大鼠心肌缺血再灌注損傷及中性粒細胞浸潤與一氧化氮心肌保護作用的研究

1、    大鼠心肌缺血再灌注損傷及中性粒細胞浸潤與一氧化氮心肌保護作用的研究作者：吳丹寧，賈國良，馬穎艷，李偉 作者單位：第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 心內(nèi)科， 陜西 西安 710032【摘要】 目的 中性粒細胞(Neu)心肌浸潤是心肌缺血-再灌注(I/R)損傷的重要機制之一。本實驗通過在SD大鼠中建立心肌I/R模型，研究I/R過程中心肌損傷與中性粒細胞浸潤的關(guān)系，并通過左型精氨酸(L-Arg)干預(yù)，探討一氧化氮(NO)對中性粒細胞浸潤的影響及其在心肌I/R損傷中的保護作用。方法 實驗分對照(CON)組、LArg處理組。每組又分缺血前、缺血40 min、再灌1 h

2、、再灌3h和再灌6 h 5個時間點，分別測定各組各時間點血清肌酸磷酸激酶(CPK)及心肌勻漿丙二醛(MDA)值，并觀察心肌組織病理學(xué)的改變。結(jié)果 (1)CPK及心肌勻漿MDA測定結(jié)果：再灌注后各時相血清CPK及肌勻漿MDA含量較缺血前明顯上升，再灌注3h后達到高峰。LArg組中再灌注后各時相點血清CPK及肌勻漿MDA明顯低于CON組(P<0.05)。(2)HE染色結(jié)果：缺血前心肌細胞完整，邊界清楚，心肌橫紋清晰。CON組：再灌后1h出現(xiàn)Neu心肌浸潤，再灌3 h Neu心肌浸潤更明顯， 累及心肌全層，伴有局灶心肌壞死;再灌6 h后Neu浸潤尤甚，大片心肌壞死，并可見小血管內(nèi)Neu聚集現(xiàn)象

3、。LArg組：再灌注后Neu心肌浸潤明顯減少，再灌6 h心肌壞死灶較CON組明顯縮小。結(jié)論 (1)心肌I/R過程中有大量Neu心肌浸潤，與心肌損傷密切。(2)LArg能抑制Neu心肌浸潤，具有心肌保護作用?！娟P(guān)鍵詞】 中性粒細胞; 缺血再灌注; 一氧化氮; 精氨酸; 心肌保護The Experimental Study on the Role of Neutrophil Infiltration and the Myocardial Protection of the Nitric Oxide During Ischemia Reperfusion in RatsWu Danning，Jia

4、Guoliang，Ma Yinyan，Li Wei(Department of Cardiology，the 117th Hospital.of PLA,Hangzhou 310013,China)Abstract： Objective The neutrophil infiltration is one of the reasons which lead to the myocardial ischemic reperfusion (I/R) injury. The study aimed at investigating the changes between myocardic inju

5、ry and neutrophil infiltration during I/R, and inquiring into the mechanisms of myocardial protection against I/R injury by intravenous infusion of Larginine(LArg) in ratty myocardial I/R model. Methods The rats were divided into 2 groups, including the Control and LArg infusion group, each with pre

6、-ischemia , postischemia 40mins, reperfusion for 1h ,3 hrs and 6hrs subunits. The changes of serum CPK、myocardial MDA、 histopathology were examined .Results Result were showed that the levels of serum CPK and myocardial MDA increased after reperfusion, and reached the highest at 3hrs followed reperf

7、usion, the content in the LArg groups were significantly lower(P<0.05 Vs CON) and that histopathologically the myocardial neutrophil infiltration appeared at 1h followed reperfusion, and increased with the continue of the reperfusion , accompanied by the myocyte necrosis in the control group. Wit

8、h the LArg infusion intraveneously following ischemia, decrease of neutrophil infiltration and myocyte necrosis were showed in rats .Conclusion (1)The myocardial neutrophil infiltration indicates neutrophials participate in impairing the myocardium during I/R; (2)The LArg prevents the neutrophils fr

9、om myocardial infiltration ,and ameliorate the ischemic-reperfusion injury.Key words： neutrophill ; ischemia reperfusion; nitric oxide; Largnine; myocardium protection隨著靜脈溶栓及經(jīng)皮腔內(nèi)球囊成形術(shù)治療急性心肌梗死的開展，缺血再灌注損傷的研究受到廣泛重視。心肌缺血再灌注損傷是一種復(fù)雜的病理生理變化，其包括再灌注心律失常、心肌暈厥、再灌注心肌死亡及無復(fù)流現(xiàn)象等，中性粒細胞(Neu)心肌浸潤與此密切相關(guān)。一氧化氮(NO)具有舒張血管

