淺論IGFBP-6與晚期鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系以及在鼻咽癌細(xì)胞株CNE2 增殖中的作用

1、淺論IGFBP-6與晚期鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系以及在鼻咽癌細(xì)胞株CNE2 增殖中的作用               作者：陳秋燕 盧奕 張健 郭翔 麥海強(qiáng) 洪明晃【摘要】  【目的】 探討胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6(IGFBP-6)在鼻咽癌患者病理組織中的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床特征與預(yù)后關(guān)系及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株增殖的影響?！痉椒ā?采用免疫組化方法檢測(cè)76例晚期鼻咽癌患者病理組織中IGFBP-6的表達(dá)，并對(duì)IGFBP-6的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床特征與預(yù)后關(guān)系進(jìn)行

2、探討;用MTS方法檢測(cè)IGFBP-6對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2增殖的影響?！窘Y(jié)果】 鼻咽癌IGFBP-6的表達(dá)陰性組和陽(yáng)性組患者的5年總生存率分別為27%和73%(生存分析P = 0.007)，5年無(wú)局部區(qū)域復(fù)發(fā)生存率分別為38%和75%(P = 0.001)，5年無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率分別為53%和89%(P = 0.002)。Cox模型多因素分析顯示IGFBP-6的表達(dá)是76例鼻咽癌患者獨(dú)立的預(yù)后影響因素(P = 0.002)，IGFBP-6陽(yáng)性表達(dá)患者局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)降低。MTS檢測(cè)結(jié)果顯示IGFBP-6能夠抑制人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的生長(zhǎng)增殖(P 0.05)，并且這種作用呈劑量依

3、賴性?！窘Y(jié)論】 鼻咽癌組織中IGFBP-6的表達(dá)是晚期鼻咽癌患者的局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的因素，其陽(yáng)性表達(dá)提示患者局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)降低。體外MTS實(shí)驗(yàn)證明IGFBP-6能夠抑制CNE2增殖。 【關(guān)鍵詞】  鼻咽癌; IGFBP-6; 預(yù)后; 增殖Abstract： 【Objective】 To evaluate the expression of insulin-like growth factor binding protein-6 (IGFBP-6) in nasopharyngeal carcinoma (NPC) patients and determine

4、 its clinical and prognostic significance. To study the effect of IGFBP-6 to NPC cell in the proliferation. 【Methods】 In this study， we evaluated immunohistochemical expression of IGFBP-6 in NPC tissue and determined its clinical and prognostic significance. The effect of IGFBP-6 to NPC cell line CN

5、E2 in proliferation were detected by MTS. 【Results】The 5-year overall survival (OS) rates of IGFBP-6 of negative group and positive group were 27% and 73% (survival analyses P = 0.007). The 5-year loco regional relapse-free survival (LRFS) rates were 38% and 75% (P = 0.001). The 5-year distant metas

6、tasis-free survival (DMFS) rates were 53% and 89% (P = 0.002). Multivariate analysis in Cox model showed that IGFBP-6 were independent significant prognostic factor for 76 NPC patients. The positive expression of IGFBP-6 indicates a lower risk of developing loco regional relapse and distant metastas

7、is. MTS showed that IGFBP-6 could decrease proliferation of CNE2 (P 0.05) and this function was dose-dependent. 【Conclusion】 IGFBP-6 is an independent significant prognostic factor for loco regional 胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor， IGF)，是屬于小分子多肽類生長(zhǎng)因子，其氨基酸序列和胰島素近似而得名。IGF的主要作用是調(diào)節(jié)碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類的代謝，在腫

8、瘤領(lǐng)域中，IGF與細(xì)胞增殖、分化和凋亡的關(guān)系日益受到關(guān)注。IGF系統(tǒng)由IGF-I和IGF-II及其受體和包括IGFBP-1 IGFBP-6的6類結(jié)合蛋白等共同組成。IGFBP-6(Insulin-like growth factor binding protein， IGFBP-6)是IGF系統(tǒng)里結(jié)合蛋白的一類，能夠通過(guò)與IGF-II特異性結(jié)合起到抑制細(xì)胞增殖的作用1-2?，F(xiàn)有的研究試驗(yàn)證據(jù)表明IGFBP-6是潛在的抗癌新靶點(diǎn)，研究顯示IGFBP-6的正向調(diào)節(jié)與抗增殖效應(yīng)是一致的。IGFBP-6作為IGF-II的抑制因子，在一些腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)隨細(xì)胞惡性程度的增高而降低。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明IGFB

