金屬組學(xué)-高通量分析技術(shù)進展與展望

1、中國科學(xué)B輯:化學(xué) 2009年 第39卷 第7期: 580589 中國科學(xué)雜志社SCIENCE IN CHINA PRESS金屬組學(xué):高通量分析技術(shù)進展與展望李玉鋒, 高愈希, 陳春英*, 李柏, 趙宇亮, 柴之芳中國科學(xué)院高能物理研究所核分析技術(shù)中國科學(xué)院重點實驗室, 北京 100049;國家納米科學(xué)中心納米生物效應(yīng)與安全性中國科學(xué)院重點實驗室, 北京 100190* 通訊作者, E-mail: chenchy, chenchy收稿日期:2008-12-16; 接受日期:2008-12-22摘要金屬組學(xué)是系統(tǒng)研究一種細胞、組織或完整生物體內(nèi)全部金屬原子的分布、含量、化學(xué)種態(tài)及其功能的新興綜合

2、學(xué)科, 它的提出受到人們越來越多的關(guān)注。本文綜述了金屬組學(xué)的研究方法, 并對各種方法的特點和局限性做了比較說明. ICP-MS與NAA技術(shù)可實現(xiàn)多元素同時定量分析, 同步輻射微束CT及XRF, EDX, PIXE, SIMS及LA-ICP-MS亦可實現(xiàn)金屬組分布研究. 金屬組學(xué)研究目前正處于發(fā)展初期, 仍有許多困難特別是分析儀器及方法方面的問題有待解決. 已有的金屬組形態(tài)及結(jié)構(gòu)分析工作大多數(shù)采用的是較低效率的分析方法, 一些正在發(fā)展中的關(guān)鍵技術(shù)平臺, 如HTXAS可真正實現(xiàn)高通量的形態(tài)或結(jié)構(gòu)分析. 此外, 生物信息學(xué)有望成為金屬組學(xué)研究的重要工具之一. 關(guān)鍵詞金屬組學(xué)金屬組研究方法進展1引言生

3、命體系中99.9%的物質(zhì)由11種元素組成, 這些元素稱為宏量元素. 與之相對應(yīng), 其余占0.1%的元素稱為微量元素. 微量元素(主要為金屬及類金屬元素的含量雖然非常低, 卻是生命存在的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一. 比如, DNA及RNA的合成離不開DNA和RNA聚合酶(含鋅酶的催化; 在體內(nèi)扮演不再角色的過氧化氫酶、固氮酶、鐵傳遞蛋白及細胞色素等蛋白質(zhì)(酶的活性中心均含有數(shù)量不同的鐵原子1. 鑒于這些微量金屬及類金屬元素的重要性, 2002年10月, Haraguchi提出了系統(tǒng)研究細胞、器官或生物組織中金屬或類金屬元素的新的研究方向“金屬組學(xué)(metallomics”是綜合研究生命體內(nèi), 特別是一種細

4、胞內(nèi), 自由或絡(luò)合的全部金屬原子的分布、含量、化學(xué)種態(tài)及其功能的綜合學(xué)科(the integral study of the location, distribution, identity, species, quantity and functions of free and complexed metals in biological systems, especially within a given cell type. 與之相對應(yīng), 細胞、器官或組織中金屬及類金屬蛋白質(zhì)、酶或其他含有金屬的生物分子及游離金屬及類金屬離子的集合則稱之為“金屬組(metallome”2,3, 即金屬組指

5、一個生物體系中的所有含金屬物種.金屬組學(xué)的提出已經(jīng)引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注, 國際上金屬組學(xué)研究進展十分迅速, 不論基礎(chǔ)理論還是技術(shù)方法, 都在不斷進步和完善. 目前, 英國皇家化學(xué)會刊物Journal of Analytical and Atomic Spectrometry于2004年和2007年分別發(fā)行了兩期金屬組學(xué)?？?, 同時該刊還建立了金屬組學(xué)與生物元素形態(tài)分析網(wǎng)站(/ Publishing /Journals /JA/News/biological_content.asp. 2007年底, 首屆國際金屬組學(xué)會議于日本名古屋舉辦, 來自世界各地的約4

