自穩(wěn)定反義IGF1R基因片段對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響

1、    自穩(wěn)定反義IGF1R基因片段 對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響         【摘要】目的探討針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1 R ）基因的自穩(wěn)定反義脫氧寡核苷酸（ODN）對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響。方法采用RTPCR、Western blot、MTT試驗(yàn)、流式細(xì)胞儀對(duì)經(jīng)反義ODN作用后的T24膀 胱癌細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。結(jié)果自穩(wěn)定反義ODN在血 清培養(yǎng)基中24h內(nèi)均保持穩(wěn)定狀態(tài)，而硫代反義ODN 4h后基本降解。自穩(wěn)定反義ODN可有效降 低T24膀胱癌細(xì)胞IGF1R基因及蛋

2、白表達(dá)，增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對(duì)絲裂霉素的敏感性及凋亡易感性 。結(jié)論IGF1R基因的自穩(wěn)定反義ODN可能是一種治療膀胱腫瘤的 新途徑。【關(guān)鍵詞】基因膀胱腫瘤癌Effects of self-stablized antisense oligodeoxynucleotide targete d against IGF1R gene on T24 bladder cancer cellsSUN Hongzhi, FAN Jie, TANG Xiaoda.Department of Urology, Shanghai First People s Hospital Shanghai,200080,China【

3、Abstract】ObjectiveTo evaluate the effects of self- stablized antisense oligodeoxynucleotide （ODN） targeted against insulin-like growth factor 1 receptor(IGF1R) gene on T24 bladder cancer cells.MethodsSemiquantitative RT-PCR, Western blot , MTT determ ination, flow cytometry were used to study the ef

4、fects of self-stablized antisense ODN on IGF1R gene expression, protein synthesis, drug sensitivity and apoptosis of T24 cells.ResultsTh e self-stablized antisense ODN was stable in culture medium for 24 hours, where as phosphorothiate ODN were almost degradated after 4 hours in the same condition.

5、After treate d with self-stablized antisense ODN specific for IGF1R gene, the intrinsic mRNA expression of IGF1R gene were reduced approximately by 84.3%（phosphoroth iate ODN: 74.0%）, the protein synthesis of IGF1R were downregulated by 77.0% （phosphorothiate ODN: 61.3%）, which caused targeted cells

6、 to be m ore sensitive to mitomycin induced apoptosis （P<0.05）.Conclus ionsThese data showed antisense ODN with ability of anti-degradati on could effectively reduce IGF1R gene expressions and protein synthesis of T24 cells and could significantly enhance apoptotic sensitivity of T24 cells to bla

7、d der instilation drug-mitomycin.These suggested that IGF1R antisense ODN may serve as a potential therapeutic approach to bladder cancer.【Key words】GenesBladder neoplasmsCarcinoma胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)信號(hào)傳遞通路在腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡調(diào)控等方面 具有重要作用1。我們采用自穩(wěn)定反義脫氧寡核苷酸(ODN)阻斷IGF1R基因表達(dá)， 以探討阻斷自分泌對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響，為探索膀胱腫瘤治療新途徑提供可行性依

8、據(jù)。材料與方法一、細(xì)胞培養(yǎng)T24膀胱癌細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所提供，常規(guī)培養(yǎng)于含有10小牛血清的RPMI 16 40（GIBCO公司產(chǎn)品）中，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。二、反義ODN的設(shè)計(jì)合成IGF1R硫代反義ODN設(shè)計(jì)參閱文獻(xiàn)2，其序列為：5'TCCTCCGGAGCCAGA*C*T*T*3' （*表示硫代修飾部位）;正義序列為5'AAGTCTGGCTCCGGA*G*G*A*3'。自穩(wěn)定反義OD N序列由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞學(xué)研究所用oligo 5.0 軟件設(shè)計(jì)，序列如下：<"01 (1067 bytes)" src="/m

9、ed/cano/201003/20100312173419195" 238 97>     以上序列由美國(guó)Cybersyn公司合成。ODN轉(zhuǎn)染T24膀胱癌細(xì)胞采用非脂質(zhì)體配方的F uGENETM6轉(zhuǎn)染試劑（德國(guó)Roche公司產(chǎn)品），轉(zhuǎn)染方法按說(shuō)明書進(jìn)行。三、反義ODN在血清培養(yǎng)液中穩(wěn)定性的測(cè)定分別將IGF1R硫代反義ODN及自穩(wěn)定反義ODN 5'端脫磷，-32P-dATP標(biāo)記后加 入含有20小牛血清的RPMI 1640中，終濃度為10mol/L，于0、1、2、4、6、12、24 h取樣進(jìn)行變性PAGE凝膠電泳，-20自顯影48h。

