反相高效液相色譜法測定尿液4種腎病標志物

1、反相高效液相色譜法測定尿液4種腎病標志物         你正在瀏覽的藥學論文是反相高效液相色譜法測定尿液4種腎病標志物                    【關鍵詞】 糖尿病腎病        Reversedphase high pe

2、rformance liquid chromatography assay for determining 4 kinds of markers of diabetic nephropathy in urine        【Abstract】 AIM: To establish a new reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method for assay 4 kinds of nonproteinnitrogen mar

3、kers of human diabetic nephropathy (DN), creatine (Cr), creatinine (Cn), urea (U) and uric acid (Ua) in DN patients urines. METHODS: The urine samples were assayed by RPHPLC on C18 column (200 mm×4.6 mm, id 5 m) at the ambient temperature and a wave length of 200 nm, using a 10 mmol/L pH 6.86 p

4、hosphate buffer consisted 30%(V/V) methanol as mobile phase with the flow rate of 0.9 mL/min. RESULTS: Baseline separation of the urine could be easily achieved in 5 min after a simple sample preparation. The method also displayed a high reproducibility (RSD values of retention time and peak area we

5、re no more than 3%) and the calibration curves showed good linearities in the range of 5-300 mol/L, 10-200 mol/L, 1-30 mol/L, 10-1500 mol/L for Cr, Cn, U and Ua respectively. CONCLUSION: This method has great potential for routine assay of clinical urine samples and monitoring DN early.  &

6、#160;     【Keywords】 reversed high performance liquid chromatography; diabetic nephropathy; nonprotein nitrogen; urine        【摘要】 目的：建立糖尿病患者尿液中與腎病相關的非蛋白氮代謝產(chǎn)物(肌酸、肌酐、尿素和尿酸)的反相高效液相色譜分離分析方法. 方法：采用Agilent C18(200 mm×4.6 mm, 內(nèi)徑5 m)色譜柱，

7、流動相含30%(體積比)甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸緩沖溶液，流速0.9 mL/min，檢測波長200 nm，柱溫為室溫. 結(jié)果：在5 min內(nèi)可對患者尿液中上述4種物質(zhì)同時進行測定，樣品前處理簡單，重現(xiàn)性較好(遷移時間和峰面積的RSD均3%)，線性范圍較寬(肌酸：5300 mol/L, 肌酐：10200 mol/L, 尿素：130 mmol/L, 尿酸：101500 mol/L). 結(jié)論：此法完全適用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測.        【關鍵詞】 反相高效液相色譜;糖尿病

8、腎病;非蛋白氮;尿樣        0引言        糖尿病并發(fā)腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者致死的重要原因之一，已引起了人們的廣泛關注. 非蛋白氮代謝產(chǎn)物如肌酸(creatine, Cr)、肌酐(creatinine, Cn)、尿素(urea, U)和尿酸(uric acid, Ua)即是與DN相關的幾種物質(zhì). 已報道的有關這些物質(zhì)的分離分析方法主要有比色法1、酶法2、液相色譜法3-6、毛細管

9、電泳法7-9等. 其中比色法和酶法通常只能測定單一的物質(zhì)，而且尿液中的一些內(nèi)源性物質(zhì)對測定有干擾;液相色譜法則多集中在對某一種或部分物質(zhì)的測定上;毛細管電泳測定這些標志物重現(xiàn)性有待于提高. 我們運用反相高效液相色譜法，對DN患者尿液中與DN相關的Cr, Cn, U和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物進行同時分離檢測. 同時測定尿液中的4種物質(zhì)目前還未見報道. 此法具有快速、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，完全可運用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測.        1材料和方法   

10、0;    1.1材料Agilent 1100液相色譜儀(美國Agilent公司);Cr，Cn，Ua均購自Sigma公司(USA，Sigma);甲醇為色譜純試劑(天津第二化學試劑廠);其余試劑均為分析純，水為二次重蒸水.        1.2方法        1.2.1色譜條件色譜柱為Agilent C18柱(200 mm×4.6 mm,內(nèi)徑5 m)，流動相含體積比為30%的甲醇和10

11、 mmol/L，pH 6.86的磷酸緩沖溶液，等度洗脫，流速0.9 mL/min，檢測波長200 nm，柱溫為室溫，進樣量為10 L.        1.2.2標準溶液的配置和尿樣的處理方法Cr, Cn和U標準溶液均使用二次重蒸水配置成一定的濃度. Ua溶液的配置方法如下：取30 mg磷酸鉀，溶解在40 mL重蒸水中，加熱至60，使其完全溶解，精確稱取Ua 28 mg,溶解于熱磷酸鉀溶液中，冷卻至室溫，移入100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，貯存在棕色瓶中保存. 尿液樣品的處理方法：取新鮮的尿液用水稀釋1倍后待用

12、. 所有溶液每周更換1次，使用前均過0.45 m的水相膜后再用于色譜分析.        2結(jié)果        2.1色譜條件的優(yōu)化固定其它色譜條件不變，分別改變緩沖液的pH值、流動相(pH 6.86)中甲醇比例、流動相中緩沖液濃度和流動相的流速，考察了其對4種物質(zhì)分離的影響. 四種物質(zhì)的分離隨pH、甲醇比例、磷酸緩沖液濃度和流動相的流速的變化情況分別如圖1，2所示.      

