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1、    玻璃體條件培養(yǎng)液對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞生長活性及細胞周期的影響(1)    】 目的:探討在含有人玻璃體的條件培養(yǎng)液作用下體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(HRPE)細胞形態(tài)學、細胞生長活性及細胞周期的改變。方法:將HRPE細胞培養(yǎng)在含100,250,500,1 000mL/L人玻璃體的DMEM條件培養(yǎng)液(VCM)。用倒置顯微鏡觀測細胞的形態(tài)學改變,分別用MTT、流式細胞術檢測細胞的生長活性及細胞周期的改變。 結果:不同體積分數(shù)的VCM使HRPE細胞的形態(tài)發(fā)生了改變,HRPE細胞出現(xiàn)了多核及更早的脫色素,類似成纖

2、維細胞表型的生長狀態(tài)。含100,250及500mL/L玻璃體體積的VCM處理后HRPE細胞的增長活性與對照組相比存在顯著性差異(P均0.01),其中含250mL/L玻璃體的VCM刺激HRPE細胞增生的能力最強。VCM促使更多的HRPE細胞進入了DNA合成期(S期,613),含250與500mL/L玻璃體體積的VCM使HRPE細胞出現(xiàn)了異倍體的改變。結論:一定體積分數(shù)的VCM使HRPE細胞的S期比例增加,細胞增生能力增強。 【關鍵詞】 視網(wǎng)膜色素上皮細胞玻璃體MTT細胞周期DNA倍體流式細胞術Effect of vitreous conditional medium on human retin

3、al pigment epithelium cells' proliferation and cell dividing cycle    AbstractAIM: To investigate the change of cellular morphology, cell proliferative activity and cell dividing cycle in human retinal pigment epithelium (HRPE) cells after treatment of human vitreous conditio

4、nal medium (VCM). METHODS: HRPE cells were treated with VCM including 100, 250, 500 and 1 000mL/L human vitreous respectively. Cellular morphology, cell proliferative activity and cell dividing cycle changes were observed by invert microscope, MTT assay and Flow Cytometry (FCM) assay respectively.RE

5、SULTS: HRPE cells showed polynucleation and pre-depigmenting, fibroblast-like phenotype. For HRPE cells proliferative activity, there was significant disparity between control and experimental group, especially for VCM with 250mL/L vitreous. VCM increased the HRPE cells' proportion of phase S (6

6、13)and heteroploid was found in VCM with 250 and 500 mL/L vitreous. CONCLUSION: VCM can increase the S phase proption in HRPE cells' cell dividing cycle, and increase their proliferative activity.    · KEYWORDS: retinal pigment epithelium; vitreous; MTT; cell dividing cy

7、cle; DNA ploidy; Flow Cytometry0引言    增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)是裂孔性視網(wǎng)膜脫離手術失敗的最主原因,也是眼外傷、血管性和炎癥性視網(wǎng)膜病變的一種結局1。它的啟動和發(fā)展表現(xiàn)為過度的創(chuàng)傷愈合過程,其基本病理過程是視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)的移行、增生,在視網(wǎng)膜前和膜后及玻璃體腔內形成增生膜,最終增生膜的收縮導致牽拉性視網(wǎng)膜脫離,屬于增生性疾病2?,F(xiàn)已有大量關于生長因子,細胞因子通過復雜的信號途徑作用于RPE細胞,導致其病理性增生的實驗性研究的報道3。目前雖已明確,視網(wǎng)膜神經(jīng)層損傷后造成的RPE細胞與玻璃體的接觸是

8、PVR發(fā)生的高危因素4,但玻璃體作用的具體機制仍未明確。有報道表明在PVR這一病理過程中玻璃體液內多種細胞因子的含量發(fā)生了改變5,6。也有學者發(fā)現(xiàn),PVR患者的玻璃體液能促進增生膜中膠原的合成以及增生膜的收縮,從PVR的不同環(huán)節(jié)參與疾病的演進過程7,8。Norbert等9發(fā)現(xiàn)RPE細胞接觸正常玻璃體后會導致其基因表達的改變。Kirchhof等10則發(fā)現(xiàn)正常玻璃體液能促進使HRPE細胞的形態(tài)學發(fā)生改變、增強其遷移及增生能力。    細胞周期(cell dividing cycle)11指細胞從一次分裂結束開始生長到下一次分裂終止所經(jīng)歷的過程。細胞周期的概念