9、P-6能夠抑制某些腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、橫紋肌肉瘤等2-5。鼻咽癌俗稱“廣東瘤”，其發(fā)病具有明顯的地區(qū)差異性。鼻咽癌在東南亞地區(qū)及中國(guó)華南地區(qū)常見，而歐美國(guó)家發(fā)病率較低。鼻咽癌治療失敗的最主要原因是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確，國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有可靠的生物學(xué)指標(biāo)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于IGFBP-6與鼻咽癌相關(guān)研究的報(bào)道，本研究的目的是檢測(cè)晚期鼻咽癌患者病理組織中IGFBP-6的表達(dá)，并探討IGFBP-6的表達(dá)與鼻咽癌臨床特征與預(yù)后的關(guān)系，體外用MTS方法檢測(cè)IGFBP-6對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響。1 材料與方法1.1 臨床資料選取1998年9月至2002年1

10、2月在中山大學(xué)腫瘤防治中心行鼻咽活檢的鼻咽癌病人石蠟包埋組織76例。全組病例均經(jīng)病理確診，76例病人病理類型均為鼻咽低分化鱗癌。其中男性58例，占76.3%，女性18例，占23.7%。年齡23 64歲，中位年齡47歲。根據(jù)中國(guó)鼻咽癌92福州分期標(biāo)準(zhǔn)，初診時(shí)T1期4例，T2期12例，T3期24例，T4期36例;N0期10例，N1期16例，N2期30例，N3期20例;臨床總分期：III期24例，IV期52例。所有患者均在中山大學(xué)腫瘤防治中心接受根治性放療。所有病人具有完整的存檔病歷及隨訪資料。隨訪時(shí)間截止到2009年3月，76例病人的中位隨訪時(shí)間為86.5個(gè)月(14 124個(gè)月)。隨訪期內(nèi)局部區(qū)域

11、(包括鼻咽及頸部淋巴結(jié))復(fù)發(fā)28例，復(fù)發(fā)率為36.8%(28/76)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(包括骨、肺、肝)18例，轉(zhuǎn)移率為23.7%(18/76)，5年總生存率為60%(46/76)。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)主要試劑鼠抗人IGFBP-6單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司。采用免疫組化SABC法常規(guī)操作技術(shù)，具體組織蠟塊病理切片，每張切片厚4 ?滋m，放置55 58 烤箱烤片30 45 min。石蠟切片常規(guī)二甲苯溶液脫蠟，梯度酒精逐級(jí)水化，去離子水漂洗。玻片浸泡在5 mL 300 mL/L過(guò)氧化氫 + 22.5 mL甲醇 + 22.5 mL去離子水中10 min。消除組織內(nèi)源性過(guò)

12、氧化物酶的影響。去離子水及PBS緩沖液漂洗。將玻片抹干，畫圈。滴加含100 mL/L正常山羊血清的用1%BSA稀釋PBS的封閉抗原，濕盒內(nèi)室溫下放置60 min。滴加鼠抗人IGFBP-6單克隆抗體(濃度1：30)，4 冰箱濕盒過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體(濃度1：200)，濕盒內(nèi)室溫下放置30 min。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，濕盒內(nèi)室溫下放置30 min。DAB顯色約5 min，顯微鏡下顯示最適合陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，去離子水終止顯色。蘇木素復(fù)染10 s。?輥?輯?訛玻片脫水。?輥?輰?訛中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。1.2.2 MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖能力CNE2是鼻咽癌低分化鱗癌細(xì)胞株，

13、由中山大學(xué)腫瘤防治中心錢朝南教授饋贈(zèng)。在含有100 mL/L小牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，及在37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。重組人IGFBP-6購(gòu)自R&D公司。采用MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，具體準(zhǔn)備3塊96孔板，每孔3 000個(gè)CNE2細(xì)胞鋪板，每孔接種200 ?滋L，每組4 孔，置CO2培養(yǎng)箱中孵育。第2天將DMEM培養(yǎng)液100 mL/L FBS調(diào)整為10 mL/L FBS培養(yǎng)，并加入不同濃度重組人IGFBP-6各為4 ?滋L，使IGFBP-6的終濃度分別為0、0.01 ng/?滋L、0.1 ng/?滋L、1 ng/?滋L。加處理?xiàng)l件