6、00專家學(xué)者與會(http:/www.ism2007.580中國科學(xué)B輯: 化學(xué) 2009年第39卷第7期org/, 而第二屆國際金屬組學(xué)會議已于2009年6月于美國辛辛那提市舉辦(/plasma- chem/iswm/index.htm. 國際上第一個金屬組學(xué)研究中心-美洲金屬組學(xué)研究中心也已于美國西西那提大學(xué)成立. 此外, 英國皇家化學(xué)會于2009年1月起發(fā)行名為的Metallomics的刊物, 這是金屬組學(xué)研究領(lǐng)域的第一本專業(yè)性期刊(/Publishing/ Journals/MT/index.asp, 為金屬組學(xué)學(xué)科的發(fā)

7、展提供了一個良好的平臺.國內(nèi)學(xué)者也給予金屬組學(xué)較大的關(guān)注. 江桂斌等人5于2005年對金屬組學(xué)的概念進行了介紹并對金屬組學(xué)的研究方法特別是金屬組的分離與檢測方法進行了總結(jié). 2008年4月, 金屬組學(xué)與金屬蛋白質(zhì)組學(xué)研討會于北京成功舉行, 來自法國Pau大學(xué)、丹麥國家食品研究所及香港大學(xué)、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部、復(fù)旦大學(xué)、廈門大學(xué)、中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心、國家納米科學(xué)中心以及中國科學(xué)院高能物理研究所等多家單位的科研人員報告了各自在金屬組學(xué)領(lǐng)域的最新進展( /080504.htm.2金屬組學(xué)的研究內(nèi)容金屬組學(xué)的研究對象是生命體系中的所有金屬元素, 故金屬組學(xué)也可稱為金屬輔助的功能生物化學(xué)(metal

8、-assisted function biochemistry. 結(jié)合金屬元素在生命體系中作用, Haraguchi提出, 金屬組學(xué)的研究內(nèi)容包括:(1 生物體液、細胞、器官中元素的分布分析; (2 生物體系中元素的形態(tài)分析; (3 金屬組的結(jié)構(gòu)分析; (4 應(yīng)用模型絡(luò)合物闡釋金屬組反應(yīng)機理; (5 金屬蛋白質(zhì)和金屬酶的鑒定; (6 生物分子和金屬的代謝研究; (7 基于多元素分析的與微量元素相關(guān)的健康和疾病的醫(yī)學(xué)診斷; (8 化學(xué)治療中的無機藥物的設(shè)計; (9 地球上生命體系的化學(xué)演變; (10 醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)、農(nóng)業(yè)、毒物學(xué)、生物地質(zhì)化學(xué)中的其他金屬輔助功能性生物科學(xué)等3.3金屬組

9、學(xué)的研究方法組學(xué)研究方法的最大特點是高通量(high-th- roughput, 金屬組學(xué)的研究方法必須能夠同時檢測多種金屬組(含量、分布及其相互作用等或一種金屬的多種形態(tài). 根據(jù)金屬組學(xué)研究內(nèi)容可以看出, 金屬組學(xué)的研究方法應(yīng)該包括:高通量金屬組含量研究技術(shù); 高通量金屬組分布研究技術(shù); 高通量金屬組形態(tài)分析技術(shù); 高通量金屬組結(jié)構(gòu)分析的技術(shù)及其他技術(shù)等. 以下我們將對現(xiàn)有的各種分析技術(shù)進行總結(jié), 對這些方法的特點和局限性作簡單說明.3.1高通量金屬組定量分析方法基于等離子體(plasma技術(shù)的儀器如電感耦合等離子體發(fā)射光譜 (ICP-AES 及電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS是高效、高靈

10、敏度的多元素定量分析技術(shù), 因而非常適合金屬組的研究. 相對而言, ICP- AES測定靈敏度較低, 選擇性也較差, 而ICP-MS的檢測限可達pg/g級, 比ICP-AES高23個數(shù)量級6. 對ICP-MS而言, 液體和氣體樣品可以直接進樣, 對固體樣品也可通過激光燒蝕(Laser Ablation, LA技術(shù)進行直接測試, 所以ICP-MS的測試范圍很廣7. 由于LA-ICP-MS具有數(shù)據(jù)采集快、樣品前處理少及靈敏度高等優(yōu)點, 目前已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜的生物樣品、環(huán)境樣品及地質(zhì)樣品中的元素測定.中子活化分析(NAA是另一種重要的多元素定量分析技術(shù), 它可以同時測定樣品中多達30種元素的含量.