9、由Howard和Pelc于1951年首次提出,并將細胞周期分為間期(G0)與分裂期(M期)。間期包括DNA合成前期(G1 期)DNA合成期(S 期)DNA 合成后期(G2 期)。M期又分為前期、中期、后期和末期。Lajtha 還提出細胞周期中存在一個G0期,此期細胞不參加細胞增殖,適當刺激后可以重新加入細胞周期開始分裂。為了進一步明確玻璃體與HRPE細胞的接觸在PVR始發(fā)中的具體作用,國內外的學者進行了玻璃體對人RPE(HRPE)細胞影響的實驗性研究。其中涉及到了形態(tài)學8,生長活性8,12及基因表達改變9等方面。然而結論尚不一致,且沒有學者對玻璃體作用后HRPE細胞的細胞周期改變進行觀察,為此

10、我們采用不同體積的人玻璃體作用于培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞,觀察HRPE細胞的形態(tài)學、生長活性及細胞周期的改變,來探討玻璃體作用后的HRPE在PVR發(fā)生中的作用。    1材料和方法    1.1材料 取自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科角膜移植術后的正常供體眼(供體年齡2436歲,無眼部及全身疾患)。DMEM購自美國Gibco公司,胰蛋白酶及MTT購自Amresco公司,胎牛血清(FBS)購自天津TBD公司,碘化丙啶(PI)購自SIGMA公司。    1.2方法 參照Stram

11、m等13的視杯消化法:取供體眼后,慶大霉素8萬U浸泡消毒20min,去除晶狀體、玻璃體、視網(wǎng)膜神經(jīng)層。用胰酶消化30min,1 000r/min離心收集細胞,用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37, 50mL/L CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。80融合的第35代HRPE細胞用于實驗。將玻璃體完全去除視網(wǎng)膜及色素組織后收集于15mL無菌離心管中。0,10 000r/min離心30min,0.22m微孔濾膜過濾,深低溫冰箱-78備用保存。將培養(yǎng)的HRPE細胞加入VCM后用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學改變并照相。實驗組a: 100mL/L的玻璃體10mL/L FBSDMEM液;實驗組b:250mL/

12、L的玻璃體10mL/L FBSDMEM液;實驗組c:500mL/L的玻璃體10mL/L FBSDMEM液;實驗組d:1 000mL/L玻璃體;對照組:平衡鹽10mL/L FBSDMEM液。    1.2.1 VCM作用后HRPE細胞活性 將第3代HRPE細胞消化計數(shù)后以2 000個/孔密度接種于96孔板培養(yǎng)24h后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6h,之后試驗組加入不同體積玻璃體的VCM液,每一濃度重復5孔。繼續(xù)培養(yǎng)1,3,5,7d取出一個孔板行MTT檢驗:每孔加入5g/L MTT20L,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜(DMSO)150L,振蕩器振蕩1

13、0min,待紫色結晶完全溶解后,用酶標測試儀測定吸光度A 值,測定波長為570nm。            【摘】目的:探討在含有人玻璃體的條件培養(yǎng)液作用下體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(HRPE)細胞形態(tài)學、細胞生長         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的,論文版權屬原作者,請不用于商業(yè)用途或者抄襲,僅供參考學習之用,否者后果自負,如果此文侵犯您的合法

14、權益,請聯(lián)系我們。    1.2.2 HRPE細胞周期的檢測 將第3代HRPE細胞加入無血清的DMEM培養(yǎng)12h后,棄無血清DMEM培養(yǎng)液,實驗組分別加入含100,250及500mL/L玻璃體的VCM液繼續(xù)培養(yǎng)48h,對照組加入平衡鹽溶液繼續(xù)培養(yǎng)48h。胰酶消化后通過400目的篩網(wǎng)制成單細胞懸液,離心,PBS洗滌1次后750mL/L乙醇固定,加入PI染液1mL,輕柔吹打后混勻,閉光染色20min,流式細胞儀測定細胞周期。2結果    2.1 VCM對培養(yǎng)的HRPE細胞形態(tài)學的影響 對照組的RPE原代細胞呈扁平不規(guī)則

15、多角形,可見清晰透明的圓形單核或雙核,細胞內含有較多的色素顆粒,傳代至34代后細胞內無明顯的色素顆粒,細胞呈梭形或多角形生長。加入100,250及500mL/L的VCM后,RPE細胞生長旺盛,分裂象明顯,有的細胞呈多核,類似病理性核分裂,并且細胞在第2代就已經(jīng)脫色素生長,呈分裂過度的老化狀態(tài),更快具有纖維細胞的表型(圖1A,B,2A,B)。    2.2 VCM對HRPE細胞增生活性的影響 加入100,250及500mL/L VCM后,實驗組的HRPE細胞較對照組相比生長明顯旺盛,統(tǒng)計學分析均分別有顯著性差異 (P0.01),這種差異在加入VCM培養(yǎng)3d

