人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及凍存、復(fù)蘇

1、人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及凍存、復(fù)蘇南通大學(xué)(醫(yī)學(xué)版)?413?JournalofNantongUniversity(MedicalScien!)Q!(魚人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離,培養(yǎng),鑒定及凍存,復(fù)蘇楊曉清,張沐,楊兵,張華,張玉泉f?南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,z南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院I臨床071班,南通226001,江蘇省干細(xì)胞庫)【摘要】目的:探討從人臍帶華通氏膠(Whaaon'Sjelly,WJ)中分離,培養(yǎng),鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemce11s,MSCs)及其凍存,復(fù)蘇的方法.方法:采用植塊法分離,培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3代

2、細(xì)胞免疫表型,鑒定其向成骨,成脂方向誘導(dǎo)分化的能力;將Pl細(xì)胞凍存6個(gè)月后復(fù)蘇,鑒定復(fù)蘇后細(xì)胞的特性.結(jié)果:植塊法容易從人臍帶華通氏膠中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞;組織塊貼壁后6d可見組織塊周圍細(xì)胞爬出,原代培養(yǎng)14-18d細(xì)胞融合70%-80%:P3代細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)CD73,CD90,CD105,不表達(dá)CD14,CD34,CD45,CD79a和HLADR;成骨誘導(dǎo)分化后10d,可見明顯鈣結(jié)節(jié);成脂誘導(dǎo)14d,有明顯的脂滴出現(xiàn),油紅O染色陽性.凍存再復(fù)蘇細(xì)胞活力達(dá)80%,細(xì)胞免疫表型及成骨,成脂誘導(dǎo)顯示與凍存前細(xì)胞呈相同的特性.結(jié)論:組織塊培養(yǎng)法可從人臍帶華通氏膠中分離,培養(yǎng)出純度較高間充質(zhì)干細(xì)胞,凍存,

3、復(fù)蘇不改變其特性.關(guān)鍵詞人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;華通氏膠;細(xì)胞培養(yǎng);誘導(dǎo)分化;凍存中圖分類號(hào)】R394.2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼A文章編號(hào)1674-7887(2010)06041304Isolation,culture,identification,frozennessandthawofmesenchymalstemcellsfromWharton'sjellyofhumanumbilicalcordYANGXiaoqing,ZHANGMu,YANGBin,ZHANGHua3,ZHANGYuquan(DepartmentofGynaecologyandObstetrics,AffiliatedHos

4、pitalofNantongUniversity;DepartmentofClinicalMedical,Class071,MedicalCollegeofNantongUniversity,Nantong226001;DepartmentofStemCellBank,JiangsuProvince)Abstract】Objective:Toexploretheapproachofisolating,culturing,identifing,frozeningandthawingMSCsfromWhartonSjellyofhumanumbilicalcord.Methods:Humanumb

5、ilicalcordmesenchymalstemcells(hUCMSCs)wereseparatedbycultureoftissueadherence.Thesurfaceofpassage3cellsurfaceantigenwasmeasuredbyflowcytometry.Theosteogenicandadipogenicdifferentiationwastestedandevaluatedbyspecificstainingmethods.Passage1cells,frozen6months,werethawed,thentheirbiologicalcharacteri

6、stiswereidentified.Results:MSCswereeasilyobtainedfromWharton'Sjetlyofhumanumbilicalcordviatheproposedapproachoftissueadherence.After6daysofincubation,cellswerepresented.Theprimacellsgrewupto70%-80%confluenceafter14-18daysofculture.FlowcytometryanalysisrevealedthatCD73,CD90andCD105werehighlyexpre

7、ssedonthesurfaceofpassages3cells,buttheexpressionwasnegativeforCD14,CD34,CD45,CD79aandHLADR.Thesecellsshowedcalciumnodeaftercultureinductionofosteogenicdifferentiation10dayslater.Furthermore,liquidvacuolesweredetectedbyoilredOstainingaftercultureinductionofadipogenicdifferentiation14dayslater.Theliv

8、ingcellsofhUCMSCswere80%afterhavingbeenfrozenandthethawedcellshadthesamecharacteristisasprivious.Conclusion:Cellsfromthehumanumbilicalcordshavebeenisolatedbytissueculturemethod,whichhavethebiologicalcharacteristicsofMSCs.Keywords】humanumbilicalcordmesenchymalstemcell;Wharton'Sje11y;cellculture;d