11、它的檢測限可低至1061013 g/g8. 中子活化分析的基本原理是, 樣品中的穩(wěn)定核素(A Z在入射中子流的作用下發(fā)生中子捕獲反應(yīng), 生成放射性核素(A+1Z, A+1Z具有一定的半衰期, 它發(fā)生衰變時會發(fā)射粒子和射線. 利用高分辨的射線譜儀檢測樣品受中子照射后產(chǎn)生的射線的強度即可實現(xiàn)對樣品中元素進行定性或定量分析. 中子活化分析技術(shù)的一個最大優(yōu)點是基質(zhì)干擾非常少, 這是因為無論是探針(中子流還是分析信號(射線都與樣品中的其他元素不發(fā)生作用. 另外, 由于不涉及樣品消化或溶解, 可最大程度地避免試劑或?qū)嶒炇业奈廴?.因此, ICP-MS, NAA均為優(yōu)異的多元素分析技術(shù), NAA更可實現(xiàn)固體

12、樣品的非破壞性分析, 而配備了激光燒蝕系統(tǒng)的ICP-MS同樣也可實現(xiàn)該目標(biāo). 在獲得樣品中不同元素的含量后, 可以對其進行相關(guān)性分析, 從而可以發(fā)現(xiàn)不同元素間的相互關(guān)系. 例如, 人們發(fā)現(xiàn)無機汞暴露的魚類, 海洋哺乳動物或海鳥,581李玉鋒等: 金屬組學(xué):高通量分析技術(shù)進展與展望動物及人類體內(nèi)硒與汞含量具有正相關(guān), 而這種相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)有助于人們進一步研究硒與汞的協(xié)同或拮抗作用研究9.3.2高通量金屬組空間分布的研究方法除了金屬組的總含量研究, 金屬組的空間分布研究同樣非常重要, 因為研究金屬組的分布有助于了解金屬組的生物可利用度及其在生物體系內(nèi)的轉(zhuǎn)移、功能等. 研究金屬組分布的技術(shù)包括:(1

13、基于X射線熒光技術(shù)的同步輻射X射線微區(qū)熒光分析(SR- XRF; (2 基于質(zhì)譜技術(shù)的LA-ICP-MS與二次離子質(zhì)譜(SIMS等.X射線熒光分析是一種多元素分析技術(shù), 它通過檢測元素受入射X射線激發(fā)后發(fā)生的特征熒光進行分析10. 若采用高能質(zhì)子流作為激發(fā)光, 則稱之為PIXE, PIXE具有比XRF更高的靈敏度11. XRF中的X 射線若采用同步輻射光, 則可實現(xiàn)絕對檢測限10121015 g, 其相對檢測限為幾個g/g, 甚至可達ng/g水平12. XRF主要為元素定性技術(shù), 但也可實現(xiàn)對元素的定量研究13.SR-XRF是目前研究金屬組分布的最熱門的技術(shù)之一. 通過聚焦系統(tǒng), 如K-B鏡(

14、Kirkpatrick-Baez mirror system、Fresnel波帶片(Fresnel zone plate等的調(diào)節(jié), 可將光斑調(diào)節(jié)到微米甚至是納米級水平, 這樣就可以研究小到細胞水平上的金屬組分布特征. 例如, Carmona等人14利用K-B鏡將同步光源聚焦至90 nm后研究了多巴胺能細胞株中金屬組的分布. 他們發(fā)現(xiàn), 多巴胺囊泡中的鐵主要為顆粒狀分布于神經(jīng)突及神經(jīng)末梢, 另一方面, 他們發(fā)現(xiàn), 不同細胞的神經(jīng)突均蓄集銅、鋅甚至是鉛元素. 但能實現(xiàn)納米級分辨率的XRF實驗裝置目前尚只有歐洲ESRF (European Synchrotron Radiation Facility

15、及美國ALS(The Advanced Light Source等少數(shù)幾家, 多數(shù)SR-XRF的分辨率在微米級, 例如, Gao等人15利用SR-XRF對暴露于納米銅的線蟲模型中元素分布進行了研究, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)納米銅暴露后, 線蟲體內(nèi)銅、鉀元素含量明顯增加, 而且銅在體內(nèi)的分布也發(fā)生改變. He等人16利用同步輻射X射線熒光及ICP-MS技術(shù)研究了稀土長期暴露6個月后對大鼠腦中微量元素分布的影響, 發(fā)現(xiàn)40 mg/kg劑量組大鼠經(jīng)稀土氯化鑭和氯化鐿長期暴露后, 稀土La和Yb有明顯的蓄積, 提示稀土可通過血腦屏障進入大腦, 同時腦中Mg、Ca、Fe、Cu、Zn、Mn和Co等微量元素的分布發(fā)生了變化