14、后24，48，72 h，加入MTS 20 ?滋L每孔，繼續(xù)CO2培養(yǎng)箱中孵育。加入MTS 2 h后終止培養(yǎng)，用酶聯(lián)分光光度計(jì)測(cè)量490 nm處的OD值，以相應(yīng)OD值表示細(xì)胞增殖能力的大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.3 免疫組化結(jié)果判定細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片在200倍普通光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)算腫瘤組織中染色陽(yáng)性細(xì)胞的比例，多于50%的腫瘤細(xì)胞為陽(yáng)性表達(dá)被認(rèn)為IGFBP-6表達(dá)陽(yáng)性。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。兩因素間差異的比較采用?字2檢驗(yàn)

15、。采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，兩因素間生存差異檢驗(yàn)采用Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行預(yù)后的多因素分析。P 0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 IGFBP-6在鼻咽癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系IGFBP-6的陽(yáng)性表達(dá)顯示棕黃色染色主要位于腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)(圖1B)，而IGFBP-6的陰性表達(dá)沒(méi)有明顯棕黃色染色(圖1A)。76例鼻咽癌組織54例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為71.4%。對(duì)76例鼻咽癌病人各項(xiàng)臨床特征與IGFBP-6的表達(dá)進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示IGFBP-6的表達(dá)與性別、年齡、T分期、N分期、臨床總分期無(wú)明顯相關(guān)性(P 0.05，表1)。2.2 IG

16、FBP-6表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示IGFBP-6陰性組和陽(yáng)性組的5年總生存率分別為27%和73% (P = 0.007，圖2)，IGFBP-6陰性組和陽(yáng)性組的5年無(wú)局部區(qū)域復(fù)發(fā)生存率分別為38%和75% (P = 0.001，圖3)，IGFBP-6陰性組和陽(yáng)性組的5年無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率分別為53%和89% (P = 0.002，圖4)。結(jié)果表明IGFBP-6陽(yáng)性組較陰性組病人生存時(shí)間較長(zhǎng)，局部區(qū)域復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率較低。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析年齡、性別、T分期、N分期、臨床總分期及IGFBP-6表達(dá)等多種因素與預(yù)后的關(guān)系。多因素分析結(jié)果顯示IGFBP-6表達(dá)是76例鼻咽

17、癌患者獨(dú)立的預(yù)后影響因素(P = 0.002，表2)。影響預(yù)后的獨(dú)立因素還包括臨床總分期。2.3 MTS檢測(cè)IGFBP-6對(duì)鼻咽癌細(xì)胞珠的生長(zhǎng)增殖的影響用MTS法測(cè)定不同濃度重組人IGFBP-6對(duì)鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE2的生長(zhǎng)增殖的影響。共測(cè)定72 h，得到的OD值計(jì)算平均數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線如圖5。結(jié)果顯示IGFBP-6能夠抑制人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的生長(zhǎng)增殖(P 0.05)，高濃度的重組人IGFBP-6(1 ng/?滋L)較低濃度的作用明顯，即抑制作用呈劑量依賴性。         3 討 論鼻咽癌發(fā)病的最

18、大特點(diǎn)是分布具有地區(qū)差異性，是中國(guó)南方地區(qū)常見的惡性腫瘤，放射治療是鼻咽癌的首選治療。隨著放療IMRT技術(shù)應(yīng)用的推廣，鼻咽癌的局部復(fù)發(fā)率不斷下降，生存率得到不斷的提高。但是，晚期鼻咽癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率仍然較高。有報(bào)道顯示，放療結(jié)合化療可以在一定程度上降低鼻咽癌的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。因此，預(yù)測(cè)鼻咽癌病人遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于判斷預(yù)后及指導(dǎo)綜合治療具有重要意義。本研究的目的是希望尋找可靠的生物學(xué)指標(biāo)來(lái)幫助預(yù)測(cè)預(yù)后及指導(dǎo)治療。作為生長(zhǎng)因子的一種，IGF在腫瘤研究中的作用越來(lái)越受到重視。越來(lái)越多流行病學(xué)研究提示血清IGFs水平增高和/或結(jié)合蛋白水平的改變與一些惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。Furstenberg

