p16基因突變及蛋白表達異常與人胰腺癌關系的研究

1、    p16基因突變及蛋白表達異常與人胰腺癌 關系的研究        【摘要】目的研究p16基因的突變及蛋白表達異常在人胰腺癌發(fā)生及侵潤轉(zhuǎn)移中的作用。方法應用PCR、PCR-SSCP、DNA測序及免疫組織化學技術，對35例人胰腺癌的p16基因第2外顯子進行了檢測，研究p16基因的突變及蛋白表達情況。結(jié)果12例在p16基因第2外顯子部分存在至少522 bp的純合缺失。7例存在2個點突變(突變位點均相同)：其一為第126密碼子堿基GTCAAT的錯義突變，氨基酸由纈氨

2、酸(Val)變成了天冬酰胺(Asn)；另一為第127密碼子GCA-GCG的同義突變。缺失及突變共占54.3%(19/35)。P16蛋白三維結(jié)構模擬提示，Val 126Asn對蛋白空間結(jié)構有一定影響，從而影響P16蛋白的功能。12例缺失標本呈現(xiàn)P16蛋白表達陰性，9例標本(其中7例點突變)出現(xiàn)P16蛋白表達下降，共占60%(21/35)。結(jié)論p16基因的突變及蛋白表達異常，與人胰腺癌的發(fā)生、侵潤轉(zhuǎn)移及臨床分期有明顯的相關性，且有助于判斷胰腺癌的惡性程度和患者的預后?！娟P鍵詞】胰腺癌；p16基因；三維結(jié)構 Study on the relationship of alteration and ex

3、pression of p16 gene to pancreatic carcinomaZHOU Jiahua, YANG Detong, ZHANG Lishan, SU Zhanhai(Department of Bile-pancreatic Surgery, the Genetic Centre, the Affiliated Hospital of Nanjing Railway Medical College, Nanjing, Jiangsu, 210009 P.R. China. E-mail:zhoujiahua)WANG Jin,FAN Yao(The National K

4、ey Opening Laboratory of Biology and Medicine and Pharmacology Technology, Nanjing University, Nanjing, Jiangsu, 210008 P.R. China)YAO Qing(Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Nanjing Railway Medical College, Nanjing, Jiangsu, 210009 P.R. China)【Abstract】ObjectiveTo directly investig

5、ate the effect of genetic alteration(homozygous deletion and point mutation) and expression of p16 gene on pancreatic carcinomas. MethodsThirty-five cases were analyzed for genetic alteration and expression of p16 gene by polymerase chain reaction(PCR), single strand conformation polymorphism(SSCP),

6、 DNA sequencing and immunohistochemical method. ResultsThe analysis of pancreatic carcinoma for p16 gene revealed alteration in 19 of 35 cases, among which 12 pancreatic carcinomas had 522 bp homozygous deletion at least and 7 cases had two point mutations at the same site. One of them is 126th codo

7、n GTCAAT (Val126Asn); the other is 127th codon GCAGCG (A127A). The 3D (three-dimensional)structure of P16 protein determined by computer techniques according to PDB indicated that Val126Asn influenced the space structure of P16 protein and affected the function of P16 protein. Twelve cases revealed

8、no P16 protein and 9 cases showed low level expression of P16 protein. ConclusionThe alteration of p16 gene and abnormal expression of P16 protein are significantly correlated with the biological behavior and clinical staging of pancreatic carcinoma and may hence be helpful to prognostication.【Key w

9、ords】pancreatic carcinoma;p16 gene;three-dimensional structure人胰腺癌是常見的腫瘤之一，其發(fā)病率呈上升趨勢。臨床難以早期發(fā)現(xiàn)，且進展快、易轉(zhuǎn)移，5年生存率在5%以下，死亡率高。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因p16失活與人胰腺癌有較為密切的關系。我們應用聚合酶鏈反應(PCR)-單鏈構像多態(tài)性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)結(jié)合DNA測序及免疫組織化學技術，對35例人胰腺癌的p16基因外顯子2進行了檢測，探討p16基因變異和蛋白異常表達與人胰腺癌生物學行為及臨床分期的關系。1對

10、象與方法1.1標本采集及臨床相關資料35例人胰腺癌患者的癌組織及癌旁正常組織，其中12例為新鮮外科手術標本，23例為石蠟塊標本。分別由南京鐵道醫(yī)學院附屬醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院、江蘇省腫瘤醫(yī)院提供并鑒定。男女為43，年齡最大74歲，最小19歲，平均61歲。1.2DNA模板的制備基因組DNA提取按常規(guī)酚氯仿異戊醇方法制備，對石蠟標本連續(xù)切片4 m×10片、脫臘、水化，再按酚氯仿異戊醇方法提取。提取后分別用瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，定性檢查有無降解，并用DU-70紫外分光光度計進行定量檢測純度，A260A280比值在1.51.9之間較佳(A為吸光度，舊稱光密度OD)。1.3PCR-SSCP銀