9、ifferentiation;cryopreservation間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymolstemcells,MSCs)是來源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的多能干細(xì)胞,具有顯著的自我更新和多向分化能力.目前MSCs的主要來源為成人骨髓及臍血,但成人骨髓源MSCs數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降1,病毒感染率較高,且供者M(jìn)SCs的采集因需行骨髓穿刺術(shù)而受限.臍血MSCs的分離會(huì)損失臍血中造血干細(xì)胞.近年研究顯示,人臍帶中也存在大量MSCs;臍帶來源MSCs具有來源廣泛,取材方便,相對(duì)純凈,含量豐富及免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),正逐漸成為MSCs研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一.人臍帶MSCs的來源有4種,其中華

10、通氏膠(WJ)來源的MSCs含量豐富但對(duì)其分離培養(yǎng)的研究相對(duì)較少,本文就探討從人臍帶華通氏膠中分離出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞fumbilicalcordmes.enchymalstemcells,UCMSCs)并進(jìn)行體外培養(yǎng),鑒定及定向分化,為MSCs的應(yīng)用提供更廣泛的來源.【基金項(xiàng)目2010年南通大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助(YKC10051)【作者簡(jiǎn)介楊曉清,女,漢族,生于1978年8月,江蘇省南通市人,在讀研究生,研究方向:生育調(diào)節(jié).通信作者張玉泉,電話Emaihjsnt_zhangyuquan?414?南通大學(xué)(醫(yī)學(xué)版)1材料和方法1.1材料正常足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶f泰州人

11、民醫(yī)院);DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司);胎牛血清(ExCellBiology,Inc);TryPle酶,成脂,成骨誘導(dǎo)試劑盒(Invitrogen公司);二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)(Sigma公司);CD14一FITC,CD45一FITC,CD79a_APC,CD90一APCCD34一PECD73一PECD105一PEHLADRPE(BD公司);倒置相差顯微鏡(Olympus公司);流式細(xì)胞儀(BectonDickinson公司);培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)皿,離心管(Coming公司).1.2方法1.2.1臍帶華通氏膠MSCs的分離與培養(yǎng)取正常足月產(chǎn)健康新生

12、兒臍帶10on,兩端絲線結(jié)扎,浸泡于含DMEM保存瓶中.超凈臺(tái)內(nèi)取出臍帶.75%乙醇消毒臍帶表面23min,剪開兩端結(jié)扎絲線.生理鹽水充分洗滌殘留的血液,將臍帶剪成2cm小段,再次漂洗,剖開臍帶,剔除臍靜脈,臍動(dòng)脈,剝離華通氏膠(圖l3).將華通氏膠剪成1mmxlmmxlmm大小,接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),放入37,5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng).倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況._圖l剪成2cm臍圖2剔除臍靜脈圖3剝離的華通帶小段及臍動(dòng)脈氏膠1.2.2臍帶華通氏膠MSCs表型的測(cè)定用流式細(xì)胞儀對(duì)P3代UCMSCs表面特異性抗原進(jìn)行檢測(cè).Tryple酶消化待檢細(xì)胞,PBS洗滌3次,制成lx

13、l06/ml的細(xì)胞懸液.將待檢細(xì)胞樣品分為每管0.1ml,加人CD14一FITC,CD45一FITC,CD79aAPC,CD90一APC,CD34一PE,CD73一PE,CD105一PE,HLADRPE抗,4孵育30min,流式細(xì)胞儀測(cè)定各類抗原的陽性率.1.2I3臍帶華通氏膠MSCs誘導(dǎo)分化向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化:將P3代細(xì)胞消化后,調(diào)整細(xì)胞密度為l×1o5/ml,接種于24孔板內(nèi),12d后細(xì)胞融合達(dá)70%80%,此時(shí)以成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng),每3天全量換液1次,第10天茜素紅染色;向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化:培養(yǎng)液改為成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液,其余同前,第14天油紅0染色.1.2.4臍帶華通氏膠