16、后出現(xiàn),并持續(xù)到實驗觀察結束。其中100mL/L與500mL/L VCM組之間相比較并無統(tǒng)計學差異(P00.5),但250mL/L VCM組與100mL/L及500mL/L VCM組分別比較差異均有顯著差異(P0.01),說明其中含250mL/L玻璃體的VCM刺激HRPE細胞發(fā)生增生的作用最強。與此相反,1 000mL/L VCM組的HRPE細胞逐漸死亡,細胞數(shù)遞減,在3,5及7d與對照組相比存在統(tǒng)計學差異(表1)。    2.3 VCM對HRPE細胞細胞周期的影響 與對照組相比HRPE細胞進入S期的比例明顯增多,100mL/L VCM組與對照組相比處于

17、S期的細胞比例增加了8.3(P0.01),同時伴隨著G1期比例的下降及G2期比例的升高。尤其值得注意的是在250mL/L及500mL/L的VCM組,有微量異倍體的出現(xiàn),與對照組及100mL/L VCM組1 000mL/L為二倍體的細胞生長狀態(tài)明顯不同。其中250mL/L VCM組的三倍體較500mL/L VCM組增長了2.4(P0.05),說明250mL/L VCM組使HRPE細胞發(fā)生異倍體的能力最強(表2)。    圖 1 原代HRPE細胞(倒置顯微鏡×100) A:加250mL/L的VCM后,見有異倍體的RPE細胞生長,:三核及多核細胞;B

18、 未加VCM的HRPE細胞生長良好,核分裂相多見,:雙核分裂細胞    圖 2 第2代HRPE細胞(倒置顯微鏡×200) A:加250mL/L VCM的HRPE細胞呈明顯老化狀態(tài),細胞扁平,無色素,類似纖維細胞;B:未加VCM的HRPE細胞仍含有較多的色素顆粒,細胞呈六角形或梭形生長    3討論    PVR的特征之一是RPE細胞的病理增生,其發(fā)生發(fā)展與RPE細胞增生的調控失常有關。在其發(fā)生中RPE與玻璃體的接觸是前提條件,為此我們在體外培養(yǎng)的HRPE細胞中加入V

19、CM,來模擬PVR這一病理過程,并研究在此過程中HRPE細胞形態(tài),增殖活性及細胞周期的變化。我們將HRPE細胞分別培養(yǎng)在100,250,500,1 000mL/L VCM中,發(fā)現(xiàn)100,250及500mL/L VCM均能使HRPE細胞的增生活性增強,含1 000mL/L玻璃體的VCM則使HRPE細胞發(fā)生了凋亡。但在含250mL/L玻璃體的條件培養(yǎng)液中,HRPE細胞的生長活性及細胞周期的變化幅度是最明顯的;100與500mL/L VCM對HRPE細胞的生長活性的影響間并不存在明顯差異;我們認為上述結果的原因是在體外進行的細胞實驗中培養(yǎng)液及血清對細胞生長狀態(tài)的維持是必不可少的,玻璃體本身并不能維持

20、細胞生存的需,故1 000mL/L VCM組的HRPE細胞由于缺乏營養(yǎng)而發(fā)生了凋亡。而250mL/L VCM組與100mL/L及500mL/L VCM組間的差異提示玻璃體的體積過大或過小均不能使HRPE細胞的病理增生達到最旺盛的水平。這種生長特性也許是因為玻璃體與細胞培養(yǎng)液內的蛋白質,血清存在最適比例,二者在一定范圍內存在著平衡,一旦這種平衡被不同程度的打破,細胞的生長狀態(tài)就隨之變化了。在本實驗中打破這一平衡的前提條件是在培養(yǎng)液中存在的濃度為10mL/L的胎牛血清,因為Kirchhof等8認為,在不含血清的情況下玻璃體并不能使HRPE細胞出現(xiàn)細胞生長狀態(tài)的改變,而在加入血清之后即使血清濃度低至

21、1mL/L,VCM也能顯著的刺激HRPE細胞的增生。我們實驗中所選擇的血清濃度為10mL/L,在此濃度下HRPE細胞僅能維持存活,并不發(fā)生顯著細胞生長,也不能形成S形細胞生長曲線,從而排除了血清作為一種絲裂原的干擾。但由于有玻璃體的作用,HRPE細胞生長明顯旺盛,提示玻璃體液中含有一些潛在的促增生因子, 它們需血清中某些成分的介導、激活或與其結合而發(fā)揮作用。    各種細胞的周期時間不同差異主在于G1期的長短不同。在離體培養(yǎng)條件下可通過控制外在條件使細胞分裂減慢或停止,但無論采用什么手段均停頓在G1期。這表明細胞一旦通過G1期就注定完成S,G2及M期。到

