生姜蛋白酶的生物大分子修飾ppt課件

1、生姜蛋白酶的大分子結(jié)合修飾生姜蛋白酶的大分子結(jié)合修飾劉恩岐，張建萍，賀菊萍文章來源：生物谷u報(bào)告人：u 西安交通大學(xué) u 10122019u 申世紅 生姜及生姜蛋白酶的簡介生姜及生姜蛋白酶的簡介生姜蛋白酶：是在繼木瓜蛋白酶等以后發(fā)現(xiàn)的一種新的植物蛋白酶，它在結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上與木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶以及無花果蛋白酶等具有很多的相似性，被認(rèn)為是木瓜蛋白酶家族的又一新成員。 運(yùn)用： 醫(yī)藥工業(yè)；食品工業(yè)； 日化工業(yè)；飼料工業(yè)； 皮革工業(yè) 生姜及生姜蛋白酶的簡介生姜及生姜蛋白酶的簡介l文章背景知識：文章背景知識：l 1.天然生姜中蛋白酶的缺點(diǎn)：穩(wěn)定性差、天然生姜中蛋白酶的缺點(diǎn)：穩(wěn)定性差、失活快，限制了生姜蛋

2、白酶在生產(chǎn)中的推失活快，限制了生姜蛋白酶在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。廣應(yīng)用。l 2.修飾方法：大分子結(jié)合修飾是目前應(yīng)修飾方法：大分子結(jié)合修飾是目前應(yīng)用最廣的酶蛋白修飾方法之一，對提高酶用最廣的酶蛋白修飾方法之一，對提高酶活力、增強(qiáng)穩(wěn)定性具有顯著效果。活力、增強(qiáng)穩(wěn)定性具有顯著效果。 l 3.常用的修飾劑：常用的修飾劑：l 聚乙二醇：聚乙二醇聚乙二醇：聚乙二醇(PEG)是一種是一種線性、無毒且不帶電的水溶性大分子。線性、無毒且不帶電的水溶性大分子。l 右旋糖苷：由右旋糖苷：由D- 葡萄糖通過葡萄糖通過-1,6 糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性的生

3、物相容性和水溶性 。 文章結(jié)構(gòu)文章結(jié)構(gòu) 材料與方法結(jié)果與分析結(jié)果與分析結(jié)論與討論結(jié)論與討論材料與試劑：材料與試劑： 生姜市售鮮生姜）；單甲氧基聚乙二醇生姜市售鮮生姜）；單甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)；右旋糖苷右旋糖苷(dextran40000)；三聚氯氰；三聚氯氰(C3Cl3N3)；高；高碘酸鈉；碘酸鈉；2,4,6- 三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸 (TNBS)；硼氫化鈉；聚乙；硼氫化鈉；聚乙二醇二醇(PEG20000)儀器與設(shè)備：儀器與設(shè)備： PHS-3C 精密精密pH 計(jì)；計(jì)；THZ-82 型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 廠；廠；HJ-3 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器；型數(shù)顯恒溫磁力

4、攪拌器；TU-1810 紫外紫外- 可見可見分光光度計(jì)分光光度計(jì) LGJ-18A 型冷凍干燥機(jī)型冷凍干燥機(jī)第一部分：材料與方法第一部分：材料與方法l方法：方法：l 生姜蛋白酶的制備：生姜蛋白酶的制備：l 1.將新鮮生姜洗凈、切丁，每將新鮮生姜洗凈、切丁，每1kg 生姜加生姜加入入4預(yù)冷的磷酸緩沖液預(yù)冷的磷酸緩沖液2L。用高速組織搗。用高速組織搗碎機(jī)攪碎制成勻漿，離心棄渣取上清液。碎機(jī)攪碎制成勻漿，離心棄渣取上清液。l 2.將離心姜液進(jìn)行超濾處理，得到相對分將離心姜液進(jìn)行超濾處理，得到相對分子質(zhì)量大于子質(zhì)量大于10000、小于、小于50000 的生姜蛋的生姜蛋白酶濃縮液。將生姜蛋白酶濃縮液與白酶

