新藤黃酸的研究

1、新藤黃酸固體分散體的制備【摘要】：新藤黃酸是一種弱酸性的難溶性物質(zhì)，毒性和不良反應(yīng)大，而且靜脈給藥時有強烈的血管刺激性，此外，新藤黃酸在體內(nèi)的半衰期短，由于這些特性限制了其臨床應(yīng)用。而固體分散體制備技術(shù)是將難溶性高度分散的在固體載體材料中，形成固體分散體（solid dispersion）的新技術(shù)。關(guān)鍵詞：固體分散體；溶出度；載體材料。一藥物的基本情況：新藤黃酸( neo-gambogic acid,NGA)又稱為藤黃號, 是從藤黃科植物藤黃中提取分離出來的一種抗腫瘤有效成分。藤黃( Gamboge) 系藤黃科植物藤黃( Garcinia hanburyiHook.f)所分泌出的干燥樹脂, 呈

2、紅黃色或橙紅色, 圓柱形或不規(guī)則的塊狀物, 質(zhì)脆易碎, 主要產(chǎn)于柬埔寨、泰國、越南, 是我國傳統(tǒng)進口南藥。研究證實, 藤黃中的藤黃酸( Gambogic acid)、新藤黃酸( Neogambogic acid) 為藤黃抗腫瘤作用的有效成分, 具有抗瘤譜廣, 毒性較低的特點。1 研究表明，藤黃酸、新藤黃酸均具有較強的抗腫瘤作用，其抗瘤譜廣，毒性較低，能選擇性地作用于腫瘤細胞，而對正常動物造血系統(tǒng)和免疫功能影響較小，對肺癌、胰腺癌、胃癌等具有較好的療效3 6，是極具開發(fā)前景的天然抗腫瘤藥物。在藤黃中, 新藤黃酸的含量可達到8.01% 37.8% 7 , 新藤黃酸的熔點mp.76.478.0。因此

3、如何優(yōu)化其提取分離工藝具有實際意義。二.藥物當前制劑的類型1.新藤黃酸納米粒 新藤黃酸水溶性較差, 易降解,且毒性和不良反應(yīng)較大, 將其制備成新藤黃酸納米?？梢蕴岣咚纳锢枚? 減少對正常組織的毒性和不良反應(yīng)，新藤黃酸納米粒由安徽中醫(yī)學院胡容峰等研制8。2.新藤黃酸包合物凍干粉 新藤黃酸是一種難溶的弱酸性藥物，經(jīng)L-精氨酸助溶后制成的靜脈注射劑對給藥部位有一定的刺激性，為了降低其用藥刺激性，選用注射用羥丙基-環(huán)糊精（HP-CD）作為包合材料對其進行包合，再采用真空冷凍干燥法制備包合物凍干粉針。凍干粉具有較好的穩(wěn)定性和溶解性，可供溶血性和血管刺激性實驗研究。該制劑由安徽中醫(yī)學院胡海霞等研制9

4、。3. 新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒 新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒以生理相容的高熔點脂質(zhì)為骨架材料制備，將藥物包裹或內(nèi)嵌于類脂核中，制成粒徑約為501000nm的固體膠粒給藥系統(tǒng)，副作用小，室溫及體溫下呈固態(tài)粒子10。結(jié)合臨床需求和目前制劑的發(fā)展情況，安徽中醫(yī)學院陳衛(wèi)東等將新藤黃酸藥制備成固體脂質(zhì)納米粒，控制粒徑大小，期望減小新藤黃酸的血管刺激性，提高體內(nèi)生物利用度，更好地發(fā)揮其藥理作用11。4. 新藤黃酸親水凝膠骨架緩釋片 骨架緩釋片是目前制藥工業(yè)應(yīng)用和開發(fā)最活躍的劑型之一,它具有制備工藝簡單, 安全性好, 組方容易等特點。新藤黃酸具有顯著的抗腫瘤活性, 對小鼠腹水型肝癌、艾氏腹水癌、肺癌等有顯著的抑殺

