hREV3基因表達被反義阻斷的人胚腎細胞系的建立及其某些生物學特性觀察

1、    hREV3基因表達被反義阻斷的人胚腎細胞系 的建立及其某些生物學特性觀察        摘要目的：建立hREV3基因表達反義阻斷的細胞系并觀察其生長特性與對烷化劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)敏感性的改變。方法：利用改良磷酸鈣-DNA共沉淀法分別將本室構(gòu)建的持續(xù)和誘導表達反義hREV3 RNA的真核細胞重組表達質(zhì)粒pBK-RSV-hREV3和pMAMneo-amp-hREV

2、3?轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞(HEK-293細胞)，經(jīng)G418篩選，建立相應(yīng)的細胞系293-B-hREV3-和293-M-hREV3?。通過細胞計數(shù)方法觀察這些細胞系的生長速率和不同濃度MNNG對細胞的細胞毒作用。 結(jié)果：持續(xù)或誘導阻斷hREV3基因的表達對細胞生長速率均無影響；反義阻斷細胞系對MNNG的細胞毒作用比母本293細胞較為敏感。結(jié)論：hREV3基因的編碼產(chǎn)物并非細胞生長所必需而可能在細胞的DNA損傷修復中起作用。 主題詞基因；RNA，反義；細胞系；DNA，修復；烷化劑中分類號Q753文獻標識碼A文章編號1000-4718(2000)04-0293-05 Establishment of c

3、ell lines whose hREV3 gene expression was inhibited by transfection of antisense RNA expression plasmids and their biological characteristicsXU Fang, YU Ying-nian, SONG Tao(Department of Pathophysiology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310031, China)AbstractAIM：To establish the cell

4、 lines whose hREV3 gene expression was blocked by antisense RNA and observe their characteristis of cell growth rate and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) sensitivity.METHODS:With modified calcium phosphate-DNA coprecipitation method the eukaryocytic expression plasmid expressing antis

5、ense fragment of hREV3, pBK-RSV-hREV3? and pMAMneo-amp?hREV3? were transfected into human embryo kidney cell line of HEK-293. After G418 selection ,cell lines of 293-B-hREV3? and 293-M-hREV3? were established. By cell counting method, the cell growth rate and MNNG sensitivity of these cell lines wer

6、e characterized.RESULTS:No change of cell growth rates of these cell lines was observed whether hREV3 gene expression was blocked by either the persistent or induced expression of the antisense hREV3 RNA. While the sensitivity of these cell lines to MNNG was somewhat elevated ,as compared with their

7、 parent cell line 293 and the cell lines transfected with vector DNAs.CONCLUSION:The gene product of hREV3 was not essential for the cell growth, but it may play a role in the DNA repair functions of the cells after exposure to DNA damaging agents.MeSHGenes; RNA, antisense; Cell line; DNA, repair; A

8、lkylating agents真核細胞DNA聚合酶(DNA polymerase, pol) (pol )是近年在酵母的突變修復通路研究中發(fā)現(xiàn)的，它是由REV3與REV7緊密結(jié)合形成的蛋白復合物，無35外切酶活性，而具有DNA跨損傷修復活性(效率達10%，而pol 只有1%)，參與真菌易誤的復制后修復/誘變修復(error prone PRR/mutagenesis repair)通路1，2?？鐡p傷修復避免了細胞因模板鏈堿基損傷而導致DNA復制的永久性停止，但由于在聚合反應(yīng)中的插入偏倚(insertion bias)卻誘發(fā)了突變。REV3基因發(fā)生突變的酵母菌表現(xiàn)出自發(fā)突變率和誘發(fā)突變率的下降

9、1，3。人pol 同源基因(hREV3基因)在1998年被克隆和鑒定，由于它與真菌的REV3基因高度同源，因此推測在功能上也可能相似。目前已發(fā)現(xiàn)它在腫瘤中有高表達4。建立誘導和持續(xù)表達反義hREV3 RNA的人源細胞系將為研究hREV3基因及其編碼產(chǎn)物與遺傳不穩(wěn)定的形成和基因突變的發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。本文報告這些細胞系的建立及對它的某些生物學特性的觀察結(jié)果。材料和方法一、實驗材料(一)真核表達載體和反義重組質(zhì)粒真核細胞持續(xù)表達載體pBK-RSV購自Stratagene公司，誘導表達載體pMAMneo-amp?由本室從pMAMneo(Clontech公司)改建而得5；持續(xù)和誘導表達的反義重組表達

