常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

1、目錄目錄目錄目錄常用分子生物學(xué)技術(shù)的常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第二十章第二十章目錄目錄第一節(jié)第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique目錄目錄n核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或

2、把DNA與與RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈成雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理目錄目錄復(fù)性復(fù)性RNADNA目錄目錄（一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類(lèi)似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因這一技術(shù)類(lèi)似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此

3、稱(chēng)之為此稱(chēng)之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。，譯為印跡技術(shù)。 目錄目錄用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱(chēng)為末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱(chēng)為“探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術(shù)（二）探針技術(shù)目錄目錄二、印跡技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用二、印跡技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern blotting)（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern blotting)（三）

4、蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western blotting)用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。目錄目錄n其他：其他：斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip)目錄目錄三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)夸浤夸浄欧派渖渥宰燥@顯影影照照片片目錄目錄DNA芯

5、片芯片技術(shù)技術(shù)目錄目錄第二節(jié)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用技術(shù)的原理與應(yīng)用The Principle and Application of PCR Technology目錄目錄5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 目錄目錄Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。萬(wàn)倍以上。目錄目錄PCR技術(shù)原理示意圖技術(shù)原理示意圖 目錄目錄

6、n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目錄目錄 模板模板DNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR體系基本組成成分體系基本組成成分目錄目錄利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為模板獲為模板獲得已知目的基因片段得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；為模板獲得目的片段；利用簡(jiǎn)并引物從利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段

7、；利用隨機(jī)引物從利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因。基因。 二、二、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺∧夸浤夸浝美肞CR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。變等改造。 PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突變（二）基因突變目錄目錄將將PCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNA

8、序列測(cè)定，使測(cè)序序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度；待測(cè)待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性因突變檢測(cè)的敏感性 。（四）（四）DNA序列測(cè)定序列測(cè)定（五）基因突變分析（五）基因突變分析目錄目錄 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是將是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。應(yīng)用的一種技術(shù)。 RT-P

9、CR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù)三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)目錄目錄 原位原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNA或或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。是否在該組織或細(xì)胞中存在。 原位原位PCR方法彌補(bǔ)了方法彌

10、補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。一種最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù)目錄目錄（三）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱(chēng)為定量對(duì)定量分析的干擾，亦被稱(chēng)為定量PCR。 目錄目錄n實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理技術(shù)原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物RQ 3355目錄目錄n實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCRPCR分類(lèi)

11、：分類(lèi)：實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PRC非探針類(lèi)非探針類(lèi)探針類(lèi)探針類(lèi)1. TaqMan1. TaqMan探針?lè)ㄌ结樂(lè)?2. 2. 分子信標(biāo)探針?lè)ǚ肿有艠?biāo)探針?lè)?3. FRET3. FRET探針?lè)ㄌ结樂(lè)?目錄目錄圖20-3 TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)PCR原理示意圖目錄目錄第三節(jié)第三節(jié)基因文庫(kù)基因文庫(kù)Gene Library目錄目錄 基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù) (genomic DNA library) cDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library) n基因文庫(kù)基因文庫(kù)( (gene library)是指一個(gè)包含了某一生物體全部是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNADNA序列序列的克隆群體。的克隆群體。目錄目錄一、基因組一

12、、基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)基因組基因組DNADNA文庫(kù)是指生物的文庫(kù)是指生物的基因組基因組DNA的的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群體。 用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有 噬菌體、噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。目錄目錄n基因組文庫(kù)和基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選文庫(kù)的構(gòu)建和篩選目錄目錄第一輪篩選第一輪篩選第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選n基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例基因組文庫(kù)篩選結(jié)果舉例目錄目錄cDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在

13、一定條件下所表達(dá)的全部件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、cDNA文庫(kù)文庫(kù)目錄目錄第四節(jié)第四節(jié)生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique目錄目錄是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA片段有規(guī)律地緊密排片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)

14、等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱(chēng)作定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱(chēng)作DNA微陣列微陣列(DNA microarray)。 一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)目錄目錄n基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖目錄目錄是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢

15、測(cè)系統(tǒng)應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片作用原理作用原理目錄目錄第五節(jié)第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study目錄目錄一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交酵母雙雜交 各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共

16、沉淀等）各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選噬菌體顯示系統(tǒng)篩選n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)目錄目錄標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相

17、結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。合的未知分子。 目錄目錄標(biāo)簽融合標(biāo)簽融合蛋白沉淀蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程示意圖示意圖目錄目錄（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途和用途目錄目錄n酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測(cè)。的生物信息學(xué)推測(cè)。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。 將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼

18、基因與BD基因融合成基因融合成為為“誘餌誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的基因融合的“獵物獵物”基因表達(dá)文庫(kù)，篩選未知的相互作用基因表達(dá)文庫(kù)，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。目錄目錄電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定( (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或稱(chēng)凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)或稱(chēng)凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)( (gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定結(jié)合蛋白和特定RNA序列間序列間的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定（一）電泳遷移率變