5、作用, 作為一種天然抗腫瘤藥物, 具有廣闊的開發(fā)前景11。安徽中醫(yī)學院趙煤礦等采用羥丙甲基纖維素( HPMC) 為主要緩釋材料, 研制12h給藥1次的新藤黃酸親水凝膠骨架片, 并優(yōu)化處方, 得到最佳制劑工藝12。 三. 新藤黃酸固體分散體的制備 新藤黃酸是一種弱酸性的難溶性物質(zhì)，毒性和不良反應(yīng)大，而且靜脈給藥時有強烈的血管刺激性，此外，新藤黃酸在體內(nèi)的半衰期短，由于這些特性限制了其臨床應(yīng)用。而固體分散體制備技術(shù)是將難溶性高度分散的在固體載體材料中，形成固體分散體（solid dispersion）的新技術(shù)。其特點是提高難溶性藥物的融出速率和溶解度，以提高藥物的吸收和生物利用度。固體分散體可看作

6、是中間體，用以制備藥物的速釋和緩釋制劑，也可制備腸溶劑13。藤黃醇提物中含量最多的是藤黃酸，其次為新藤黃酸。將藤黃樹脂溶于一定體積的吡啶，使得藤黃樹脂中含量最多的酸性成分藤黃酸與吡啶成鹽而析出，含量少的成分留在母液中。這樣，可使母液中新藤黃酸的含量增加，達到富集的目的。1.新藤黃酸的制備1.1 藤黃酸吡啶鹽的制備取藤黃醇提物(40 g)，按質(zhì)量:體積(MV)比11.5加入吡啶60 mL于70水浴上加熱溶解,趁熱抽濾,濾液轉(zhuǎn)移至200mL燒杯中,用少許吡啶潤洗抽濾瓶,合并洗液和濾液，按體積比(VV)10013加入10mL40溫水充分攪拌，放置冰箱冷卻過夜。析出橘紅色沉淀，抽濾，濾餅依次由70%吡

7、啶溶液，水各洗3次，80烘干得到黃色藤黃酸吡啶鹽粗品12.5g進一步精制，酸化得藤黃酸,濾液待用14。1.2 新藤黃酸的制備將濾液用1%鹽酸水溶液調(diào)pH= 4,乙酸乙酯萃取。合并有機層，水洗至近中性，用無水硫酸鈉干燥。過濾，減壓回收溶劑，得桔紅色粉末。取5g置100mL圓底燒瓶中，用丙酮溶解,加100200目硅膠適量拌樣。選用長約為50 cm內(nèi),徑為4 cm的層析柱，用100200目硅膠裝柱，柱長高度為20cm,在用真空泵抽負壓1h，加入制備好的拌樣硅膠，再加1cm100200目硅膠，真空泵抽負壓0.5 h先以乙酸乙酯石油醚二乙胺=1100.05為流動相進行洗脫，再依次用乙酸乙酯石油醚二乙胺=

8、 110.05，乙酸乙酯二乙胺= 10.05、甲醇乙酸乙酯二乙胺= 1200.05、甲醇乙酸乙酯二乙胺= 1100.05 等不同組成的流動相進行梯度洗脫，TLC檢測，收集不同的組分。TLC顯示，洗脫液為甲醇乙酸乙酯二乙胺= 1100.05的組分即為目標物新藤黃酸。將收集液減壓濃縮至干，殘留物加乙酸乙酯溶解，1%HCl 水溶液洗滌至有機層不含二乙胺，再水洗至近中性，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥。過濾，濾液減壓濃縮，得亮黃色粉末新藤黃酸1.24g，收率為24.8%( 以母液處理物計) 15 。2. 載體材料 固體分散體的融出速度在很大程度上取決于所用載體材料的特性。載體材料應(yīng)具有下列條件：無毒、無致