10、以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。四、反義ODN對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響1.自穩(wěn)定反義ODN對(duì) T24膀胱癌細(xì)胞IGF1R基因表達(dá)的影響：T24細(xì)胞按5×106/瓶接種于3 cm×5cm培養(yǎng)瓶中，分為 T24對(duì)照組、正義ODN組（10mol/L）、硫代反義ODN組（10 mol/L），自穩(wěn)定反義ODN組（10mol/L），以高度表達(dá)IGF1R的K562白血病細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì) 照組，培養(yǎng)48h后抽取RNA（Triral試劑，GIBCO公司）。IGF1R、-actin基因引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)3進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR產(chǎn)物經(jīng)SynGene（美國(guó)）凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶分析。所 檢測(cè)指標(biāo)的mRNA表達(dá)量用相對(duì)表

11、達(dá)量， 即檢測(cè)指標(biāo)/-actin，數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn) 行配對(duì)t檢驗(yàn)。2.自穩(wěn)定反義ODN對(duì) T24膀胱癌細(xì)胞IGF1R蛋白表達(dá)的影響：T24細(xì)胞按1×107/瓶接種于5 cm×8cm培養(yǎng)瓶中，分組同實(shí)驗(yàn)1。各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后，Western blot 步驟按文獻(xiàn)2 進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。顯影結(jié)果經(jīng)SynGene凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。數(shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。3.MTT檢測(cè)反義ODN對(duì)T24藥物敏感性的影響：T24細(xì)胞按5×104/孔接種于96孔板, 37培 養(yǎng)12h。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分五組：(1)T24空白對(duì)照組；(2)正義 ODN組（

12、10mol/L）；(3) 絲裂霉素（MMC，日本Tokyo公司產(chǎn)品）組，根據(jù)我室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，終濃度為0.2mol/L， 以MMC預(yù)處理2h后更換無(wú)MMC培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；(4)硫代反義ODN（10mol/L）聯(lián)合MMC組，T2 4細(xì)胞經(jīng)反義ODN預(yù)處理24h，再加入MMC（濃度同上）預(yù)處理2h后更換無(wú)MMC 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；(5)自穩(wěn)定反義ODN（10mol/L）聯(lián)合MMC組，處理同第4組。MTT實(shí) 驗(yàn)按文獻(xiàn)1進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行student's檢驗(yàn)。4. 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡：實(shí)驗(yàn)分組及各組間處理情況同實(shí)驗(yàn)3。流式細(xì)胞儀分析按文獻(xiàn)4進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用2檢驗(yàn)。

13、 結(jié)果一、自穩(wěn)定反義ODN穩(wěn)定性測(cè)定于20血清溫育0、1、2、4、6、12、24h后，變性聚丙烯酰胺電泳顯示自穩(wěn)定反義ODN在各 時(shí)相點(diǎn)均為完整形式，而硫代反義ODN在4h后基本降解。二、反義ODN對(duì)IGF1R基因表達(dá)的影響T24空白對(duì)照組IGF1R mRNA相對(duì)表達(dá)量為 1.37±0.17，經(jīng)硫代反義ODN作用后IGF1R mRNA 相對(duì)表達(dá)量為 0.37±0.07, 較T24空白對(duì)照組下降74(P0.001)；經(jīng)自穩(wěn)定反義O DN作用后IGF1R mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.22±0.13,較T24空白對(duì)照組下降84.3%（P<0.001） 。而正義ODN組

14、IGF1R mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.29±0.27，與T24空白對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性 (P0.05)。三、反義ODN對(duì)IGF1R蛋白表達(dá)的影響(1)     1反義ODN對(duì)T24細(xì)胞IGF1R蛋白表達(dá)的影響1、2：T24空 白對(duì)照組；3、4：硫代反義ODN組；5、6；自穩(wěn)定反義ODN組；7、8：K562陽(yáng)性對(duì)照組 灰度分析結(jié)果表明，T24空白對(duì)照組灰度值為 1614±156，經(jīng)硫代反義ODN處理后，灰度值 為621±27，IGF1R蛋白表達(dá)量下降61.3%(P0.01)，經(jīng)自穩(wěn)定反義ODN處理后，灰度 值為276±

15、;186，IGF1R蛋白表達(dá)量下降77.0%(P0.01)。四、反義ODN對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞藥物敏感性的影響MTT檢測(cè)不同濃度IGF1R反義ODN對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞藥物敏感性的影響(A560值)見表1。T24空白 對(duì)照組、正義ODN組及0.2mol/L MMC處理組間差異無(wú)顯 著性(P0.05)，經(jīng)10mol/L硫代反義ODN及5mol/L、10mol/L自穩(wěn)定ODN處理后， T24膀胱癌細(xì)胞對(duì)MMC的藥物敏感性顯著增強(qiáng)，與T24空白對(duì)照組相比P均0.01，與M MC組相比，P均0.05。表1不同濃度IGF1R 反義ODN對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞藥物敏感性的影響(A560值)組別5mol/L10mo