14、MSCs的凍存,復(fù)蘇將P1代MSCs消化后以1xl06/ml密度凍存,凍存液DMSO:FBS:DMEM為1:l:8,將凍存細(xì)胞放入4預(yù)冷的程序冷凍盒內(nèi),直接將程序冷凍盒放入一8OcC冰箱,第2天放人一196oC液氮保存.凍存6個(gè)月后將程序冷凍盒從一80冰箱取出,細(xì)胞直接放人37clC預(yù)熱的水浴鍋內(nèi),用4預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2遍,將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),放人37oC,5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細(xì)胞傳代至P3代時(shí),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14,CD45,CD79a,CD90,CD34,CD73,CD105,HLADR.并進(jìn)行成骨細(xì)胞,成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化,方法同前.2結(jié)果2.1臍帶華

15、通氏膠MSCs的分離與培養(yǎng)成功從臍帶分離出WJ,植塊培養(yǎng).用倒置顯微鏡觀察.12d見組織塊部分貼壁,6d左右組織塊周圍有細(xì)胞爬出(圖4),10d左右細(xì)胞已有成片聚集,聚集處呈火山噴發(fā)狀.細(xì)胞多為雙突起的長(zhǎng)梭形,短棒狀或扁平形的成纖維樣細(xì)胞,核仁明顯.l418d時(shí),細(xì)胞融合達(dá)70%80%,此時(shí)消化,傳代,去除組織塊,傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯增強(qiáng),至P2代以后,隔天細(xì)胞即需傳代.細(xì)胞密度較低時(shí)成扁平單層細(xì)胞,細(xì)胞密度較高時(shí)趨于融合,細(xì)胞變細(xì)長(zhǎng).類似成纖維細(xì)胞,呈平行或旋渦狀生長(zhǎng)(圖5).圖4組織塊周邊細(xì)胞游出圖5臍帶華通氏膠MSCs細(xì)(40x)胞形態(tài)(40x)2.2臍帶華通氏膠MSCs的表面標(biāo)志的測(cè)

16、定流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCsP3代細(xì)胞,CD73,CD90,CD105呈陽性表達(dá),CD14,CD34,CD45,CD79a和HLADR陰性表達(dá)(圖6,7).IjIT.P呦ITitIT-II,TImll罨1器'.=l:器tI1.r1l:籀"10sI.:-BPI'露器=:I圖6MSCs表面抗原分子CD73,CD90,CD105呈陽性表達(dá)2-3臍帶華通氏膠MSCs成骨,成脂誘導(dǎo)分化的形楊曉清,等.人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離,培養(yǎng),鑒定及凍存,復(fù)蘇?415?jLlm$311-CD14Tm.Pm_lTFm3-45ll.PcmmIllnmtlnl?-lP啊ITll帥湘?-|er

17、tTIlP¨RE_?啦'P?f_ra鍶O.2''鼉':譽(yù)93.8'fI蟋e,o?ee937'聰ll_j罨'圖7MSCs表面抗原分子CD14,CD34,CD45,CD79a,HLADR呈陰性表達(dá)態(tài)變化經(jīng)成骨誘導(dǎo)45d即可見孔板底物白色鈣本文采用植塊法,分離培養(yǎng)臍帶WJ中的質(zhì)沉積;10d后茜素紅染色可見明顯鈣結(jié)節(jié)(圖8,9,MSCs,組織塊大小lmmx1ram1mm,6d左右可見見封-).經(jīng)成脂誘導(dǎo)第7天,鏡下見折光性很強(qiáng)的細(xì)胞從組織塊邊緣游出,1418d細(xì)胞可鋪滿瓶底液滴,隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),空泡增多;誘導(dǎo)第14天油的70%80%,

18、此時(shí)傳代自然沉淀片刻,去除組織塊.紅0染色,高倍鏡下可見胞漿中有大量被染成紅色傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,P2代后隔天即可傳1代.流的液滴f圖10,l1,見封二).式細(xì)胞儀鑒定該種細(xì)胞具有MSCs特性,且純度高.2.4臍帶華通氏膠MSCs凍存及復(fù)蘇凍存6個(gè)月成骨誘導(dǎo)分化45d可見白色骨質(zhì)沉積,10d后成再復(fù)蘇.細(xì)胞活力大約為80%.復(fù)蘇后的MSCs細(xì)胞骨染色強(qiáng)陽性;成脂誘導(dǎo)7d可見脂滴,14d成脂染傳至P3代其表面表型的測(cè)定及成骨,成脂誘導(dǎo)結(jié)果色強(qiáng)陽性.說明此方法分離的MSCs具有多向分化與未凍存的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞類似.潛能.將P1代細(xì)胞在一8OcC凍存后放人液氮中,6個(gè)3討論正常足月新生兒的臍帶是

