多糖的提取分離方法

1、1.多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、 植物多糖、 動(dòng)物多糖 3 大類。 多糖的提取首先要根據(jù) 多糖的存在形式及提取部位，決定在提取之前是否做預(yù)處理。 動(dòng)物多糖和微生物多糖多有 脂質(zhì)包圍， 一般需要先加入丙酮、 乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液進(jìn)行回流脫脂， 釋放多糖。 植物多糖提取時(shí)需注意一些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類，在提取前，應(yīng)先用低 極性的有機(jī)溶劑對(duì)原料進(jìn)行脫脂預(yù)處理， 目前多糖的提取方法主要有溶劑提取法、 生物提取 法、強(qiáng)化提取法等。11 溶劑法11 1 水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法。 多糖是極性大分子化合物，提取時(shí)應(yīng)選擇 水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。 用

2、水作溶劑來提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水 浸提滲濾，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置5h，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率均較高。 影響多糖提取率的因素有：水的用量、提取溫度、浸提固液比、提取時(shí)間 以及提取次數(shù)等。水提醇沉法提取多糖不需特殊設(shè)備， 生產(chǎn)工藝成本低，安全， 適合工業(yè)化大生產(chǎn)， 是一 種可取的提取方法。 但由于水的極性大， 容易把蛋白質(zhì)、 苷類等水溶性的成分浸提出來，從 而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì)， 為后續(xù)的分離帶來困難， 且該法提取比較耗時(shí)， 提取率也不高。 112 酸提法為了提高

3、多糖的提取率，在水提醇沉法的基礎(chǔ)上發(fā)展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團(tuán)的多糖在較低 pH 值下難以溶解，可用乙酸或鹽酸使提取液成酸性，再加乙 醇使多糖沉淀析出，也可加入銅鹽等生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀而析出。由于H+的存在抑制了酸性雜質(zhì)的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖產(chǎn)品純度相對(duì)較 高，但在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，且酸會(huì)對(duì)容器造成腐蝕，除弱酸外，一 般不宜采用。 因此酸提法也存在一定的不足之處。113 堿提法 多糖在堿性溶液中穩(wěn)定， 堿有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，縮短提取時(shí)間，但提取液中含有其它雜質(zhì)，使粘度過大，過濾困難，且浸提液有較濃的堿味，溶液顏色 呈黃色

4、，這樣會(huì)影響成品的風(fēng)味和色澤。114 超臨界流體萃取法 超臨界流體萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的提取分離技術(shù)。超臨界流體是指物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力以上時(shí)的狀態(tài)， 這種流體兼有液體和氣體的特點(diǎn)， 密度 大，粘稠度小，有極高的溶解，滲透到提取材料的基質(zhì)中，發(fā)揮非常有效的萃取功能。而且這種溶解能力隨著壓力的升高而增大， 提取結(jié)束后， 再通過減壓將其釋放出來， 具有保持 有效成分的活性和無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。由于C02的超臨界條件(TC= 304 .6 C, Tp= 7.38MPa)容易達(dá)到，常用于超臨界萃取的溶劑，在壓力為840 MPa時(shí)的超臨界CO2足以溶解任何非極性、中極性化合物,在加入改性

5、劑后則可溶解極性化物。該法的缺點(diǎn)是設(shè)備復(fù)雜,運(yùn)行成本高,提取范圍有限。1 2 酶解法1 2 1 單一酶解法 單一酶解法指的是使用一種酶來提取多糖,從而提高提取率的生物技術(shù)。其中經(jīng)常使用的酶有蛋白酶、纖維素酶等。 蛋白酶對(duì)植物細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)具有分解作用,使其結(jié) 構(gòu)變得松散； 蛋白酶還會(huì)使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解, 降低它們對(duì)原料的結(jié)合力，有利于多糖的浸出。122 復(fù)合酶解法復(fù)合酶解法采用一定比例的果膠酶、 纖維素酶及中性蛋白酶， 主要利用纖維素酶和果膠 酶水解纖維素和果膠， 使植物組織細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，釋放細(xì)胞壁內(nèi)的活性多糖， 多糖釋放 pH 值有直接的關(guān)系。酶解法提取的實(shí)質(zhì)是通過