5、濃縮液。將生姜蛋白酶濃縮液與4預(yù)預(yù)冷的丙酮按一定的比例混合數(shù)據(jù)來源于本冷的丙酮按一定的比例混合數(shù)據(jù)來源于本文參考文獻(xiàn)），離心棄上清液，取沉淀自然文參考文獻(xiàn)），離心棄上清液，取沉淀自然風(fēng)干，制得生姜蛋白酶粗粉。風(fēng)干，制得生姜蛋白酶粗粉。l 3.將生姜蛋白酶粗粉用磷酸緩沖液溶解后，將生姜蛋白酶粗粉用磷酸緩沖液溶解后，經(jīng)葡聚糖凝膠經(jīng)葡聚糖凝膠G-200 和二乙氨基乙基纖維和二乙氨基乙基纖維素素DE52 進(jìn)行兩次柱層析純化，透析脫鹽后進(jìn)行兩次柱層析純化，透析脫鹽后經(jīng)冷凍干燥得到生姜蛋白酶純品經(jīng)冷凍干燥得到生姜蛋白酶純品第一部分：材料與方法第一部分：材料與方法u 生姜蛋白酶活力的測定生姜蛋白酶活力的測定

6、u原理：原理：u 生姜蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸，在堿性環(huán)生姜蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸，在堿性環(huán)境下，酪氨酸與福林試劑作用產(chǎn)生有色物質(zhì)，于波境下，酪氨酸與福林試劑作用產(chǎn)生有色物質(zhì)，于波長長660nm 處進(jìn)行光密度處進(jìn)行光密度(OD)測定。測定。u 光密度與酪氨酸的濃度成正比。光密度與酪氨酸的濃度成正比。u 酪氨酸的量來表示生姜蛋白酶分解蛋白質(zhì)的能酪氨酸的量來表示生姜蛋白酶分解蛋白質(zhì)的能力。力。u（在這里筆者定義：在（在這里筆者定義：在40、pH6.0 條件下，每條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1g 酪氨酸，定義為酪氨酸，定義為1 個(gè)蛋個(gè)蛋白酶活力單位。具體測定方法參見白酶活力單

7、位。具體測定方法參見SB/T 10317 2019蛋白酶活力測定法。）蛋白酶活力測定法。）材料與方法：生姜蛋白酶酶活力測定材料與方法：生姜蛋白酶酶活力測定u單甲氧基聚乙二醇對生姜蛋白酶的修飾單甲氧基聚乙二醇對生姜蛋白酶的修飾u單甲氧基聚乙二醇單甲氧基聚乙二醇(mPEG)的活化：的活化：u 采用三聚氯氰活化法采用三聚氯氰活化法7-8（此處筆者僅提供了（此處筆者僅提供了參考文獻(xiàn)）參考文獻(xiàn)）u活化活化mPEG 化學(xué)修飾生姜蛋白酶的制備：化學(xué)修飾生姜蛋白酶的制備：u 在酶液質(zhì)量濃度為在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL 的生姜蛋白酶的生姜蛋白酶硼酸緩沖液中，加入一定比例的活化硼酸緩沖液中，加入一定比例的活

8、化mPEG 修飾劑，修飾劑，于于40水浴中保溫反應(yīng)水浴中保溫反應(yīng)lh;u 磷酸緩沖液磷酸緩沖液(0.lmol/L，pH7.0)中透析中透析24h，用截留相對分子質(zhì)量為用截留相對分子質(zhì)量為10000 的超濾膜超濾，截的超濾膜超濾，截留濃縮液，冷凍干燥即得留濃縮液，冷凍干燥即得mPEG 修飾的生姜蛋白酶。修飾的生姜蛋白酶。u 。通過酶修飾率和修飾酶的活力測定，探討活。通過酶修飾率和修飾酶的活力測定，探討活化化mPEG 的用量和的用量和pH 值對修飾效果的影響。值對修飾效果的影響。材料與方法：單甲氧基聚乙二醇對生姜蛋白酶的修飾材料與方法：單甲氧基聚乙二醇對生姜蛋白酶的修飾 材料與方法：右旋糖苷對生姜

