法同前，棉簽放于生理鹽水中保存。1. 2. 2 制片 (1)生理鹽水低滲：將生理鹽水細(xì)胞儲(chǔ)存液充分震蕩10 min，放置12 min后取10 mL細(xì)胞儲(chǔ)存液 , 1 500 r/min 離心10 min, 去上清，如細(xì)胞少，可再取更多液體。加5 mL膠原酶B, 37水浴30 min,間斷吹打，離心,加5mL去離子水37水浴20 min,加入2mL固定液(冰

11、乙酸甲醇=13)固定10 min,離心后棄上清,吹打懸浮細(xì)胞,重復(fù)2次固定，取適量密度細(xì)胞懸液10 L用移液器滴片。(2)TCT低滲：膠原酶B 20 min，去離子水40 min，其余處理同生理鹽水法。(3)直接取液滴片：取10 mL細(xì)胞儲(chǔ)存液 , 1 500 r/min 離心10 min, 去上清，滴片同前，滴片后用95%乙醇固定10 min。(4)TCT直接低滲：不加膠原酶B ，余同TCT低滲。4種方法制片后均自然干燥，室溫下過夜老化。1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用2 檢驗(yàn),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) = 0. 05。2 結(jié)果 2. 1 取材方法133例液基取材刷與7例無菌棉簽的細(xì)胞數(shù)量滿意率分別

12、為95.5%(127/133)、14.3%(1/7)，2種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P0.05) 。2.2 制片方法25例生理鹽水低滲、46例TCT低滲、13例直接取液滴片、56例TCT直接低滲制片細(xì)胞數(shù)滿意率分別為68.0%、65.2%、92.3%、75.0%，直接取液滴片組與其他組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P0.05)，其次為TCT直接低滲法較好;各組之間細(xì)胞分散度滿意率分別為80.0%、84.8%、38.5%、64.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，TCT低滲最好,直接取液滴片最低;各組之間玻片背景清晰滿意率分別為60.0%、76.1%、38.5%、62.5%，直接取液滴片組與其他組對(duì)比

13、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，以TCT低滲法最好，直接取液滴片組最低;雜交成功率分別為80.0%、84.8%、46.2%、82.1%，直接取液滴片組與其他組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);雜信號(hào)比例分別為16.7%、45.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.4 變性方法65例甲酰胺法和75例共變性法雜交成功率分別為72.3%(47/65)、96.0%(72/75)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 討論現(xiàn)代細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，大多數(shù)實(shí)體腫瘤細(xì)胞，常表現(xiàn)為染色體不穩(wěn)定性，即染色體數(shù)目的改變和染色體結(jié)構(gòu)異常。對(duì)宮頸癌染色體不穩(wěn)定的研究顯示，常見染色體3q增加和2，3，4，

14、6p，11q的缺失，并且異?；騾^(qū)多位于3q26.1-q28，其中涉及到的最重要的基因可能是人類染色體端粒酶(hTERC基因圖位于3q26.3)基因。研究發(fā)現(xiàn),宮頸細(xì)胞由非典型性發(fā)育異常向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過程中幾乎都伴有3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增。有學(xué)者采用FISH技術(shù)檢測(cè)液基細(xì)胞學(xué)樣本,發(fā)現(xiàn)3q26.3擴(kuò)增比例在宮頸高度病變與鱗癌中占較高百分率,而在正常宮頸與非典型鱗狀上皮細(xì)胞中不出現(xiàn)顯著擴(kuò)增13。因此，對(duì)hTERC基因擴(kuò)增的檢測(cè)有助于宮頸癌的篩查及早期診斷，而檢測(cè)基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方法即為FISH46。采用熒光標(biāo)記的探針，與被檢測(cè)樣本中的DNA雜交后，在熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光信號(hào)而得出結(jié)果。FISH具有較好