13、;  A：流動相pH;B：甲醇比例.        圖1流動相pH和甲醇比例對幾種標志物保留時間的影響(略)        A：磷酸緩沖液濃度;B：流速. R12: U和Cr之間的分離度; R23: Cr和Ua之間的分離度; R34: Ua和Cn之間的分離度.        圖2流動相中磷酸緩沖液濃度以及流速對分離的影響(略) 

14、       2.2方法重現(xiàn)性在選定的色譜條件下，連續(xù)5次測定了同一樣品，對各物質(zhì)的遷移時間、峰面積和峰高的重現(xiàn)性進行了考察，結(jié)果表明,各物質(zhì)的遷移時間的變化很小(保留時間的RSD值見表1)，方法的重現(xiàn)性較好.        2.3定量標準曲線、回收率以及最低檢測限配置一系列濃度的標準溶液，按上述色譜條件進行分析測定，將所測的峰面積對物質(zhì)的濃度作回歸分析，其線性相關系數(shù)均大于0.9992;以信噪比(S/N)為3來測定檢測限;添加已知量標樣，測定其

15、含量，計算方法的回收率(表1).        表1方法的相關參數(shù)(略)        2.4樣品分析在選定的色譜條件下，對標準溶液和實際DN尿樣進行了分析，5 min內(nèi)4種物質(zhì)即可達到完全分離，分離結(jié)果如圖3所示，實際DN尿樣中的4種物質(zhì)得到了很好的檢出，尿樣里的其他物質(zhì)對分析無干擾. 采用此法對某糖尿病患者以及正常人尿樣中的Cn, Cr, U，Ua分別進行測定，結(jié)果糖尿病患者尿樣中Cn, Cr, U，Ua的含量分別為10.3, 0.

16、68, 26.7，2.1 mol/mL, 正常人尿樣中的Cn, U，Ua的含量分別為7.7, 36.7，1.0 mol/mL,而Cr未被檢出.        圖3標準溶液(A)和尿樣(B)的色譜圖(略)        3討論        3.1pH對分離的影響其從圖1A中可以看出，在pH 3.57.5范圍內(nèi)U和Cr的出峰時間和順序幾乎不隨pH的變化而變化;

17、而對于Cn和Ua來說，其出峰時間和順序都隨pH的變化而變化，當pH接近5.5時，兩者的出峰時間近乎相同，得不到分離. 因此，在選擇最佳pH時，主要考慮Cn和Ua之間的分離度(Rs)以及分析的效率(分析周期短)，最終選擇緩沖能力最強，分離度較佳(Rs=4.1)的pH 6.86為優(yōu)化的分離pH.        3.2流動相中甲醇比例的選擇從圖1B中可以看出，隨著流動相中甲醇比例的增加，各標志物的出峰時間隨之減少，分離周期大大縮短，但與此同時各標志物間的分離度也相應減少，當流動相中甲醇的比例大于40%時，各物質(zhì)幾乎同時被

18、洗脫出來，難以達到分離. 最終選擇流動相中甲醇含量為30%為較佳的比例(此時分析周期較短，各物質(zhì)間分離度均大于2.0).        3.3流動相中緩沖液濃度對分離的影響從圖2A中可以看出，隨著緩沖液濃度的增加，各標志物的峰面積隨之減小. 而緩沖液濃度為5和10 mmol/L時峰面積比較接近，最終選擇緩沖能力較強的10 mmol/L為最佳緩沖液濃度.        3.4流速的優(yōu)化從圖2B中可以看出，當流速從0.4 mL/min增加到

19、0.9 mL/min時，各物質(zhì)間的分離度是逐漸增加的，并且分析周期變短;而當流速從0.9 mL/min增加到1.0 mL/min后，雖然分析效率有所提高(分離周期從4.8 min減少到4.0 min)，但各物質(zhì)間的分離度卻有所減小(此時的柱壓也過高：93.1 bar). 最終選擇0.9 mL/min為最佳流速.        3.5測定結(jié)果的分析從某糖尿病患者以及正常人尿樣測定的結(jié)果可以看出，Cn，Cr和Ua在糖尿病患者尿樣中的含量高于正常人(患者尿樣中Cr的含量遠遠高于正常人尿液中Cr的含量);而患者尿樣中U的含

20、量反而有所降低. 這些都說明患者腎功能已經(jīng)出現(xiàn)異常，非蛋白氮代謝產(chǎn)物不能很好的排出體外(對Cr的排泄率增加，而U排泄率降低)，這也從一個側(cè)面證實了患者的腎臟已經(jīng)有了一定程度的損壞.        傳統(tǒng)的分析方法的干擾因素較多，分離效率和靈敏度較差，而采用的此法可在5 min內(nèi)同時測定糖尿病腎病尿樣中的Cn, Cr, U和Ua這4種非蛋白氮代謝產(chǎn)物. 此方法具有快速、需樣量小、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，完全可運用于臨床上患者尿液的日常分析和早期腎病的監(jiān)測.     &

21、#160;  【參考文獻】        1 朱忠勇，陳之航. 臨床醫(yī)學檢驗M. 上海：科學技術出版社,1982: 300-313.        2 葉應嫵，李健齋，王玉琛. 臨床實驗診斷學M. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1991: 416-430.        3 Jen JF, Hsiao SL, Liu KH. Simultaneo

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