16、. 此外, 稀土在血清、肝臟和骨頭中都有蓄積, 而且Mg、Ca、Fe、Cu、Zn、Mn和Co等元素的分布也發(fā)生了變化. 對樣品進行線掃描(一維或面掃描(二維可得到細胞、組織或器官切片中金屬組分布的信息, 但這些信息均基于對樣品表面掃描的結(jié)果. 要獲得樣品的立體信息, 就需要對其進行三維掃描(3D SR-XRF. 利用共聚焦系統(tǒng)可實現(xiàn)樣品的三維掃描, 其深度分辨率可達1040 m, 而其檢測限可達亞mg/kg級17. 除3D SR-XRF外, 同步輻射微束熒光CT(SR-XRF computerized tomography同樣可實現(xiàn)樣品的三維掃描, 其空間分辨率為12 m18.X熒光還可與電子

17、顯微鏡如透射電子顯微鏡(TEM或掃描電子顯微鏡(SEM結(jié)合用于測定擬南芥的根、莖, 小鼠肝組織及錐體神經(jīng)元中金屬的空間分布研究19,20. 雖然SEM-EDX及TEM-EDX 的分辨率可達10 nm左右, 但其檢測限較差, 在g/kg 水平21, 不適用于生物樣品中微量元素研究.利用微區(qū)掃描PIXE同樣可研究動植物組織及人血細胞、腫瘤細胞中金屬組的分布2224. 同時, 利用共聚焦技術(shù), 三維微區(qū)掃描PIXE也已研制成功, 通過檢測由 3 MeV質(zhì)子流激發(fā)產(chǎn)生的Ti-K 特征X光發(fā)射譜線 (4.558 keV, 其空間分辨率可達4 m25.與XRF相比, 質(zhì)譜技術(shù)最大的優(yōu)勢在于更低的檢測限,

18、LA-ICP-MS的檢測限為亞mg/kg級, 分辨率同樣可達到10 m21. 因此, 目前LA-ICP-MS已廣泛應(yīng)用于地學(xué)26,27、生物樣品, 如植物葉子、蛇尾、樹年輪、大鼠腦、人腦切片及人牙齒的金屬組分布研究28,29.二次離子質(zhì)譜(SIMS 是用質(zhì)譜法分析由幾千電子伏能量的一次離子打到樣品靶上濺射產(chǎn)生的正、負二次離子的方法. 其主要優(yōu)點是可以分析包括氫、氦在內(nèi)的幾乎全部元素(不易離子化的稀有氣體元素除外及其同位素, 其檢測限為ng/kg 水平、分辨率為10 m30. SIMS是一種局部破壞性技術(shù), 不適合一些活的生物樣品的檢測, 但也有人利用SIMS研究了大豆根系、葡萄籽、動物組織及細

19、胞等樣品中金屬組的分582中國科學(xué)B輯: 化學(xué) 2009年第39卷第7期布3133. 也正是由于這種局部破壞性特點, 可以通過逐層掃描的方式實現(xiàn)微區(qū)面的成分分析和深度剖析, 兩者結(jié)合即可完成三維微區(qū)分析.表1對以上幾種技術(shù)進行了歸納. 可以看出, SR- XRF, PIXE, LA-ICP-MS及 SIMS均為優(yōu)異的金屬組分布研究技術(shù), 它們的檢測限通常在mg/kg水平且分辨率在m水平. 雖然TEM-EDX及SEM-EDX具有更好的空間分辨率, 但它們的檢測限在g/kg水平, 不適于生物樣品中微量元素分布研究. 與商業(yè)化的LA-ICP-MS及SIMS相比, 依托于大型裝置的SR-XRF 及PI

20、XE的機時有限, 故其應(yīng)用也受到了一定限制.3.3高通量金屬組的形態(tài)及結(jié)構(gòu)分析方法金屬組的分布與結(jié)構(gòu)分析方法的流程可由圖1所示.從圖1可看出, 金屬組形態(tài)及結(jié)構(gòu)分析通常涉及到樣品金屬組提取(酸、堿提取, 酶解、分離(GC、LC、EC及GE等、檢測(ICP-MS及NAA等、鑒定(MALDI-TOF-MS及ESI-MS等及結(jié)構(gòu)分析(PX、XAS、NS等. 上述各步驟需要高通量分析手段才能滿足金屬組學(xué)研究的高通量分析要求. 前面提到: ICP-MS和NAA將具有多元素同時檢測能力, 是高通量元素分析的有力手段, 但這些技術(shù)均不能給出物種信息, 因而形態(tài)分析中需要事先提取金屬組, 并將各含金屬物種分離