15、的靈敏性及特異性，并且不需要細(xì)胞培養(yǎng)，可以用于間期細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)從取材、制片、消化、變性幾個(gè)方面探討實(shí)驗(yàn)方法對(duì)FISH檢測(cè)的影響。從取材方法來看，無菌棉簽與液基取材刷相比，無菌棉簽采集脫落細(xì)胞數(shù)量明顯少于取材刷法，原因在于細(xì)胞黏附在棉簽上，震蕩后仍有大部分細(xì)胞吸附其上。從制片方法來看，TCT低滲法較生理鹽水、TCT直接低滲法和直接涂片法在細(xì)胞分散度、細(xì)胞核形態(tài)、背景情況上效果好，但細(xì)胞數(shù)量要低。直接涂片法細(xì)胞數(shù)量多，但細(xì)胞分布不均，黏液、雜質(zhì)多。生理鹽水法細(xì)胞形態(tài)保持較好，但黏液對(duì)雜交有一定的影響，而且炎癥細(xì)胞和血細(xì)胞也在一定程度上干擾信號(hào)的判讀。TCT直接低滲法與TCT低滲法差異為不加用膠原酶

16、B，結(jié)果顯示在細(xì)胞分散度、背景、雜信號(hào)方面不如TCT低滲法滿意。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因可能在于：(1)通過膠原酶、低滲、反復(fù)離心去上清、吹打使細(xì)胞數(shù)量受到一定損失;(2)TCT液基成分對(duì)細(xì)胞懸液中黏液、炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞、雜質(zhì)的處理有一定的幫助;(3)膠原酶、低滲的運(yùn)用可進(jìn)一步消化黏液和膨脹、疏松細(xì)胞核，為雜交做好準(zhǔn)備。從消化方法來看，直接法較水浴雜交率稍高，但非特異性信號(hào)較多，對(duì)結(jié)果判讀有一定影響，需加強(qiáng)洗滌以解決，水浴法存在有消化不足現(xiàn)象，細(xì)胞膜較厚時(shí)需延長(zhǎng)消化時(shí)間。消化在雜交中起著重要的作用，胃酶的濃度、時(shí)間和溫度，如消化不夠或太過則雜交失敗可能性較大。從變性方法來看，共變性法較甲酰胺法效果要

17、好，雜交率高，背景清晰，熒光信號(hào)亮，且操作簡(jiǎn)單快捷。原因分析：共變性使細(xì)胞DNA和探針處在共同的溫度、濕度環(huán)境中變性、雜交，減少了-20乙醇防復(fù)性的影響，另外，無甲酰胺pH值的影響。綜上所述，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)hTERC基因成功與否的關(guān)鍵在于制片質(zhì)量、胃酶消化濃度和時(shí)間，其次為變性時(shí)間和溫度上的掌握。本實(shí)驗(yàn)表明: 應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞hTERC基因時(shí),比較上述多種方法,其中以液基取材刷取材細(xì)胞數(shù)量多，TCT低滲方法制片效果最好，水浴法消化和共變性雜交成功率最高。 值得注意的是,消化的濃度和時(shí)間可根據(jù)每張制片細(xì)胞的具體情況靈活進(jìn)行調(diào)整。FISH技術(shù)因其具有較高特異性、敏感性和快速、操作

18、簡(jiǎn)單、無創(chuàng)等特點(diǎn)，從一定程度上彌補(bǔ)現(xiàn)行宮頸癌和癌前病變篩查方法的局限性，因此可作為臨床宮頸疾病篩查一項(xiàng)重要的輔助檢查?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 HeselmeyerHaddad K, Sommerfeld K,White NM, et al.Genomic amplification of the human telomerase gene( TERC) in pap smears predicts the development of cervical cancerJ. Am J Pathol, 2005, 166: 12291238.2 Garaway NP, Khanna A, Dawlett M, et al. Gain of the 3q26 region in cervicovaginal and squamous cell carcinomaJ. Gynecol Oncol, 2008,110: 37 42.3 Andersson S, Wallin KL, Hellstrom AC， et al. Frequent gain of the human telomerase gene TE