9、蛋白酶的修飾材料與方法：右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾右旋糖苷的活化右旋糖苷的活化: 采用高碘酸鈉活化法此處筆者僅提供了參考文采用高碘酸鈉活化法此處筆者僅提供了參考文獻(xiàn)）獻(xiàn)）活化右旋糖苷化學(xué)修飾生姜蛋白酶的制備：活化右旋糖苷化學(xué)修飾生姜蛋白酶的制備： 在酶液質(zhì)量濃度為在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL 的生姜蛋白酶的生姜蛋白酶硼酸緩沖液中，加入一定比例的活化右旋糖苷修飾硼酸緩沖液中，加入一定比例的活化右旋糖苷修飾劑，于劑，于40水浴中保溫反應(yīng)水浴中保溫反應(yīng)lh，添加，添加NaBH4(50mg/mL)終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。 調(diào)調(diào)pH 值至值至7.0，對

10、水透析，對水透析4h，再用，再用PEG20000 反透析濃縮后，冷凍干燥即得修飾的反透析濃縮后，冷凍干燥即得修飾的生姜蛋白酶生姜蛋白酶12。 。通過酶修飾率和修飾酶的活力測定，探討活。通過酶修飾率和修飾酶的活力測定，探討活化右旋糖苷的用量和化右旋糖苷的用量和pH 值對修飾效果的影響。值對修飾效果的影響。 酶修飾率的測定酶修飾率的測定u 酶修飾率的測定：酶修飾率的測定：u方法：采用方法：采用TNBS 法；法；u原理：酶蛋白表面的游離氨基與過量的原理：酶蛋白表面的游離氨基與過量的2,4,6- 三三硝基苯磺酸硝基苯磺酸(TNBS)反響，生成三硝基苯酚的衍生反響，生成三硝基苯酚的衍生物，在物，在335

11、nm 波長處有最大吸收峰。波長處有最大吸收峰。u過程：過程：u 取取1mL 含含1mg 生姜蛋白酶的溶液，加入生姜蛋白酶的溶液，加入1mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、pH8.5 的碳酸氫鈉溶液和的碳酸氫鈉溶液和1mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的十二烷基磺酸鈉溶液，的十二烷基磺酸鈉溶液，20min 后加入后加入1mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 的的2,4,6- 三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸(TNBS)溶液，溶液，40保溫保溫2h； 酶修飾率的測定酶修飾率的測定u 酶修飾率的測定：酶修飾率的測定：u過程：過程：u 335nm 波長處測定吸光度。同樣濃度的酶液波長處測定吸光度。同樣濃度的酶液在修

12、飾反應(yīng)后與反應(yīng)前吸光度之比即為殘留氨基量。在修飾反應(yīng)后與反應(yīng)前吸光度之比即為殘留氨基量。u數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理:u 式中：式中：A1 為酶液修飾反應(yīng)前吸光度；為酶液修飾反應(yīng)前吸光度；u A2 為酶液修飾反應(yīng)后的吸光度。為酶液修飾反應(yīng)后的吸光度。u 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析l活化活化mPEG mPEG 對生姜蛋白酶修飾條件的篩選對生姜蛋白酶修飾條件的篩選l活化活化mPEG mPEG 用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響l 在酶液質(zhì)量濃度為在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL2.0mg/mL、pH9.0 pH9.0 硼酸緩沖液中，硼酸緩沖液中，于于4040條件下修飾

13、反應(yīng)條件下修飾反應(yīng)lhlh，活化，活化mPEG mPEG 用量對生姜蛋白酶的用量對生姜蛋白酶的修飾率和相對酶活力修飾率和相對酶活力( (修修 飾酶活力飾酶活力/ / 天然酶活力天然酶活力) )的影響見的影響見表表1 1l 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析活化活化mPEG mPEG 用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響 u圖表分析：圖表分析：u mPEG 和酶的比例決定了氨基修飾率的大小，隨和酶的比例決定了氨基修飾率的大小，隨著活化著活化mPEG 加入量的增加，生姜蛋白酶的修飾率呈上加入量的增加，生姜蛋白酶的修飾率呈上升趨勢，酶活力呈下降趨勢。升趨勢，酶活力呈下降