11、染為p16基因的第2外顯子設計套式PCR擴增的4對引物(1對外側(cè)，3對內(nèi)側(cè))，由中國科學院上海生物工程公司合成，見表1。每對引物稀釋成10 pmol/l。第1輪PCR擴增外側(cè)522 bp的片段，反應體系為10×反應緩沖液5 l、DMSO2.5 l、25 mol/L Mg2+1.5 l、10 mol/L dNTP 1l、10 pmol上下游引物各4 l、基因組DNA0.3 g(6 l)、TaqDNA聚合酶2.5 U，總體積50 l，循環(huán)參數(shù)：955 min、9530 s、50 30 s、72 75 s，35個循環(huán)，72延伸10 min；第2輪PCR分別擴增158 bp、150 bp及1

12、40 bp的片段，反應體系以上一輪PCR擴增產(chǎn)物為模板1100稀釋6 l、10×反應緩沖液5 l、25 mol/L Mg2+1.5 l、10 mol/L dNTP 1 l、上下游引物各4 l、TaqDNA聚合酶2.5 U，總體積50 l，循環(huán)參數(shù)：943 min、94 30 s、5030 s、7245 s，35個循環(huán)，72延伸5 min。取12 l的PCR擴增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳，以100 bp DNA ladder marker作標記。檢測PCR擴增產(chǎn)物的濃度及純度，有無出現(xiàn)缺失，對出現(xiàn)缺失的標本及未缺失的標本進行重復并加-actin對照引物進行PCR擴增，出現(xiàn)180 bp條帶

13、而未出現(xiàn)522 bp條帶為缺失。取未發(fā)生缺失的PCR產(chǎn)物變性后經(jīng)8%12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠恒壓500 V、溫度15電泳4 h，銀染分析。表1PCR擴增及套式擴增的p16基因的引物序列和片段Table 1 The primer sequence and product of PCRPrimer(引物)Primer sequence(引物序列)Size(bp)(長度)(bp)p16extra(外側(cè))5-TCTGAGCTTTGGAAGCTCTCA-35225-GAGAACTCAAGAAGGAAATTGG-3intra(1)(內(nèi)側(cè))5-CATTCTGTTCTCTCTGGCAG-31585-CAC

14、CACCAGCGTCTTCCAGGAA-3intra(2)5-GACCCGTGCACGACGCT-31505-GGTACCGTGCGACATCGC-3intra(3)5-TGGACCTGGCTGAGGAG-31405-CAAATTCTCAGATCATCAGTCCTC-3-actin5-CAACTCCATCATGAAGTGTAAC-31805-CCACACGGAGTAACTTGCGCTC-31.4DNA測序?qū)τ挟惓５?40 bp片段重新進行100 l反應體系的PCR擴增，將PCR產(chǎn)物純化后郵往大連寶生物工程公司進行DNA測序。1.5P16蛋白三維空間結(jié)構模擬P16全套原子坐標由In-Ja L.

15、Byeon & Ming-Daw Tsai教授(美國Ohio State University)提供，將獲得的原始原子坐標進行能量優(yōu)化以釋放可能存在的不合理原子接觸等。將126Val殘基改為Asn，為模擬該突變體結(jié)構，進行能量優(yōu)化過程。首先進行500最陡下降法(SD)，然后再進行共軛梯度法優(yōu)化。為避免陷入局部能量極小，采用模擬退火方法對系統(tǒng)先升溫至1000 K，再降至300 K并平衡，進行8 ps的動力學構象空間搜索。再采用SD法和共軛梯度法進行能量優(yōu)化，獲得初步優(yōu)化的突變體結(jié)構。1.6免疫組化采用敏感的LSAB技術：石膜包埋組織作4 m厚的切片，常規(guī)脫臘水化。將切片置于0.01 mo

16、l/L檸檬酸鹽緩沖液中(pH6.0)，微波爐煮沸10 min修復抗原，取出待冷卻至室溫后，用蒸餾水洗3次，繼用0.3%H2O2-甲醇常溫下孵育切片10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。擦去周圍PBS，滴加封閉劑，置切片于濕盒中孵育37 20 min，吸去封閉劑(勿洗)，用P16抗體(santa cruz)120濃度滴加，37孵育1 h，4濕盒過夜，切片用PBS洗3次×5 min。滴加LSAB(DAKO公司)二抗工作液，置切片于濕盒中37孵育30 min，PBS洗3次×5 min。滴加LSAB的三抗工作液(即ABC)置切片于濕盒中37孵育30 min，PBS洗3次×