21、.表2顯示了分子活化分析技術(shù)(Molecular Acti-vation Analysis, MAA研究微量元素的化學(xué)形態(tài)的例子, 它綜合利用前處理技術(shù)與NAA檢測技術(shù)對生物及環(huán)境樣品中的元素形態(tài)進行分析34.表1 幾種研究金屬組分布的高通量分析技術(shù)的性能方法激發(fā)源可探測元素區(qū)分同位素維數(shù)檢測限分辨率參考文獻SR-XRF 同步輻射X射線周期表中氧以后的元素否13D mg/kg m 33SR-XRF CT 同步輻射X射線周期表中氧以后的元素否3D mg/kg 12m 18EDX X射線管周期表中氧以后的元素否1D, 2D g/kg nm 21PIXE 質(zhì)子周期表中鈉以后的元素否13D mg/kg

22、 4m 25LA-ICP-MS 等離子體幾乎所有元素是1D, 2D mg/kg 10 m 21SIMS 離子束幾乎所有元素是13D ng/kg 10m 30 圖1 聯(lián)用技術(shù)研究金屬組的形態(tài)及結(jié)構(gòu)流程圖其中, LC, 液相色譜; GC, 氣相色譜; EC, 電色譜; GE, 凝膠電流; MALDI-TOF-MS, 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜; ESI-MS, 電噴霧質(zhì)譜; NMR, 核磁共振質(zhì)譜; CD, 圓二色譜; IR, 紅外光譜; PX, 蛋白質(zhì)晶體學(xué)技術(shù); XAS, X射線吸收譜; NS, 中子散射譜583李玉鋒等: 金屬組學(xué):高通量分析技術(shù)進展與展望3.3.1金屬組學(xué)研究中的樣品

23、制備與前處理生物樣品形態(tài)分析時通常涉及到前處理, 濕法消化如酸、堿提取及酶解是最常見的方法. 本步驟中的關(guān)鍵是要求保證樣品中金屬組的形態(tài)不能在酸、堿或酶的作用下發(fā)生變化. 因為在研究樣品中汞的形態(tài)時發(fā)現(xiàn), 前處理可導(dǎo)致某些無機汞轉(zhuǎn)化成甲基汞35,36. 通過超聲波或微波輔助技術(shù), 可以實現(xiàn)樣品的批處理.3.3.2金屬組學(xué)研究中的形態(tài)分離與分析樣品中金屬組經(jīng)提取后, 在進行種態(tài)分析時, 首先需要進行分離, 因為現(xiàn)有元素分析技術(shù)如ICP-MS 或NAA只能檢測元素, 無法得到其形態(tài)信息. 分離手段可包括:(1 基于色譜技術(shù)的分離方法, 如液-固萃取中的HPLC, 固相萃取(solid-phase

24、extraction, SPE和固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME、液-液萃取中的溶劑萃取, 壓力液相萃取(pressurized liquid extraction, PLE及液-氣萃取中的GC和吹掃技術(shù)等37; (2 基于電泳技術(shù)的分離方法, 如1-D、2-D GE, 毛細管電泳(CE, 毛細管區(qū)帶電泳(CZE, 毛細管凝膠電泳(CGE, 膠束電動毛細管(MEKC及毛細管陣列電泳(CAE等38.表2 MAA方法研究的微量元素的化學(xué)形態(tài)研究示例元素研究對象研究目的主要結(jié)果稀土元素植物葉片39,40探討與稀土元素結(jié)合的生物大分子發(fā)現(xiàn)了某些新型與稀土元

25、素結(jié)合的多糖及DNA 鉑素元素白堊紀(jì)-第三紀(jì)地層41,42探討地層中異常鉑素元素的來源無論海泥還是陸地層, 非酸溶相中銥富集約50%I 1. 海草432. 人肝44探討I的分布 1. 海草中一半的碘與蛋白結(jié)合2. 肝細胞中細胞核中碘含量最高, 胞液、線粒體、溶酶體及微粒體中碘含量則依次降低Cr 1. 富鉻酵母452. 大鼠461. 檢驗鉻元素是否進入酵母細胞2. 探討鉻缺乏與糖尿病的關(guān)系1. 鉻可以通過細胞壁進入酵母細胞2. 在患糖尿病大鼠體內(nèi), 鉻參與糖及脂類代謝Hg 人發(fā)47探討汞在母子間的傳播甲基汞很容易從母體轉(zhuǎn)移到胎兒Se 人肝48,49研究硒在人肝細胞的亞細胞組分中分布 1. 幾乎一