14、趨勢。u 當(dāng)當(dāng)mPEG 與酶的質(zhì)量比為與酶的質(zhì)量比為17.5:1.0 時(shí)，酶修飾率時(shí)，酶修飾率為為51.3%，酶活回收率，酶活回收率(相對酶活力相對酶活力)為為52.2%，再增加，再增加mPEG 的量，修飾率不再增加，酶的活力也幾乎沒有變的量，修飾率不再增加，酶的活力也幾乎沒有變化，化，u 因此選擇因此選擇mPEG與酶質(zhì)量比為與酶質(zhì)量比為17.5:1.0 作為生姜作為生姜蛋白酶化學(xué)修飾較佳的蛋白酶化學(xué)修飾較佳的mPEG 用量。用量。 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析l活化活化mPEG mPEG 對生姜蛋白酶修飾條件的篩選對生姜蛋白酶修飾條件的篩選lpH pH 值對值對mPEG mPEG

15、 修飾生姜蛋白酶效果的影響修飾生姜蛋白酶效果的影響l 在在1.0mL 1.0mL 酶液質(zhì)量濃度為酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL 2.0mg/mL 的硼酸緩沖液的硼酸緩沖液中加入中加入35mg 35mg 活力化的活力化的mPEGmPEG，不同，不同pH pH 值條件對生姜蛋白酶的值條件對生姜蛋白酶的修飾率和相對酶活力的影響見表修飾率和相對酶活力的影響見表2 2。l 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析pH pH 值對值對mPEG mPEG 修飾生姜蛋白酶效果的影響修飾生姜蛋白酶效果的影響u圖表分析：圖表分析：u 隨著隨著pH 值的增大，生姜蛋白酶的修飾率增大，相值的增大，生姜蛋白酶的修飾率增

16、大，相對酶活力也在增大，但是當(dāng)對酶活力也在增大，但是當(dāng)pH 值達(dá)到值達(dá)到10.0 時(shí)，酶修飾時(shí)，酶修飾率與相對酶活力反而有所下降。率與相對酶活力反而有所下降。u 說明酶分子對環(huán)境的說明酶分子對環(huán)境的pH 值敏感。其原因?yàn)椋褐得舾?。其原因?yàn)椋簆H 值值能引起酶分子中可離解極性基團(tuán)的離解狀態(tài)和電荷改變，能引起酶分子中可離解極性基團(tuán)的離解狀態(tài)和電荷改變，不僅影響修飾效果，也改變了未修飾酶的構(gòu)型和構(gòu)象，不僅影響修飾效果，也改變了未修飾酶的構(gòu)型和構(gòu)象，從而影響了酶活性。從而影響了酶活性。u 在在pH9.0 時(shí)，酶修飾率和相對酶活力均較高，因此時(shí)，酶修飾率和相對酶活力均較高，因此選擇選擇pH9.0 為最佳

17、修飾為最佳修飾pH 值。值。 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析l活化右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾條件的篩選活化右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾條件的篩選l活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響l 在酶液質(zhì)量濃度為在酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL2.0mg/mL、pH6.0 pH6.0 硼酸緩沖液中，硼酸緩沖液中，于于4040條件下修飾反應(yīng)條件下修飾反應(yīng)lhlh，活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶，活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶的修飾率和相對酶活力的影響見表的修飾率和相對酶活力的影響見表3 3 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶

18、修飾效果的影響活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響 u圖表分析：圖表分析：u 隨右旋糖苷修飾劑用量的增加，修飾率和隨右旋糖苷修飾劑用量的增加，修飾率和相對酶活力均呈上升趨勢，當(dāng)右旋糖苷與酶質(zhì)量相對酶活力均呈上升趨勢，當(dāng)右旋糖苷與酶質(zhì)量比為比為42:1 時(shí)，生姜蛋白酶氨基修飾率為時(shí)，生姜蛋白酶氨基修飾率為50.8%，相對酶活力為相對酶活力為328%，再增加右旋糖苷的量，修，再增加右旋糖苷的量，修飾率和酶的活力均有所降低飾率和酶的活力均有所降低u 因此選擇右旋糖苷與酶質(zhì)量比為因此選擇右旋糖苷與酶質(zhì)量比為42:1 作為作為生姜蛋白酶化學(xué)修飾較佳的右旋糖苷用量。生姜蛋白酶化學(xué)修飾較佳的右旋糖苷用