17、5 min，將DAB以DAB工作液稀釋50倍滴加到切片上，顯色510 min(在顯微鏡下控制顯色)后用自來水沖洗3 min終止，用蘇木素復染11.5 min，沖洗10 min，脫水、透明、封片、鏡檢。1.7統(tǒng)計學分析計數(shù)資料根據(jù)四格表精確概率法進行處理，根據(jù)FI值決定P值大小。 2結(jié)果2.1外顯子2缺失的結(jié)果以522 bp的外側(cè)引物對35例胰腺癌進行PCR擴增，其中有12個標本缺失。為排除實驗誤差，對上述標本進行重復擴增，并加-actin引物(擴增片段180 bp)進行內(nèi)對照。以100 bp ladder的marker(Gibco)為標志，確認12個標本有p16基因的缺失，缺失率為34.3%，

18、見1。中顯示腫瘤標本未出現(xiàn)522 bp的條帶，但出現(xiàn)180 bp的對照條帶，而癌旁正常標本同時出現(xiàn)180 bp和522 bp的條帶。1p16基因外顯子2缺失情況M：標志；T：腫瘤；N：癌旁標本Fig 1Exon 2 homozygous deletion of p16 geneM:marker of 100 bp ladder; T:tumor; N:normal2.2SSCP銀染篩查對158 bp、150 bp的擴增產(chǎn)物進行SSCP篩選，未發(fā)現(xiàn)異常。對140 bp的片段進行SSCP篩查，發(fā)現(xiàn)有8例出現(xiàn)單鏈DNA泳動速度的變化，為防止誤差進行重復，陽性率為23.3%，見2。中顯示癌旁正常標本出

19、現(xiàn)4條帶，而腫瘤標本出現(xiàn)3條帶或2條帶。2胰腺癌組織p16基因第2外顯子140 bp擴增片段SSCP結(jié)果T：腫瘤；N：癌旁標本Fig 2 140 bp of exon 2 of p16 gene in pancreaticcarcinoma by SSCP T:tumor; N:normal2.3DNA測序結(jié)果SSCP測出的8個異常標本中有7個出現(xiàn)DNA序列的變化，突變位點相同。第126密碼子堿基GTCAAT，為錯義突變，氨基酸由Val變成了Asn；第127密碼子GCAGCG為同義突變，氨基酸仍為Ala。陽性率為20%，1個標本無變化，見3。3DNA測序結(jié)果上為癌旁標本；下為腫瘤Fig 3 T

20、he results of DNA sequencing up:normal; down:tumor2.4P16蛋白三維空間結(jié)構模擬結(jié)果見4，5。正常P16蛋白是由4個回鉤狀重疊的空間構型結(jié)構蛋白，其中每個回鉤由2個螺旋組成，它是P16蛋白的活性中心，也是和CDK4作用的部位。而外顯子2缺失標本的P16蛋白已沒有完整的空間結(jié)構。4顯示突變型(Va1126Asn)P16蛋白的三維空間結(jié)構在第3個回鉤有一定程度的變化。進一步從顯示了殘基126位附近空間距離4Å范圍內(nèi)的原子相互作用情況來看，5B顯示了126Asn的酰胺基與對面相鄰的helix(90100位殘基組成)上的91、94位殘基主鏈

21、形成了2個氫鍵，在一定程度上破壞了該helix的二級結(jié)構，使得兩殘基的C距離增加了1Å；此外該回鉤內(nèi)部存在1個由疏水側(cè)鏈(8991，94)組成的疏水中心與1個由(123125)位荷電殘基組成的極性中心，由于126位Val變?yōu)锳sn引入極性側(cè)鏈，使得兩中心的平衡有所偏移，極性中心增強，疏水中心減弱。4P16蛋白以條帶形式表現(xiàn)的三維空間結(jié)構Fig 4 3D structure of P16 with backbone5126位Val/Asn殘基附近空間距離4Å范圍內(nèi)的原子相互作用(90100，123134)Fig 5 The interaction of atom within

22、 4Å range at amino acid position 126Val/Asn(90-100,123-134)6胰腺癌p16蛋白表達陽性(×200)Fig 6 The expression of P16 protein ?(×200)2.5免疫組化結(jié)果我們對35例胰腺癌標本及正常組織進行p16蛋白的免疫組化分析，以已知乳腺癌陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照，以正常胰腺組織作正常對照。胞漿染成棕黃色作為陽性判斷標準，按無陽性瘤細胞或陽性瘤細胞數(shù)表達10%為陰性，陽性瘤細胞細胞數(shù)表達25%為“+”，細胞數(shù)占25%50%為“”，細胞數(shù)50%為“”。發(fā)