22、目前為止,對于玻璃體液作用后HRPE細胞的細胞周期變化還未見報道,我們欣喜的發(fā)現(xiàn)HRPE細胞生長狀態(tài)的改變與其的細胞周期相對應。我們發(fā)現(xiàn),不同體積的VCM作用后細胞進入S期的比例明顯增加,提示玻璃體是通過促進細胞進入S期,從而加速細胞分裂而使細胞生長旺盛的,而G2期的比例增加則是繼發(fā)于S與G1期比例的變化。在人體正常細胞中, DNA是比較恒定的參量, DNA含量隨著細胞增殖周期各時相而發(fā)生變化。當受到致癌因素刺激時,DNA損傷導致DNA質和量的異常,成為DNA非整倍體細胞,也稱異倍體細胞14。腫瘤細胞由于調節(jié)與生長控制系統(tǒng)障礙而獲得無限增殖能力,需合成大量的核酸以滿足其迅速生長的物質需,故其D

23、NA含量和倍體數(shù)有不同程度的改變,細胞的DNA非整倍體是惡性腫瘤的特征性標志之一。值得一提的是在我們的實驗組中HRPE細胞有異倍體的出現(xiàn),表明在我們模擬的PVR病理狀態(tài)下,HRPE細胞的生長是非常活躍的。洪晶等15在外傷后發(fā)生PVR眼的原代HRPE細胞的培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)了這種異倍體細胞,說明PVR這種增生性疾病中的關鍵細胞HRPE細胞具有一定向腫瘤細胞轉化的傾向。但與大部分腫瘤細胞6070左右16的異倍體比例相比我們實驗所得到的異倍體細胞比例還是相當小的。我們的實驗組中異倍體含量也大大低于外傷眼中的2015。認為這與我們試驗所使用的誘導條件是有關的,因為我們用的健康人的玻璃體與發(fā)生血視網(wǎng)膜屏障嚴重

24、破壞的外傷眼,視網(wǎng)膜脫離眼的玻璃體內蛋白成分存在差異5,6。遺憾的是因為流式細胞術所需的樣本量較大,我們沒有進行連續(xù)時間點的觀測及比較。而且由于1 000mL/L VCM組需在無血清的條件下培養(yǎng)至少48h,此時細胞大多凋亡,與我們所進行的細胞增生周期分析無關,故未進行該組細胞周期的檢測。            【摘】目的:探討在含有人玻璃體的條件培養(yǎng)液作用下體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(HRPE)細胞形態(tài)學、細胞生長     &

25、#160;   本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的,論文版權屬原作者,請不用于商業(yè)用途或者抄襲,僅供參考學習之用,否者后果自負,如果此文侵犯您的合法權益,請聯(lián)系我們。    綜上所述,我們將玻璃體液作用于HRPE細胞后,檢測到了HRPE細胞行為學的改變。其生長狀態(tài)、細胞周期的改變必然有其調控的上游分子信號的改變,究竟是何種信號蛋白參與了這種細胞生長活性改變的調節(jié)將是我們需進一步研究的課題?!緟⒖嘉墨I】1 Ryan SJ. Traction retinal detachment. XLIX Edwar

26、d Jackson Memorial. Am J Ophthalmol ,1993;115:1-202 Kosnosky W. Interleukin-1-beta changes the expression of metalloproteinases in the vitreous humor and induces membrane formation in eyes containing preexisting retinal holes. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1994;35:4260-42673 Hollborn M. Signaling pathw

27、ays involved in PDGF-evoked cellular responses in human RPE cells. Biochem Biophys Res Commun ,2006;344:912-9194 Nagasaki H. Risk factors for prliferative vitreoretinopathy. Curr Opin Ophthalmol ,1995;6:70-755 Sydorova M. Vascular endothelial growth factor levels in vitreous and serum of patients wi

28、th either proliferative diabetic retinopathy or proliferative vitreoretinopathy. Ophthalmic Res ,2005;37:188-1906 Capeans Tome C. Levels of pentosidine in the vitreous of eyes with proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy and retinal detachment. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol ,2005;243(12):1272-12767 Gonzalez-Avila G. Influence on collagen metabolism of vitreous from eyes with proliferative vi

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