19、量。 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析l活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響活化右旋糖苷用量對生姜蛋白酶修飾效果的影響lpH pH 值對右旋糖苷修飾生姜蛋白酶效果的影響值對右旋糖苷修飾生姜蛋白酶效果的影響l 在在1.0mL 1.0mL 酶液質(zhì)量濃度為酶液質(zhì)量濃度為2.0mg/mL 2.0mg/mL 的硼酸緩沖液中的硼酸緩沖液中加入加入84mg 84mg 活化的右旋糖苷，不同活化的右旋糖苷，不同pH pH 值條件對生姜蛋白酶的值條件對生姜蛋白酶的修飾率和相對酶活力的影響見表修飾率和相對酶活力的影響見表4 4。 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析pH pH 值對右旋糖苷修飾生姜

20、蛋白酶效果的影響值對右旋糖苷修飾生姜蛋白酶效果的影響u圖表分析：圖表分析：u 在在pH 值中性至堿性的情況下，右旋糖苷值中性至堿性的情況下，右旋糖苷對生姜蛋白酶的修飾率呈明顯降低的趨勢；對生姜蛋白酶的修飾率呈明顯降低的趨勢；u 在在pH 值偏酸性的條件下，修飾率和相對值偏酸性的條件下，修飾率和相對酶活力均較高；在酶活力均較高；在pH6.0 時(shí)，酶修飾率為時(shí)，酶修飾率為52.3%，修飾酶活性是天然酶的修飾酶活性是天然酶的3.3 倍；倍；u 因此選擇因此選擇pH6.0 為最佳修飾為最佳修飾pH 值。值。 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析lmPEG mPEG 和右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果的

21、比較和右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果的比較l 在實(shí)驗(yàn)確定的較佳修飾條件下，活化的在實(shí)驗(yàn)確定的較佳修飾條件下，活化的mPEG mPEG 和右和右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果的比較見表旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果的比較見表5 5結(jié)論：兩種修飾劑對生姜蛋白酶的修飾率接近，均結(jié)論：兩種修飾劑對生姜蛋白酶的修飾率接近，均52% 左右；左右；mPEG 修飾酶的殘留相對酶活力為修飾酶的殘留相對酶活力為54.0%，右旋糖苷修飾酶的，右旋糖苷修飾酶的活性是天然酶的活性是天然酶的3.3 倍，所以右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果較倍，所以右旋糖苷對生姜蛋白酶修飾效果較好。好。 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析l修飾酶

22、與天然酶熱穩(wěn)定性的比較修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較l研究方法：研究方法：l 將將mPEG mPEG 修飾酶、右旋糖苷修飾酶與天然酶分別在修飾酶、右旋糖苷修飾酶與天然酶分別在4040、6060和和8080條件下保溫條件下保溫1010、30min 30min 和和60min60min，然后測定不同，然后測定不同熱處理時(shí)間的相對酶活力。生姜蛋白酶天然酶與兩種修飾酶熱處理時(shí)間的相對酶活力。生姜蛋白酶天然酶與兩種修飾酶熱穩(wěn)定性的比較結(jié)果見表熱穩(wěn)定性的比較結(jié)果見表6 6。l 注：天然酶活力為注：天然酶活力為106.3U/mg106.3U/mg，相對酶活力，相對酶活力/%=(/%=(不同不同熱處理殘留酶活力

23、熱處理殘留酶活力/106.3) /106.3) 100 100；mPEG mPEG 修飾酶活力為修飾酶活力為55.6U/mg55.6U/mg，相對酶活力，相對酶活力/%=(/%=(不同熱處理殘留酶活不同熱處理殘留酶活/55.6)/55.6) 100100；右旋糖苷修飾酶活力為；右旋糖苷修飾酶活力為317.5U/mg317.5U/mg，相對酶活，相對酶活/%=(/%=(不同不同熱處理殘留酶活力熱處理殘留酶活力/317.5)/317.5) 100 100。 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析l修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較 第二部分：結(jié)果與分析第二部分：結(jié)果與分析修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較修飾酶與天然酶熱穩(wěn)定性的比較u圖表分析：圖表分析：u 隨著溫度的升高和加熱時(shí)間的延長，天然酶和修飾酶的酶隨著溫度的升高和