6、酶解反應(yīng)強(qiáng)化傳質(zhì)過程。此法具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得的多少和復(fù)合酶的加入量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解 率高等優(yōu)點(diǎn)。13 物理強(qiáng)化法131 微波輔助提取法 微波萃取是高頻電磁波穿透萃取媒質(zhì)， 到達(dá)被萃取物料的內(nèi)部， 能迅速轉(zhuǎn)化為熱能使細(xì)胞內(nèi)部溫度快速上升，細(xì)胞內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁承受力，細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分流出， 在較低的溫度下溶解于萃取媒質(zhì)，通過進(jìn)一步過濾和分離，獲得萃取物料。微波輔助提取多糖和其他的萃取方法比較， 微波萃取效率高， 操作簡(jiǎn)單， 且不會(huì)引入雜 質(zhì)，多糖純度高，能耗小，操作費(fèi)用低，符合環(huán)境保護(hù)要求，是很好的多糖提取方法。132 超聲波輔助提取法 超聲波提取是利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)

7、、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)。 機(jī)械效應(yīng)可增大介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速度及穿透力，能有效的破碎生物細(xì)胞和組織，從而使提取的有效成分溶解于溶劑之中； 空化效應(yīng)使整個(gè)生物體破裂， 整個(gè)破裂過程在瞬間完成， 有利于有效成分的溶出； 熱效應(yīng)增 大了有效成分的溶解速度， 這種熱效應(yīng)是瞬間的， 可使被提取成分的生物活性盡量保持不變； 此外，許多次級(jí)效應(yīng)也能促進(jìn)提取材料中有效成分的溶解，提高了提取率。超聲波提取與水煮法醇沉法相比，萃取充分，提取時(shí)間短；與浸泡法相比，提取率高。133 高壓脈沖法高壓脈沖法是對(duì)兩電極間的流態(tài)物料反復(fù)施加高電壓的短脈沖（典型為2080 kV/cm）進(jìn)行處理，作用機(jī)理有多種假說，如細(xì)胞膜穿孔效應(yīng)、電磁機(jī)

8、制模型、粘彈極性形成模型、 電解產(chǎn)物效應(yīng)、臭氧效應(yīng)等，研究最多的是細(xì)胞膜穿孔效應(yīng)。動(dòng)物、植物、微生物的細(xì)胞，在外加電場(chǎng)作用下， 產(chǎn)生橫跨膜電位， 絕緣的生物膜由于電場(chǎng)形成了微孔， 通透性發(fā)生變化， 當(dāng)整個(gè)膜電位達(dá)到極限值（約為1 V）時(shí)，膜破裂，膜結(jié)構(gòu)變成無序狀態(tài)，形成細(xì)孔，滲透能力增強(qiáng)。 電位差達(dá)到臨界點(diǎn)，細(xì)胞破裂。2.多糖的分離純化21 除蛋白2 1 1Sevage 法根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，用V （氯仿）：V （戊醇或正丁醇）為5 :1或4 ： 1,混合物劇烈振搖 2030 min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶 劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。 此種只能除去少量蛋白

9、質(zhì)，效率不高，須反復(fù)多次，多糖有損 失。 但此方法比較溫和,在避免多糖降解上效果較好,如配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶,用 Sevage 法效果更佳。 此法不能除去脂蛋白,因?yàn)橹鞍兹苡诼确隆?1 2 三氟三氯乙烷法將多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合,低溫?cái)嚢?10 min 左右,離心分離得上層 水層,水層繼續(xù)用上述方法反復(fù)處理幾次,得無蛋白質(zhì)的多糖溶液,此法效率較Seavg 法高,但溶劑沸點(diǎn)低,易揮發(fā),不宜大量應(yīng)用。21 3 三氯乙酸法三氯乙酸是一種有機(jī)酸,使多糖提取液中的蛋白質(zhì)與有機(jī)酸作用而變性沉淀。該法是在多糖水提液中滴加 5 %10 %與多糖水提取液等體積的三氯乙酸,混勻靜置過夜, 離心除