26、半的硒存在于細胞核中2. 鑒定了8種含硒蛋白基于色譜技術(shù)的分離方法通常效率較低. 比如, 無論是HPLC還是GC, 都需要單次進樣, 而多個SPE 柱的同時應(yīng)用使得批量分離成為可能. 柱切換(column-switching技術(shù)是另一種可提高分離效率的方法, 其主要優(yōu)點有:(1 前處理簡單, 自動化操作. 樣品只需簡單處理即可將血漿乃至全血直接進樣測定. (2 富集被測組分, 提高了分析靈敏度. 尤其是水溶性較大的組分, 無法用液-液萃取時, HPLC柱切換技術(shù)特別奏效. (3 不需用內(nèi)標(biāo)物. 由于進樣體積較大, 處理樣品的全過程由儀器程序控制, 可獲得很高的精密度與重現(xiàn)性50.基于電泳技術(shù)的

27、分離方法已在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中獲得廣泛的應(yīng)用. 凝膠電泳技術(shù)(GE, 尤其是2D 凝膠電泳技術(shù)是分離蛋白質(zhì)的有力方法, 但若想分析蛋白質(zhì)中的金屬組, 就需要利用ICP-MS及NAA等技術(shù)的配合. 而GE難以與ICP-MS或NAA等金屬組檢測器進行在線聯(lián)用, 故難于實現(xiàn)自動化, 仍屬于低通量方法. 與之相比較, 毛細管電泳(CE可以很容易與其他檢測器連接, 從而實現(xiàn)自動化操作. 目前CE與ICP-MS連接可用于分析檢測金屬卟啉、環(huán)境樣品中Sb的形態(tài)、測定維生素B1等金屬組學(xué)研究中的形態(tài)鑒定通常情況下, 對于已知穩(wěn)定的化合物, 如甲基汞、有機硒、砷或錫化合物等, 可通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品的保

28、留時間比對而得以確認(rèn). 生物體中硒的存在形式有中性和離子形態(tài)的無機和有機硒化合物、硒代氨基酸和各種硒蛋白、含硒蛋白. 喻宏偉等人52建立了在線分離分析生物樣品中含硒化合物的聯(lián)用方法, 用反相離子對高效液相色譜(RP-IP-HPLC分離含硒化合物, 用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS在線分析硒含量, 實現(xiàn)了對硒酸鈉、亞硒酸鈉、硒代胱氨酸、硒代胱胺、硒代蛋氨酸、硒代尿素和三甲基硒離子等7種生物體常見的含硒小分子的分析. 生物樣品中復(fù)雜的基體成分對硒化合物的保留值和峰形影響較小, 且不影響出峰次序, 各含硒化合物加標(biāo)回收率在584中國科學(xué)B輯: 化學(xué) 2009年第39卷第7期93%117%, 定量

29、分析結(jié)果也比較準(zhǔn)確. 此方法操作簡便, 靈敏度高, 重現(xiàn)性好, 適合于各種生物樣品中含硒小分子的形態(tài)分析. Li等人53利用HPLC-ICP-MS 研究了長期汞暴露人群補硒后尿液中汞、硒形態(tài)的變化, 尿中汞主要以無機汞的形式存在, 補硒后尿中硒主要以硒代胱胺酸的形式存在. 但應(yīng)該指出的是具有相同的保留時間并不能保證他們是同一種化合物. 因此, 鑒于生物樣品的復(fù)雜性, 在色譜圖中經(jīng)?？砂l(fā)現(xiàn)無法指認(rèn)的色譜峰, 就需要應(yīng)用分子質(zhì)譜學(xué)技術(shù), 如MALDI-TOF-MS或ESI-MS來確認(rèn)或確定其分子信息. MALDI-TOF-MS通常難以與上述的分離技術(shù)在線聯(lián)用, 而ESI-MS卻可以與HPLC等分離

30、技術(shù)在線連接. 目前, HPLC-ICP-MS與ESI-TOF-MS聯(lián)用已成功鑒定了富硒酵母中的多種含硒化合物54. 在蛋白質(zhì)組學(xué)中普遍使用的凝膠電泳, 由于其高分辨率, 結(jié)合近年快速發(fā)展起來的微量進樣系統(tǒng)和高靈敏度的檢測器(如LA-ICP-MS、Nano HPLC-ICP-MS和Cap HPLC-ICP-MS也越來越多地應(yīng)用于硒蛋白的研究, 而且由于其取樣微量, 在對凝膠中蛋白質(zhì)進行硒定量分析后, 蛋白質(zhì)條帶或斑點中余下部分還可用于MALDI-TOF-MS和Nano HPLC-ESI-MS/MS進行蛋白質(zhì)的識別和測序. 應(yīng)該注意的是, 雖然MALDI- TOF-MS及ESI-MS可用于樣品形