10、質(zhì)粒pBK-RSV-hREV3和pMAMneo-amp-hREV3-由本室構(gòu)建6，后者在真核細胞中表達需地塞米松誘導。(二)細胞人胚腎傳代細胞(HEK-293細胞)由美Georgetown大學醫(yī)學院Wolfe博士提供，本室冷凍保存。二、實驗方法(一) 表達反義hREV3 RNA的人胚腎細胞系的建立HEK-293細胞于37，5%CO濃度下貼壁生長于含10%胎牛血清(GIBCO)，100 kU.L-1青霉素，100 mg.L-1鏈霉素，200 mg.L-1卡那霉素的DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium)培養(yǎng)基(GIBCO)中。分別取20 g表達載體和反義重組表達

11、質(zhì)粒的超螺旋DNA用改良磷酸鈣-DNA共沉淀法7轉(zhuǎn)染293細胞，在含400 mg.L-1G418的DMEM(GIBCO)全培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選，15 d左右即可看見克隆生長，繼續(xù)使用含200 mg.L-1G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)并擴大成系。(二)細胞系生長檢測8用0.02% EDTA消化貼壁生長良好的細胞，按4×10細胞/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板，取轉(zhuǎn)染了反義表達質(zhì)粒的細胞為實驗組，以母本細胞和轉(zhuǎn)染表達載體DNA的細胞系為對照組，每種細胞系設(shè)6組，每組4個復孔。在DMEM完全培養(yǎng)基(誘導表達組還需加10 mol*L-1地塞米松)37、5%CO條件下培養(yǎng)，每天作1組細胞計數(shù)，共6 d，根據(jù)計數(shù)

12、結(jié)果繪制細胞生長曲線，并按公式TT×log2/logNt-log No(其中T為培養(yǎng)時間、Nt為培養(yǎng)t時間時的細胞數(shù)、No為接種的細胞數(shù))計算細胞群體倍增時間(TD)。(三)細胞系對MNNG敏感性檢測90.02% EDTA消化貼壁生長良好的細胞，以1×10細胞/孔密度接種于24孔板，取轉(zhuǎn)染了反義表達質(zhì)粒的細胞為實驗組，以母本細胞和轉(zhuǎn)染表達載體DNA的細胞系為對照組，(誘導表達細胞系需加10 mol.L-1地塞米松誘導反義RNA表達)，37，5%CO培養(yǎng)24 h后，分別以含0，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 mol.L-1濃度MNNG(Sigma)的無

13、血清DMEM培養(yǎng)基處理細胞45 min，每個濃度組3個復孔。MNNG首先溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中，新鮮配制，然后加至培養(yǎng)基中。DMSO在培養(yǎng)基中的終濃度皆固定為0.1%。處理結(jié)束后棄處理液，用Hanks液洗1遍，換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，37、5%CO條件培養(yǎng)4 d后，細胞計數(shù)。以MNNG 0濃度的計數(shù)結(jié)果為100，求出各MNNG濃度下的相對存活細胞數(shù)(%)。以它為縱軸，MNNG濃度(mol.L-1)為橫軸，作出MNNG濃度對相對存活細胞數(shù)的劑量效應(yīng)曲線。用MNNG濃度的對數(shù)進行直線回歸并分別計算抑制細胞存活的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果一、細胞系的

14、獲得經(jīng)細胞轉(zhuǎn)染及克隆篩選得到4個轉(zhuǎn)基因細胞系即含持續(xù)表達載體pBK-RSV的細胞系293-pBK-RSV(以下簡作293-B)和含誘導表達載體pMAMneo-amp-的細胞系293-pMAMneo-amp?(以下簡作293-M)，以及相應(yīng)的持續(xù)或誘導表達反義hREV3 RNA的細胞系293-pBK-RSV-hREV3?(以下簡作293-B-hREV3?)和293-pMAMneo-amp-hREV3?(以下簡作293-M-hREV3?)。二、細胞系生長曲線(見1，2)誘導阻斷hREV3基因的細胞293-M-hREV3?與相應(yīng)的對照組細胞293和293-M，在生長速率上無明顯差異，細胞群體倍增時間