10、、調(diào)節(jié)血壓、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)細胞增殖、保護內(nèi)皮細胞等多種功能;病理狀態(tài)下，NO還與多種心血管疾病的病理損傷及修復(fù)有關(guān)。本研究旨在在SD大鼠中建立缺血-再灌注(I/R)模型，通過心肌病理學(xué)檢查、血清CPK及肌勻漿丙二醛(MDA)測定分析，以及左型精氨酸(L-Arg)干預(yù)作用，探討I/R過程中心肌損傷與Neu心肌浸潤的關(guān)系，及NO對Neu心肌浸潤的作用。1 材料與方法11 動物模型的建立(1) 動物： 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。(2) 模型制備：以4%戍巴比妥鈉(40 mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉成功后，行氣管切開術(shù)，接人工呼吸機(頻率60次/min

11、， 潮氣量30 ml)。分離頸淺靜脈及頸總動脈，分別行動、靜脈插管術(shù)。靜脈插管接微泵注射器，注射生理鹽水2 ml/h。動脈插管接八導(dǎo)生理儀之載波放大器及血壓表，記錄大鼠動脈壓(收縮壓SBP，舒張壓DBP及平均壓MBP)。心電圖導(dǎo)聯(lián)線與大鼠四肢相連接入心電圖放大器，記錄標準導(dǎo)聯(lián)心電圖。于大鼠胸骨左緣24肋處，逐層打開皮膚、肌肉及肋骨，暴露心臟，分離心包膜，用眼科小圓針在前降支起始后0.20.3 cm處穿一結(jié)扎線，再將結(jié)扎線兩頭穿過23 cm的塑料管備用。手術(shù)完成后穩(wěn)定10 min。(3)進行缺血-再灌注模型的建立：將一小塑料管順結(jié)扎線滑行，收緊結(jié)扎線，以止血鉗夾緊塑料管固定，造成缺血。放松止血鉗

12、，取出小塑料管，形成再灌注。缺血時，心肌局部變暗，活動減弱，動脈平均血壓下降(>10 mmHg)，心電圖STT呈明顯上抬或單向曲線。再灌注時，心肌局部搏動恢復(fù)，即刻動脈平均壓恢復(fù)至缺血前，心電圖STT段回落1/2以上。12 實驗方案動物分組：50只大鼠隨機分為對照組、LArg干預(yù)組。每組隨機又分為缺血前、缺血40 min后、再灌注1 h、再灌注3 h及再灌注6 h 5個時相點。每組25只大鼠，每個時相點5只。對照組：即模型組。建立缺血-再灌注模型，實驗過程中用生理鹽水靜脈維持。于各不同時間點于右心房抽取靜脈血;用10%氯化鉀靜脈內(nèi)注射處死動物，取出心臟后，分別留取缺血區(qū)及非缺血區(qū)心肌組織

13、。 LArg干預(yù)組：于缺血后即給予LArg(40 mg/kg)靜脈一次性注射，以后用生理鹽水維持(2 ml/h)。處死動物及留取標本同對照組。13 觀察指標131 心肌酶測定抽取右房血2 ml，放置40 min后，以1 000 r/min離心510 min，留取血清，封口，置-80低溫冰箱凍存，集中送檢。用酶動力學(xué)法，在日立7150全自動生化分析儀上測定(試劑盒CPKNAC系澳大利亞TRACE公司產(chǎn)品)，單位IU/L。132 心肌MDA測定測定試劑盒由暨南大學(xué)病理生理教研室提供，并依照其提供的方法進行測定。取缺血-再灌注區(qū)的心肌組織試紙吸除水分稱重后，置于研磨器內(nèi)，每克組織加生理鹽水4 ml，

14、研磨成心肌組織勻漿，然后以3 000 r/min的速度離心15 min，吸取上清液置管封存冷凍。測定方法按試劑盒說明進行，MDA的單位：nmol/g(每克濕質(zhì)量組織MDA的含量)。133 心肌冰凍切片的制備在保溫瓶中預(yù)先裝滿液氮，然后將盛有異戍烷(進口分裝)的燒杯放入液氮中，用長鑷不斷攪動，直至異戍烷出現(xiàn)一層白膜(此時溫度達-155-160)，迅速將新鮮心肌組織標本投入異戍烷，不停攪動2030 s后，取出后用OCT包埋劑包埋，置-20恒溫冰凍箱切片機進行切片，切片厚度為5m。切片后迅速用95%的乙醇固定1015 min，置-20的冰箱中保存?zhèn)溆谩?34 HE染色置心肌切片標本于蘇木精染液中34

15、 min浸染，取出洗滌后置于伊紅染液中12 min，洗滌后依次于80%，90%，95%，100%的乙醇中脫水后35 min，二甲苯中透明3 min。用中性樹膠封片，備檢。14 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用第四軍醫(yī)大學(xué)統(tǒng)計學(xué)教研室提供的SPLM統(tǒng)計軟件包。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組均數(shù)間比較用t檢驗, 多組均數(shù)間用方差分析。P<0.05為相差顯著，P<0.01為相差非常顯著。2 結(jié)果2.1 心肌CPK變化再灌注后各時相點血清CPK較缺血前均有不同的增高, 再灌注3 h達高峰。L Arg組再灌注后各時相點血清CPK分別低于CON組(P<0.05)。(表1)表1