31、態(tài)的鑒定, 但由于它們的檢測限比較差, 故其在金屬組學(xué)中的應(yīng)用也受到了一定的限制.3.3.4金屬組學(xué)研究中的結(jié)構(gòu)分析金屬組學(xué)中的結(jié)構(gòu)分析方法有基于輻射光的方法及核磁共振技術(shù)等.基于輻射光的方法可獲得原子水平的結(jié)構(gòu)信息. 其光源可包括X射線、射線及中子流等. 在基于X射線的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)中, 單晶X射線衍射譜是研究晶體三維結(jié)構(gòu)的強有力工具, 它的分辨率可達0.152 nm, 但由于需要獲得單晶, 故其實際應(yīng)用受到一定的限制. 而X射線吸收譜(XAS, 特別是X射線吸收精細結(jié)構(gòu)光譜(EXAFS無需晶體樣品即可獲得樣品的局域結(jié)構(gòu)信息, 可以原位探測吸收原子的23個鄰近配位殼層,獲得目標(biāo)元素的電子結(jié)構(gòu)信

32、息和化學(xué)結(jié)構(gòu)信息, 其空間分辨率可達0.11 pm55, 所以XAS已成為研究微觀結(jié)構(gòu)重要的手段之一.例如,L i等人56,57利用XAS原位研究了長期汞暴露人群頭發(fā)及血液中汞的形態(tài), 發(fā)現(xiàn)汞主要與硫結(jié)合, 頭發(fā)中汞為三配位, 而血液中汞為四配位. 另外, 通過XAS還可對由單晶X射線衍射譜所得到的結(jié)構(gòu)尤其是局域結(jié)構(gòu)進行精修, 從而獲得更精確的結(jié)構(gòu)信息58.穆斯堡爾譜(Mssbauer spectroscopy同樣是一種研究局域結(jié)構(gòu)的方法, 它是基于射線吸收或發(fā)射的方法59. 穆斯堡爾譜在生物樣品中應(yīng)用的最大局限在于可供檢測的同位素較少. 生物體系中, 穆斯堡爾譜研究最常見的同位素是57Fe,

33、 利用穆斯堡爾譜可以研究生物樣品的鐵蛋白60.采用中子作光源的技術(shù),如單晶中子衍射(SCND可為單晶X射線衍射提供有力的補充, 因為它可以在20 nm的分辨率上研究像氫等的輕元素原子61. 而小角X射線散射(SAXS及小角中子散射(SANS均可以得到固態(tài)或液態(tài)生物樣品的結(jié)構(gòu)信息, 其分辨率為100 nm左右, 同樣他們均不需要獲得樣品的單晶62.核磁共振譜(NMR同樣可以給出樣品的三維結(jié)構(gòu)信息, 其分辨率與單晶X射線衍射相媲美, 達到0.152 nm63. NMR最大的優(yōu)勢是它可在溶液中直接測定, 無需晶體形式的樣品. NMR測定晶體結(jié)構(gòu)的一個問題是, 即使是同一個單晶樣品, NMR可獲得一系

34、列(1050個能夠符合晶胞結(jié)構(gòu)的信息, 而單晶X射線衍射獲得的是一個或只有幾個符合條件的結(jié)構(gòu). 因此, 對NMR獲得的晶體結(jié)構(gòu)常常需要進行再確認(rèn).由于每次只能測定一個樣品, 故上面提到的這些結(jié)構(gòu)表征的方法通常都是低通量研究方法, 但目前已有研究者提出通過高通量XAS(HTXAS的研究方法研究蛋白質(zhì)中的金屬組. 例如, Scott等人64用高通量技術(shù)克隆標(biāo)記表達和純化了源自pyrococcus fu-riosus的大約2200個開讀框架中的25個重要基因, 收集到專門設(shè)計的25孔樣品架中(樣品孔直徑 1.5 mm, 以55方式排列于2.54 cm聚碳酸酯支架上, 每孔裝0.21 mmol/L蛋白