15、(TD)均為1.3 d；持續(xù)表達反義hREV3 RNA的細胞293-B-hREV3?與相應(yīng)的對照組細胞293和293-B，在生長速率上也無明顯差異，各細胞群倍增時間(TD)分別為：TD2931.7 d、TD293-B1.5 d 、TD293-B-hREV3-1.5 d。Fig 1Cell growth curve of cell line 293-M-hREV3?(-) whose hREV3 gene expression was inhibited by induced expression of its antisense RNA, as compared with the parent

16、 cell line 293(-) and cell line transfected with vector DNA 293-M(-)1hREV3 基因表達被誘導表達反義RNA所阻斷的細胞系293-M-hREV3?(-)的生長曲線。與母本細胞系293(-)和轉(zhuǎn)染了載體DNA的細胞系293-M(-)相比較Fig 2Cell growth curve of cell line 293-B-hREV3?(-) whose hREV3 gene expression was inhibited by persistent expression of its antisense RNA, as com

17、pared with the parent cell line 293(-) and cell line transfected with vector DNA 293-B(-)2hREV3基因表達被持續(xù)表達反義RNA所阻斷的細胞系293-B-hREV3?(-)的生長曲線。與母本細胞系293(-)和轉(zhuǎn)染了載體DNA的細胞系293-B(-)相比較三、細胞系的MNNG敏感性比較各細胞系在不同濃度MNNG作用后的相對成活細胞數(shù)見3和4。它們的半對數(shù)回歸方程和回歸系數(shù)以及它們的MNNG半數(shù)抑制濃度(IC50)則列于表1中。hREV3基因表達被反義阻斷的細胞系(293-M-hTRV3?/293-B-hT

18、RV3?)的半數(shù)抑制濃度(IC50）的95%可信限區(qū)間與其相對應(yīng)兩對照組(母本細胞293和轉(zhuǎn)染了載體DNA的細胞系293-M/293-B)的半數(shù)抑制濃度(IC50)95%可信限區(qū)間之間都不重疊，而hREV3基因表達被反義阻斷的細胞系的半數(shù)抑制濃度(IC50)均低于相應(yīng)的對照組，這表明hREV3基因表達被阻斷的細胞系對MNNG的敏感性比對照組高。Fig 3MNNG sensitivity of cell line 293-M-hREV3?(-) whose hREV3 gene expression was inhibited by induced expression of its antis

19、ense RNA, as compared with the parent cell line 293(-) and cell line transfected with vector DNA 293-M(-)3誘導表達反義hREV3 RNA細胞系293-M-hREV3?(-)對MNNG的敏感性。與母本細胞系293(-)和轉(zhuǎn)染了載體DNA的細胞系293-M(-)相比較Fig 4MNNG sensitivity of cell line 293-B-hREV3?(-) whose hREV3 gene expression was inhibited by persistent expressi

20、on of its antisense RNA, as compared with the parent cell line 293(-) and cell line transfected with vector DNA 293-B(-)4持續(xù)表達反義hREV3 RNA細胞系293-B-hREV3?(-)對MNNG的敏感性。與母本細胞系293(-)和轉(zhuǎn)染了載體DNA的細胞系293-B(-)相比較表1hREV3基因表達阻斷細胞系的MNNG濃度(x)與其相對存活數(shù)(y)間的回歸方程和IC50Tab 1The regression lines of MNNG concentration(x) ve

21、rsus relative cell survival (y) of cell lines with different hREV3 gene expression and their IC50Cell linesRegression linesRegression coefficient95% confidence limits of IC50(mol/L)IC50(mol/L)293y-0.8707 lnx+3.7541R20.94340.28-0.200.24293-My-0.655 lnx+3.8955R20.96530.23-0.150.19293-M-hREV3-y-0.4991