16、 大鼠心肌缺血再灌注血清中CPK改變(略)22 心肌勻漿MDA變化再灌注后各時相點心肌勻漿MDA的含量均有不同程度的上升, 再灌注3 h為高峰。LArg組再灌注后各時相點心肌勻漿MDA分別低于CON組(P<0.05) 。(表2)表2 大鼠心肌缺血-再灌注心肌勻漿中MDA變化(略)23 病理H-E染色病理檢查結(jié)果: 缺血前正常心肌組織中心肌纖維排列整齊， 細胞邊界完整，心肌橫紋清晰。再灌注后1 h,，心肌中出現(xiàn)Neu浸潤，位于心內(nèi)膜下，心肌組織中未見明顯壞死灶。再灌注后3 h，Neu浸潤明顯，心內(nèi)膜、心肌層及心外膜均可見，心肌橫紋消失，出現(xiàn)局灶性心肌壞死;再灌注6 h后，大量心肌細胞壞死伴

17、Neu浸潤，以心外膜明顯，并可見小血管有大量Neu聚集。LArg干預(yù)組：大鼠心肌組織再灌注后1 h無明顯Neu心肌浸潤，再灌注6 h僅少量Neu心肌浸潤，心肌壞死灶也明顯減少。3 討論本實驗結(jié)果顯示：I/R過程中，隨著Neu心肌浸潤的加重，血清中CPK及心肌勻漿中MDA也明顯升高，心肌組織中形成的壞死灶也明顯增加。Larg干預(yù)后，Neu心肌浸潤明顯減輕，血清中CPK及心肌勻漿中MDA也明顯降低(P<0.05)，病理心肌壞死也明顯減少。心肌I/R過程中有大量Neu心肌浸潤，與心肌損傷密切;LArg能抑制Neu心肌浸潤，具有心肌保護作用。國外也有類似報道1。 目前認為I/R損傷與心肌內(nèi)氧自由

18、基大量產(chǎn)生、Neu浸潤及心肌細胞內(nèi)鈣離子超載有關(guān)，其中Neu心肌浸潤具有重要作用。Neu不僅能產(chǎn)生大量氧自由基，氧化胞膜及各種蛋白質(zhì);還能釋放各種炎性介質(zhì)及溶酶體酶等有害物質(zhì)直接損傷細胞。另外,微血管中有大量的Nue浸潤可堵塞血管，產(chǎn)生再灌注的 “無復(fù)流”現(xiàn)象，加重了I/R損傷。 因此Neu心肌浸潤在I/R損傷具有重要的病理意義，阻斷Neu的心肌浸潤有助于減輕I/R損傷。LArg為一氧化氮合酶(NOS)的底物，血管內(nèi)皮細胞中 LArg和O2在NOS的催化下，由多種輔助因子傳遞電子，生成NO和瓜氨酸3。NO具有舒張血管、調(diào)節(jié)血壓;抑制血小板聚集、防止血栓;保護細胞及調(diào)節(jié)細胞增殖的功能4,5。NO

19、還具有抑制氧自由基產(chǎn)生的作用6。缺血再灌注損傷會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)源性NO生成減少7。用LArg進行干預(yù)后，增加了NO合成的底物，促進了內(nèi)皮合成內(nèi)源性NO，同時抑制內(nèi)皮各種炎性因子的產(chǎn)生及氧自由基的合成，減少其對內(nèi)皮的損傷8;近年來研究發(fā)現(xiàn)Neu浸潤心肌與細胞間粘附分子ICAM1與CD11/CD18密切相關(guān) 9。LArg 干預(yù)后可能抑制了內(nèi)皮細胞及Neu 的粘附分子的表達，從而減少了Neu的心肌浸潤10，發(fā)揮其心肌保護作用?！緟⒖嘉墨I】1Sato H,Zhao Z Q,Jordan J E,et al.Basal nitric oxide exprsses endogenous cardio

20、protection during reperfution by inhibition of neutroopi 1mediated damage after surgical revascularizationJ.J Throac Cardiovasc Surg,1997,113:399.2 Ambrioso G, Chiariello M. Myocardial reperfusion injury :mechanism and management: a reviewJ. Am J Med,1991,91(supply 3c)：86S.3 Bredt D S, Ferris C D, s

21、nyder S H. Nitric oxide synthase regulatory sitesJ. J Biol Chem,1992,267:10976.4 Vallance P, Collier J, Moncada S. Effects of endothelium drived nitric oxide on peripheral arterior tone in manJ. Lancet,1989,2:997.5 Grarg U C, Hassid A: Nitric oxide generating vasodilators and 8-bromo-cyclic GMP inhi

22、bit mitogenesis and proliferation of culture rat vascular smooth muscle cellsJ. FASEBJ,1991,5:A1608.6 Rubanyi G M, Ho E H, Cantor EH, et al. Cytoprotective function of nitric oxide: inactivation of superoxide radicals produced by human leukocytesJ. Biochem Biophys Res Communi,1991,181:1392.7 Lefer A M. Attenuation of myocardial ischemia-reperfusion injury