23、現(xiàn)有21個標本出現(xiàn)不同程度的P16蛋白表達下降(12例陰性，9例“”)，與p16基因改變相比，有2例未出現(xiàn)基因改變而蛋白表達下降。6中胞漿棕黃色的顆粒為P16蛋白，而細胞核被復染成藍色。2.6p16基因變異及蛋白表達與人胰腺癌相關性的統(tǒng)計學分析結(jié)果分析表明p16基因的突變與人胰腺癌患者性別、年齡及病理類型無明確的關系，而與侵潤程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明確的關系，見表2。表2人胰腺癌生物學行為與p16基因突變及蛋白表達的關系Table 2 The relationship between mutation and expression of p16 gene and biological behavi

24、or of human pancreatic carcinomaBiological behavior(生物學行為)p16 gene(p16基因)P16 protein(P16蛋白)No. of mutation(突變例數(shù))No. of normal(未突變例數(shù))Low expression(表達下降)Normal expression(表達正常)Age(年齡)59.78±12.7361.33±8.5560.86±12.3160.27±8.10Sex(性別)male(男性)119119female(女性)87105Pathology type(病理分型)

25、papiliary adenocystoma(乳頭狀囊腺瘤)1212cystadenocarcinoma(囊腺癌)2121duct cell adenocarcinoma(導管腺癌)1411169mucinous adenocarcinoma(粘液腺癌)2121adenosquamous carcinoma(鱗癌)0101Histologic differentiation(分化程度)well-diff.(高)1414mod-diff.(中)107107poorly-diff.(低)85103Invasion stage(浸潤程度)invasive(累及周圍臟器)168*177*non-inv

26、asive(未累及周圍臟器)3847Lymphnode metastasis(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)present(有)135#153#absent(無)611611TNM stage(TNM分期)(期)2323(期)4848(期)113122(期)2231* P0.05(FI=4.56)；* P0.05(FI=4.68)；#：P0.05(FI=3.59)；#：P0.05(FI=8.29)；：P0.05(FI=5.67)；：P0.05(FI=7.96)；No. of mutation and expression of p16 gene of patient with TNM was significa

27、ntly more than that of and (期與期+期相比差異有顯著性)3討論p16基因是第1個被證明為腫瘤抑制基因的細胞調(diào)控機理的內(nèi)在成分，從根本上連接了曾一度互不相關的兩個研究領域細胞周期調(diào)控與腫瘤抑制劑，是近年來腫瘤分子生物學研究的一個熱點1。研究發(fā)現(xiàn)p16基因與人胰腺癌有較為密切的關系。Caldas等2在對胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，10種細胞株中5個缺失、3個突變，總失活率達80%；而在27例原發(fā)腫瘤中有10個標本缺失，占37%；有11個標本發(fā)生點突變，占41%。也有低于該比例的報道3，4，但p16缺失率相似約在40%左右。最近Muscarella等5報道12例原發(fā)腫瘤標本中p1

28、6基因缺失率為41.7%，甲基化為58.3%。我們在35個病例中發(fā)現(xiàn)有12個標本缺失(占34.3%)，7個發(fā)生點突變(占20%)，總突變率為54.3%，低于上述報道?？赡艿脑蛴校?1)種族差異；(2)在標本采集時混入正常細胞而干擾了實驗結(jié)果；(3)僅做了外顯子2。我們用PCR-SSCP篩查出的8個異常標本的140 bp擴增產(chǎn)物，DNA測序顯示7個標本DNA序列有變化，而1個標本無變化。其原因可能是由于在測序時開始的一段堿基測不出來，而突變位點恰好在該區(qū)域。目前通過DNA序列測定突變位點較多6-8，主要有移碼突變、錯義突變及無義突變。我們的研究發(fā)現(xiàn)7個標本存在2個點突變，突變位點均相同，一為第

29、126密碼子堿基GTC突變?yōu)锳AT，氨基酸由纈氨酸(Val)變成了天冬酰胺(Asn)，引起野生型P16蛋白表達下降；另一為第127密碼子GCA-GCG，氨基酸仍為丙氨酸，為同義突變，突變位點與上述報道相同。同義突變可使偏愛密碼子變成非偏愛密碼子，從而導致相應的tRNA由多數(shù)型轉(zhuǎn)為少數(shù)型，結(jié)果使該密碼子的表達明顯減低，影響蛋白質(zhì)的合成，造成了蛋白表達的下降。P16蛋白(156個氨基酸)主要是由4個錨蛋白重復序列(ankyrin repeat)構成，重復序列在抑制作用中占主要地位。體外實驗同樣證明，在錨蛋白重復序列以外區(qū)域發(fā)生p16基因的變異對P16蛋白的功能沒有影響6，說明錨蛋白重復序列決定P1