19、er等的文章指出，IGF-I對(duì)細(xì)胞增殖分化起著重要的作用，并能夠抑制細(xì)胞的調(diào)亡;許多前瞻性研究提示：IGF-I水平升高，人群中發(fā)生前列腺癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加。Lloret等隨訪56例宮頸癌患者，發(fā)現(xiàn)IGF-IR高表達(dá)患者預(yù)示著預(yù)后不良。Liao等10的研究顯示，前列腺癌患者IGF-I和IGF-II的表達(dá)與臨床分期密切相關(guān)，其表達(dá)水平的升高預(yù)示著預(yù)后不良。Haydon 等11檢測(cè)了526例結(jié)直腸癌患者血清IGFBP-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平的增高預(yù)示著較好的預(yù)后。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者血清IGFBP-6的表達(dá)明顯低于乳腺良性增生的患者，并且IGFBP-6的表達(dá)與PSA

20、的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)12。Cacalano等13報(bào)道在口腔腫瘤中，IGFBP-6因子能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡，IGFBP-6基因或者是蛋白表達(dá)增高的口腔腫瘤患者，預(yù)示著有較好的預(yù)后，IGFBP-6能夠作為口腔腫瘤患者的預(yù)后指標(biāo)。在鼻咽癌中關(guān)于IGFs的研究很少，Iwakiri等14的研究顯示，EBV感染能夠誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞株C666-1的IGF-I的表達(dá)。Zhang等15用免疫組化檢測(cè)良性病變鼻咽血管纖維瘤或鼻息肉患者的病理組織標(biāo)本，結(jié)果顯示IGF-IR表達(dá)為陰性。本研究中，Cox模型分析顯示IGFBP-6表達(dá)是76例晚期鼻咽癌患者獨(dú)立的預(yù)后影響因素，IGFBP-6陽(yáng)性表達(dá)提示患者局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

21、風(fēng)險(xiǎn)率降低。本研究結(jié)果提示，IGFBP-6可以考慮作為鼻咽癌的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)，本研究結(jié)果與前述IGFBP-6在乳腺腫瘤、口腔腫瘤等患者表達(dá)情況及預(yù)后關(guān)系基本一致。我們可以考慮將IGFBP-6納入鼻咽癌患者治療前檢查的參考指標(biāo)，對(duì)于表達(dá)陰性的患者，因?yàn)橛锌赡苡休^高的局部復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，治療方案考慮予以放化療等綜合治療手段，并密切隨訪，及早治療可能出現(xiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGFBP-6對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。Oh等對(duì)大腸癌細(xì)胞株HT-29的研究表明，IGFBP-6表達(dá)增高能夠加強(qiáng)與IGF-II的緊密結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。有報(bào)道在橫紋肌肉瘤細(xì)胞中，體外實(shí)驗(yàn)證明IGFBP-6能

22、夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的調(diào)亡;將IGFBP-6表達(dá)沉默的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行小鼠體內(nèi)皮下注射，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。Koike等的研究表明，在前列腺癌的治療中，已烯雌酚通過(guò)誘導(dǎo)IGFBP-6的表達(dá)來(lái)抑制前列腺癌雄激素非依賴性細(xì)胞的增殖。Sueoka等報(bào)道在非小細(xì)胞癌的研究中，IGFBP-6能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的程序性死亡，提示IGFBP-6是腫瘤治療的潛在靶向藥物。本研究中，鼻咽癌組織中IGFBP-6的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響，即有可能降低鼻咽癌病人局部區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提示其有可能在一定程度上抑制鼻咽癌的生長(zhǎng)增殖及轉(zhuǎn)移，可能是鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)。并且MTS檢測(cè)結(jié)果顯示IGFBP

23、-6能夠呈劑量依賴性抑制人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的生長(zhǎng)增殖。綜上所述，IGFBP-6是值得進(jìn)一步深入研究的生物學(xué)指標(biāo)?？梢钥紤]增加病例數(shù)，擴(kuò)大樣本量，行相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，為進(jìn)一步臨床生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  Frasca F， Pandini G， Sciacca L， et al. The role of insulin receptors and IGF-I receptors in cancer and other diseases J. Arch Physiol Biochem， 2008， 114(1)： 23-37.Oh YS， Kim EJ， Schaf

24、fer BS， et al. Synthetic low-calcaemic vitamin D(3) analogues inhibit secretion of insulin-like growth factor II and stimulate production of insulin-like growth factor-binding protein-6 in conjunction with growth suppression of HT-29 colon cancer cells J. Molecular and cellular endocrinology. 2001， 183(1-2)： 141-149.Koike H， Ito K， Takezawa Y， et al. Insulin-like growth factor binding protein-6 inhibits prostate cancer cell proliferation： implication for anticancer effect of diethylstilbestrol in hormone