9、癌性、不與藥物發(fā)生化學變化、不影響主藥的化學穩(wěn)定性、不影響藥物的療效與含量檢測、能使藥物得到最佳分散狀態(tài)或緩釋效果、價廉易得。常用的載體材料可分為水溶性、難溶性和腸溶性三大類16。因為綜合考慮的新藤黃酸的化學特性和物理性質(zhì)，新藤黃酸固體分散體的載體材料采用腸溶性載體材料。常用的載體材料有纖維素類和聚丙烯酸樹脂類：2.1 纖維素類 常用的有纖維醋法酯、鄰苯二甲酸羥丙甲纖維素以及羧甲乙纖維素，因為均能溶解于腸溶液中，用來制備胃中不穩(wěn)定的藥物在腸道釋放和吸收、生物利用度高的新藤黃酸的固體分散體。由于它們的化學結(jié)構(gòu)不同，黏度有差異，釋放速率也不相同。CAP和PEG聯(lián)用制成固體分散體，可控制釋放速率，有

10、較好的臨床開發(fā)應(yīng)用前景。2.2 聚丙烯酸樹脂類 常用Eudragit L100和Eudragit S100。3. 固體分散體的類型 共沉淀物（也稱共蒸發(fā)物）是由藥物與載體材料以恰當?shù)谋壤旌?，形成共沉淀無定形物，有時也稱玻璃態(tài)共熔體，因其有如玻璃的質(zhì)脆、無確定的熔點17。4.分散體的制備4.1 儀器：UV-1601型紫外可見分光光度計( 日本島津) ，ZRS-8G 智能溶出試驗儀，ZK-82A真空干燥箱，HWS24型溫水浴鍋，DPL-0.5 流化床包衣機( 重慶精工制藥機械有限公司) ，DTA1700 差熱分析儀( 美國Perkin-Elmer公司)4.2 材料：新藤黃酸原料藥(過80目篩)，

11、PEG6000、PEG4000、PVPK30 ，聚乙烯吡咯烷酮K30，泊洛沙姆188(F68，BASF)，十二烷基硫酸鈉(SLS)，空白小丸( 100目，自制)，其他試劑均為分析純。4.3 實驗方法 NGA固體分散體的制備:溶劑一熔融法稱取處方量的NGA與載體，將載體置80水浴中加熱，將NGA用適量無水乙醇溶解，待載體完全熔融時加入NGA溶液，同時劇烈攪拌，待混合物至黏稠狀態(tài)時，在冰浴中劇烈攪拌至完全固化，在冰箱中冷凍30min，然后置真空干燥箱中40干燥過夜，取出，粉碎，過80目篩備用18。5 溶出速率的測定5.1 檢測波長的確定 精密稱取NGA12.5mg，置25mL量瓶中，用少量無水乙醇

12、溶解，加025SLS溶液稀釋至刻度，然后精密量取適量，用025SLS溶液配制成濃度為50mgL溶液；分別配制濃度為300 mgL的PEG6000、PEG4000、F68和PVPK30的0.25SLS溶液，按照中國藥典2010年二部附錄A紫外一可見分光光度法在200400nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果NGA在結(jié)果在220nm和360nm均有最大吸收波峰, 而輔料在此無吸收,為了排除溶劑的干擾,選擇360nm為新藤黃酸的檢測波長。5.2 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液(0.2mg/ml)0.5, 1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 ml分別置于7個10ml棕色容量瓶中, 加甲醇溶解并

13、稀釋至刻度,混勻,0.45m微孔濾膜濾過依次進樣20l, 按上述色譜條件,以峰面積為縱坐標,質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸,得回歸方程為:A=52216c-12098(n=7),r=0.9999。5.3 回收率試驗 精密稱取NGF對照品12.0,15.0，0.18.0 mg各3份，置25mL量瓶中，按處方比例加人相應(yīng)的載體，用用少量無水乙醇溶解,加0.25SLS溶液稀釋至刻度，分別制成高、中、低3個濃度的溶液各3份，濾過，取續(xù)濾液1mL置10mL量瓶中，加0.25SLS溶液稀釋至刻度，搖勻，在360nm處測定吸光度，計算回收率19。表一 不同載體分散體3種濃度的回收率實驗結(jié)果載體 高濃度 中濃度