19、連于新生兒臍部與胎盤問的索狀結(jié)構(gòu),外被羊膜,內(nèi)含分化的黏液性結(jié)締組織和兩條臍動(dòng)脈和一條臍靜脈.臍血管周圍被黏蛋白樣組織所包裹,后者被稱為臍帶膠質(zhì),或華通氏膠,它富含透明質(zhì)酸,形成了成纖維細(xì)胞周圍的水凝膠結(jié)構(gòu)【】.臍帶中富含造血,問充質(zhì),神經(jīng)及內(nèi)皮等多種干/祖細(xì)胞4-7.1991年McElreavey等181首次報(bào)道.從人臍帶的WJ中分離并培養(yǎng)到了一種成纖維樣細(xì)胞,具有較高的分化潛能,可向多個(gè)方向進(jìn)行分化.后陸續(xù)有報(bào)道通過植塊法或酶消化法在WJ中可獲得MSCsI5-6,91,使臍帶有望成為骨髓MSCs的理想替代來源.人臍帶WJ中MSCs的分離與培養(yǎng).目前使用的方法主要有酶消化法和植塊法.酶消化法

20、具有快速分離出MSCs的優(yōu)勢(shì),但是酶體系可能會(huì)降解細(xì)胞外膜,甚至對(duì)細(xì)胞造成損害,細(xì)胞將無法貼壁.徐燕等l31通過比較上述2種方法獲貼壁細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征,細(xì)胞產(chǎn)率等認(rèn)為.植塊法可簡(jiǎn)便,高效的分離出一群具有高增殖活性及多向分化潛能的MSCs.細(xì)胞產(chǎn)率高,傳代后細(xì)胞形態(tài)及增殖活性穩(wěn)定.蔣潔等研究認(rèn)為,植塊法易從人臍帶WJ膠中獲得成纖維樣細(xì)胞,這種細(xì)胞從形態(tài)結(jié)構(gòu),表面抗原標(biāo)志及誘導(dǎo)分化能力等方面都表現(xiàn)為MSCs特性.月后復(fù)蘇.細(xì)胞活力達(dá)到80%左右,流式細(xì)胞儀鑒定及誘導(dǎo)分化提示MSCs特性未受影響.在MSCs分離,培養(yǎng),鑒定及凍存復(fù)蘇過程中有如下體會(huì):盡量在臍帶采集24h內(nèi)進(jìn)行分離剝膠;盡量不用雙抗進(jìn)

21、行培養(yǎng),以免對(duì)細(xì)胞活力等影響;可在結(jié)扎線剪去之前在超凈臺(tái)內(nèi)用75%乙醇消毒臍帶表面12min,再用生理鹽水漂洗干凈后去除結(jié)扎線:同時(shí)將保存液送微生物檢測(cè)以確定是否有潛在污染;將臍帶剪成2cm左右的小段有利于剝膠操作,并將表面及動(dòng)靜脈血管內(nèi)的血液充分漂洗干凈,防止臍血細(xì)胞的影響;臍靜脈剪開,內(nèi)膜要剔除干凈,防止靜脈內(nèi)皮下干細(xì)胞混雜;完整剔除臍動(dòng)脈;剝膠時(shí)不能撕破外層的羊膜層,以免影響WJ中MSCs的純度;分離的WJ要充分剪碎,培養(yǎng)時(shí)平鋪均勻,放置培養(yǎng)箱后盡量減少翻動(dòng).凍存時(shí)用含10%DMS0,10%胎牛血清的凍存液.細(xì)胞1xl0/ml放入凍存管后,放人4預(yù)冷的程序冷凍盒后可直接放人一80冰箱,第

22、2天放人一196液氮保存;復(fù)蘇時(shí)使細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)復(fù)溫,有利于保存細(xì)胞活力.【參考文獻(xiàn)】11RaoMS,MattsonMP.Stemceilsandaging:expandingthepossibilitiesJ.MechAgeingDev,2001,122(7):713734.【2】TrevisanutoD,DoglioniN,ZanardoV,eta1.OvercoilingoftheumbilicalcordJ.JPediatr,2007,150(1):112-112.3PengHQ,LevitinSmithM,(下轉(zhuǎn)第419頁)吳瑋.等.外周血NFKB基因表達(dá)水平對(duì)肝癌診斷的臨床價(jià)值研

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