35、質(zhì)溶液3 L(此量遠少于X 射線衍射晶體學(xué)研究和核磁共振研究的樣品用量. 在SSRL的BL9-3B束線上, 用1 mm1 mm的同步輻射光斑分析樣品中的金屬組分布, 然后根據(jù)元素分布情況, 用30元固體探測器對目標(biāo)蛋白進行進一步種態(tài)分析(XANES和結(jié)構(gòu)分析(EXAFS. 利用這種方585李玉鋒等: 金屬組學(xué):高通量分析技術(shù)進展與展望法, 他們在這25種基因產(chǎn)物中檢出了兩個含Ni蛋白和一個含Zn蛋白. 但值得指出的是, 發(fā)展HTXAS仍存在幾個瓶頸. 例如, 如何實現(xiàn)XAS微量樣品自動進樣, 如何實現(xiàn)低含量、微量樣品的測定與數(shù)據(jù)的自動化采集及如何對大量數(shù)據(jù)進行快速處理與分析等.4總結(jié)與展望在金

36、屬組學(xué)研究中, ICP-MS與NAA技術(shù)可實現(xiàn)多元素同時定量分析, 而SR-XRF, 同步輻射微束熒光CT, EDX, PIXE, SIMS及LA-ICP-MS可實現(xiàn)金屬組分布研究. 金屬組的形態(tài)及結(jié)構(gòu)分析通常為低通量方法, 但目前也已有一些方法可實現(xiàn)高通量形態(tài)或結(jié)構(gòu)分析, 如HTXAS.另外, 生物信息學(xué)是一門數(shù)學(xué)、統(tǒng)計、計算機與生物醫(yī)學(xué)交叉結(jié)合的新興學(xué)科, 它已廣泛地滲透到醫(yī)學(xué)的各個研究領(lǐng)域中, 成為生物醫(yī)學(xué)發(fā)展不可缺少的重要工具65. 隨著各種高通量金屬組學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 可以獲得大量數(shù)據(jù), 而處理這些海量數(shù)據(jù)將不可避免地應(yīng)用到生物信息學(xué)技術(shù). 因此, 生物信息學(xué)的方法將極大促進金屬組學(xué)的

37、研究, 并成為金屬組學(xué)的一個重要工具.在基礎(chǔ)研究方面, 金屬組學(xué)將不可避免與蛋白質(zhì)組學(xué)、金屬蛋白組學(xué)、功能蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、代謝組學(xué)等學(xué)科相互交融, 如蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是一種細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì), 而許多蛋白質(zhì)中含有金屬原子的活性中心, 故金屬組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究形成了一門全新交叉學(xué)科, 即金屬蛋白質(zhì)組學(xué)(metalloproteomics, 金屬蛋白組學(xué)將闡述生物體內(nèi)金屬與蛋白質(zhì)和酶等的結(jié)構(gòu)信息, 如三維結(jié)構(gòu)及活性中心、金屬離子的結(jié)合位點以及與之相關(guān)聯(lián)的功能和生物效應(yīng). 本實驗室Gao等人66詳細介紹了金屬蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一些先進核分析方法的應(yīng)用, Wang等人67首次在四級桿ICP

38、-MS上利用柱后同位素稀釋法實現(xiàn)了含硫蛋白質(zhì)混合物的在線分離和定量分析, 為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一種新的方法, 而Shi等人68建立了柱后(post-column反同位素稀釋法(reverse isotope dilution, RID對示蹤動物組織胞液中汞結(jié)合蛋白的含量進行定量的方法, 該方法可以克服生物樣品微量元素化合物分析中靈敏度低和標(biāo)準(zhǔn)蛋白不足的缺點, 有利于對生物體內(nèi)低豐度金屬結(jié)合蛋白進行分離和定量分析研究.金屬組學(xué)中的金屬元素, 不僅包括與蛋白質(zhì)和酶結(jié)合的生物金屬, 還包含金屬-核酸、金屬-小分子配體(有機酸、氮基酸等、金屬-多糖等、自由離子以及不同價態(tài)等所有存在形式, 金屬組

39、學(xué)研究對于全面闡述金屬元素在生物體內(nèi)的富集和代謝機制及其生物功能, 對于理解各種重要的生物學(xué)現(xiàn)象將有重要意義.致謝本工作得到國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 10490180、國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(編號:2006CB705603和中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程項目(批準(zhǔn)號: KJCX3-SYW-N3資助, 特此一并致謝.參考文獻1 Mertz W. The essential trace elements. Science, 1981, 213(4514: 13321338DOI2 Haraguchi H, Matsuura H. Chemical speciation for metallomics.

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