14、 低濃度PEG6000PEG4000F68PVPK305.4 溶出度實驗 將相當于NGA30 mg的固體分散體裝入膠囊，按照中國藥典2010年版二部轉(zhuǎn)籃法，以0.25SLS溶液900mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100r·min-1，溫度(37±0.5)oC，分別在15、30、45、60min取樣10mL,濾過,同時補加10mL同溫同體積溶出介質(zhì)，取續(xù)濾液于360 nm波長處測定吸光度。測定結(jié)果代入標準曲線計算濃度，并換算成累計溶出百分率。6.正交試驗設(shè)計 取新藤黃酸，按所選因素及水平( 表2 )，采用L9( 33 ) 正交表設(shè)計試驗( 表3) 進行新藤黃酸固體分散體的制備，得19

15、號產(chǎn)物，備用20。 表二 新藤黃酸固體分散體制備工藝因素水平水平 A 載體用量 B干燥時間 C 干燥溫度 / oC /g·g-1 /h-1 14150251.56036270表三 新藤黃酸固體分散體制備工藝正交設(shè)計及其結(jié)果No A B C 新藤黃酸2h累計融出率/%1 1 1 1 2 1 2 23 1 3 34 2 2 25 2 3 16 2 1 27 3 3 28 3 1 39 3 2 1K1K2K3R五 討論 新藤黃酸制成固體分散體后其溶出速率提高，可能是因為新藤黃酸分散到載體材料的分子中，在冷卻析出時，載體材料阻滯藥物分子聚集進而形成較小的晶粒，甚至轉(zhuǎn)變成無定型，使得藥物溶解度

16、增加。此外，高分子載體材料本身具有很好的親水性，易潤濕，也可加速藥物溶出。參看文獻：1 劉衛(wèi)海,賴小平,周興挺. 新藤黃酸的研究進展,J,時針國醫(yī)國藥，2010 21（9）：234749.2 劉衛(wèi)海,肖國麗,賴小平等。新藤黃酸誘導HepG2 細胞凋亡與Bax 及Bcl-2 的關(guān)系，J，中國藥理學通報，2012 28( 3) : 43940.3 朱國旗,王效山,李慶林等. 新藤黃酸體外抑制肺腺癌A549 細胞增殖的作用，J,安徽中醫(yī)學院學報，2011 30（1）：5356.4 陳葆仁.藤黃抗癌成分的研究,江西醫(yī)學學報，1980（2）1.5 Qinglin LI, HuiCheng,Guoqi Z

17、HU. Gambogenic Acid Inhibits Proliferation of A549 Cells through Apoptosis-Inducing and Cell Cycle Arresting,J, Biol. Pharm.Bull.33(3) 415420 (2010).6 周蘭貞，晏烽根，李慶林. 新藤黃酸誘導人結(jié)腸癌HCT116細胞凋亡的作用機制研究,J, 基礎(chǔ)研究·Basic Research,2011 7(31):580584.7 胡鐘，何黎琴，王效山. 新藤黃酸制備工藝優(yōu)化,J,廣州化工，2011 39（24）3637.8 胡容峰,朱金燕. 高效液

18、相色譜法測定新藤黃酸納米粒中新藤黃酸的含量和包封率,J,安徽中醫(yī)學院學報，2009 29（1）4951.9 胡海霞，王效山，彭代銀. 新藤黃酸包合物凍干粉針制備及工藝優(yōu)化,J, Chinese Traditional and Herbal Drugs,2012 43(1) 6569.10 Annette zur Muhlen, Cora Schwarz, Wolfgang Mehnert. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery Drug release and release mechanism ,J, European Journal of Pharmaceutic