30、6蛋白的功能。本研究中第126位密碼子突變和外顯子缺失剛好在重復區(qū)域范圍內(nèi)，從而影響P16蛋白的功能。從模擬突變型P16蛋白結(jié)構來看，初步結(jié)構模擬顯示所在helix(123134)與相對應的野生型主鏈結(jié)構比較的RMS為1.24Å，其對面相鄰的helix(90100)與相對應的野生型結(jié)構比較發(fā)生了RMS為1.76Å的偏離。突變對P16蛋白的結(jié)構和功能產(chǎn)生了相應的影響。當然可通過進一步模擬野生型P16蛋白及蛋白突變體與CDK4對接Docking相互作用，獲得該突變體對P16蛋白的結(jié)構和功能的詳細影響8。細胞中野生型P16蛋白含量較多，所以用一般的免疫組化檢測到的P16蛋白是野生

31、型而非突變型，有較高的臨床應用價值。我們用LSAB方法對35例胰腺癌進行P16蛋白表達研究，有21個標本出現(xiàn)不同程度的P16蛋白表達下降(12例陰性，9例“”)，占60%，從而不能抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。其中有2例P16蛋白表達下降，但并未發(fā)現(xiàn)基因缺失或突變，可能有兩種原因：(1)p16外顯子1或3發(fā)生改變；(2)p16基因除缺失、突變外，有其它機理如甲基化的參與5。我們應用PCR-SSCP、DNA測序技術對35例人胰腺癌標本及癌旁組織中p16基因外顯子2區(qū)域進行了突變檢測，發(fā)現(xiàn)有54.3%的病例p16基因變異，并用免疫組化方法檢測有60%的病例P16蛋白表達下降，從而證實了p16基因突變參與了人

32、胰腺癌的發(fā)生。一般認為，人胰腺癌分化程度低、浸潤廣泛、及臨床分期處于-期的患者預后較差。我們的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析表明，p16基因的突變及蛋白表達異常與胰腺癌患者的性別、年齡及病理類型無明確的關系；分化程度高的人胰腺癌標本p16基因及蛋白表達下降率為20%(1/5)，而中、低分化突變率為60%(18/30)，蛋白表達下降率為66%(20/30)，說明分化程度低p16失活高，但差異無顯著性，可能與病例少有關。統(tǒng)計學分析還表明，p16基因的突變及蛋白表達異常與侵潤程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明確的關系，以及臨床分期期有明確的關系，我們尚未進行進一步術后隨訪。Bartsh等9報道p16基因突變與胰腺癌期有相關性，

33、而術后隨訪發(fā)現(xiàn)發(fā)生p16突變的患者平均存活5個半月，無p16突變的患者平均存活19個月，差異明顯。Naka等10用免疫組化方法檢測P16蛋白表達，發(fā)現(xiàn)P16蛋白表達陰性與臨床分期有關，5例P16蛋白表達陽性的患者存活3年，而陰性病例存活很短，說明p16基因的檢測對人胰腺癌的診斷及預后判斷有重要的臨床意義。 作者單位：周家華（南京鐵道醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院膽胰外科210009）楊德同（南京鐵道醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院膽胰外科210009）張麗珊（遺傳中心）蘇占海（遺傳中心）姚青（病理科）王進（南京大學醫(yī)藥生物技術國家重點開放實驗室）范?（南京大學醫(yī)藥生物技術國家重點開放實驗室）參考文獻1，Mar

34、x J. New tumor suppressor may rival p53. Scinece, 1994, 264344-345.2，Caldas C, Hahn SA, da Costa LT, et al. Frequent somatic mutation and homozygous deletions of p16 (MTS1) gene in pancreatic adenocarcinoma.Nat Genet, 1994, 827-32.3，Huang L, Goodrow TL, Zhang SY, et al. Deletion and mutation analyse

35、s of the p16/MTS1 tumor suppressor gene in human ductal pancreatic cancer reveals a higher frequency of abnomalities in tumor-derived cell line than in primary ductal adenocarcinomas. Cancer Res, 1996, 561137-1141.4，Bartsh D, Douglas W, William S, et al. Frequent mutations of CDKN2 in primary pancreatic adenocarcin