16、l/LT24空白對(duì)照組1.17±0.191.17±0.19正義ODN組1.08±0.181.15±0.16MMC組0.95±0.280.92±0.15硫代反義ODN+MMC組0.46±0.010.32±0.04自穩(wěn)定反義ODN+MMC組0.31±0.050.25±0.03     五、流式細(xì)胞儀分析結(jié)果經(jīng)反義ODN及反義ODN聯(lián)合MMC處理后，在G1期前可檢測(cè)到有特征性的亞二倍體DNA 峰，即凋亡峰。各組細(xì)胞凋亡率：T24空白對(duì)照組為(3.9±3

17、.59)%,MMC組為(12±4.8)%, 硫代反義ODN（10mol/L）組為(25.8±2.08)%, 硫代反義ODN（10mol/L）聯(lián)合MMC 組為(57.2±2.8)%,自穩(wěn)定反義ODN（10mol/L）組為24.9%, 自穩(wěn)定反義ODN（10mol/L） 聯(lián)合MMC組為(59.6±1.2)%。反義ODN組（包括硫代及自穩(wěn)定反義ODN）與T24空白對(duì)照組 、 反義ODN聯(lián)合MMC組與T24空白對(duì)照組、反義ODN聯(lián)合MMC組與MMC組之間分別比較差異均有顯著 性（P均<0.05）。 討論ODN通過序列特異性抑制靶基因表達(dá)，成為可在基因水平調(diào)

18、控的分子信息藥物。作為第一代 反義核酸硫代反義ODN已應(yīng)用于臨床，但其存在因非特異性而導(dǎo)致的副作用，呈劑量依 賴性，此與硫代ODN骨架的多陰離子特性有關(guān)5。近年來(lái)，根據(jù)天然反義RNA 構(gòu)象設(shè)計(jì)的3'端帶有發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的自穩(wěn)定反義ODN在體內(nèi)的作用效果明顯優(yōu)于硫代 反義ODN，具有應(yīng)用前景6。反義ODN治療膀胱腫瘤的優(yōu)勢(shì)為可以局部集中用藥，相對(duì)組織呈特異性分布。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示自穩(wěn)定反義ODN在血清中的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于3'端硫代修飾的寡核苷 酸，提示其可能為一種有效的修飾方法。反義ODN作用機(jī)理為：(1)抑制轉(zhuǎn)錄，反義ODN與DN A結(jié)合局部形成三鏈結(jié)構(gòu)，干擾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合；(2)抑制

19、mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸，抑制 mRNA的拼接；(3)激活RNA酶H，降解mRNA；(4)和靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合抑制翻譯過程等2 。IGF1R基因的自穩(wěn)定反義ODN可有效降低T24細(xì)胞IGF1R基因及蛋白表達(dá)，增 強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)膀胱灌注藥物的敏感性及凋亡易感性，為其在臨床的應(yīng)用提供了可行性依據(jù)。 IGF1R作為自分泌環(huán)路中的重要信號(hào)傳遞通路，在腫瘤增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等方面 具有重要意義，膀胱腫瘤可高度表達(dá)IGF1R，而正常膀胱粘膜組織則表達(dá)量很低4 。研究發(fā)現(xiàn)，IGF系統(tǒng)與抗凋亡基因P53、bcl家族聯(lián)系密切，IGF系統(tǒng)可調(diào)節(jié)p53、bcl家族基 因表達(dá)7，阻斷IGF1R信號(hào)傳遞通路后，膀

20、胱腫瘤細(xì)胞凋亡的易感 性增強(qiáng)，其機(jī)制有待深入研究。作者單位：孫宏志(200080 上海市第一人民醫(yī)院泌尿外科研究室)凡杰(200080 上海市第一人民醫(yī)院泌尿外科研究室)唐孝達(dá)(200080 上海市第一人民醫(yī)院泌尿外科研究室)參考文獻(xiàn)1，Baserga R. The IGF-1 receptor in cell growth, transformation an d apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta ,1997，1332105-126.2，Resnicoff M,Coppola D, Sell C，et al. Growth inhibition of human melanoma cel ls in nude mice by antisense strategies to the type 1 insulin-like growth facto r receptor. Cancer Res,1994，544848-4850.3，Otu AS,Bell RS, Ohash