22、lnx+3.8379R20.95950.13-0.070.10293y-0.7147 lnx+3.8134R20.99770.29-0.120.19293-By-0.9342 lnx+3.4002R20.96100.25-0.130.18293-B-hREV3-y-0.6461 lnx+3.4534R20.97550.13-0.060.09討論我們用反義核酸技術(shù)(antisense technique)在mRNA水平上特異性阻斷293細胞中hREV3 基因表達，建立了持續(xù)和誘導表達反義hREV3 RNA的人胚腎細胞系，發(fā)現(xiàn)hREV3基因表達被阻斷的細胞系，不論其阻斷是持續(xù)的還是暫時的其生長與母

23、本293細胞和僅轉(zhuǎn)染了相應(yīng)載體DNA的細胞系并無明顯差異。但對烷化劑MNNG細胞毒作用的敏感性有影響，hREV3表達被反義阻斷的細胞系的半數(shù)抑制濃度較母本293細胞和相應(yīng)對照細胞系為低，即對MNNG的敏感性升高。最近在美國癌癥研究協(xié)會(AACR)第90屆年會上Gatza研究小組報道用紫外線(UV)照射反義阻斷hREV3基因的人成纖維細胞，其突變率比母本成纖維細胞突變率低。這些結(jié)果提示hREV3基因是非細胞增殖所必需，而可能參與細胞易誤的跨損傷修復10，造成細胞遺傳不穩(wěn)定和突變的發(fā)生。本研究室曾用MNNG在猴腎vero細胞中于未受攻擊的堿基部位誘導出突變非定標性突變11，并證實這種非定標性突變的

24、發(fā)生依存于處理細胞的基因表達改變；用mRNA差異顯示技術(shù)分離 部分MNNG處理引起的vero細胞中表達改變的基因片段12，并通過反義核酸阻斷技術(shù)分離到2個可影響非定標性突變發(fā)生的表達序列標識(expression sequence tag, EST)13，14；還證明MNNG處理的vero細胞有DNA復制保真度的降低15，伴有pol的表達明顯升高16。本文所建立的細胞系和初步觀察結(jié)果，將有助于進一步闡明hREV3基因功能以及揭示hREV3基因及其產(chǎn)物真核細胞聚合酶pol與細胞遺傳不穩(wěn)定和非定標性突變發(fā)生的關(guān)系。?基金項目國家自然科學基金重點項目(No.39830210)徐方（浙江大學醫(yī)學院病理

25、生理教研室， 浙江 杭州 310031）余應(yīng)年（浙江大學醫(yī)學院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031）宋韜（浙江大學醫(yī)學院病理生理教研室， 浙江 杭州 310031）參考文獻1Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Deoxcytidyl transferase activity of yeast Revl proteinJ. Nature, 1996,382(6593):729731.2Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase

26、 J. Science, 1996,272(5268):16461649.3Wood RD, Shivji Mk. Which DNA polymerases are used for DNA-repair in eukaryotes?J. Carcinogenesis, 1997,18(4):605610.4Xiao W, Lawchler T, Chow BL, et al. Identification, chromosome mapping and tissue-specific expression of hREV3 encoding a putative human DNA pol

27、ymerase J. Carcinogenesis, 1998,19(5):945949.5胡文蔚，余應(yīng)年，陳星若，等.構(gòu)建能與pZ189系列穿梭質(zhì)粒配套適用的真核細胞表達載體J.中國藥理學與毒理學雜志，2000，14(2)：印刷中.6徐方，余應(yīng)年，胡文蔚.表達反義hREV3基因片段的真核細胞表達質(zhì)粒的構(gòu)建J.中國病理生理雜志，1999，15(8)：703706.7薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編.分子克隆實驗指南M.第2版.北京：科學出版社，1996.792793.8司徒鎮(zhèn)強，吳軍正，主編.細胞培養(yǎng)M.世界書出版社公司，1996.169175.9錢瑛，余應(yīng)年，陳星若，等.Molecular events after antisense inhibition of hMSH2 in a HeLa cell lineJ. Mutat Res, 1998, 418:6171.10Gatza E, McGrego