10、去膠狀沉淀，重復(fù)以上的操作直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，得無蛋白質(zhì)的多糖。 三氯乙酸 濃度越大， 除蛋白質(zhì)效果越好， 但對(duì)多糖的影響也越大， 可能是三氯乙酸對(duì)多糖結(jié)構(gòu)具有破 壞作用，使多糖降解，而且這種破壞作用隨著三氯乙酸濃度增大而增強(qiáng)。植物多糖常采用三氯乙酸法除蛋白質(zhì)， 也可先用蛋白水解酶， 使樣品中的蛋白質(zhì)部分降 解后再用 Sevag 法效果更好；微生物多糖去除蛋白常采用 Sevag 法、三氟三氯乙烷法；也 可用鹽析法、有機(jī)溶劑萃取等方法除蛋白。22 多糖的分離主要有分級(jí)沉淀、 季銨鹽沉淀法、 金屬鹽沉淀法、 色譜分離、 膜分離、 透析、 電滲析等， 目前大多采用 DEA1凝膠或其他各種不同類

11、型的凝膠柱層析以及離子交換色譜法。22 1 分級(jí)沉淀法大多數(shù)活性多糖可溶于水， 3 個(gè)碳以下的多糖還可溶于乙醇，隨著聚合度的增大，多糖 在乙醇中的溶解度逐漸降低。 根據(jù)這一性質(zhì)可在多糖的濃縮水溶液中分批加入乙醇，使乙 醇的體積濃度逐漸增加到 50，100，200, 900 mL/L,從而使不同聚合度的多糖分別沉淀析 出。22 2 色譜分離法 常用兩種色譜分離方法：一是凝膠柱色譜法,二是離子交換色譜法。223 膜分離法膜分離技術(shù) （membra ne separation tech no logy ， MST）是一種高效分離技術(shù)， 分離過程以 選擇透過性膜作為分離介質(zhì)， 通過在膜兩側(cè)施加某種推動(dòng)

12、力 （壓力差、 化學(xué)位差、電位差等） ， 使原料液中組分有選擇性的通過膜。 目前應(yīng)用較多的是超濾和微濾技術(shù)。3 多糖的分析鑒定31 含量的測(cè)定 測(cè)定方法：硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子 交換色譜法、 yaphe 法、薄層色譜法、酶法、原子吸收法、 HPLC 法、凝膠電泳法、親和電 泳法、連續(xù)流動(dòng)分析法檢測(cè)法44、次亞碘酸鹽定量法、 蒽酮硫酸法（總糖）、DNS法（還 原法）、磷鉬比色法、 鄰鉀苯胺比色法等。 每種方法只對(duì)某些多糖的測(cè)量效果好。 比色法、 分光光度法、離子交換色譜法、酶法和電泳法等可同時(shí)用于多糖的定性定量分析。32 純度鑒定多糖是高分子化合物, 其純

13、品微觀上是不均一的, 通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分 子量范圍的均一組分。 多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、 HLPC 法 等。 現(xiàn)在應(yīng)用較多的是 HLPC 法,旋光度測(cè)定也是純度測(cè)定的一種方法。33 分子量的測(cè)定多糖分子量的測(cè)定是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作。常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、 GPC 法、 MALDI TOF MS 法。34 結(jié)構(gòu)測(cè)定34 1 多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析,主要是分析組成多糖的單糖類型、數(shù)目、連接方式及苷建 構(gòu)型。 常用化學(xué)法和儀器分析法。 多糖組分與分子比例測(cè)定法： 部分酸解法、 完全酶解法、 色譜法；吡喃、呋喃環(huán)形式結(jié)構(gòu)的分析：紅外光譜；連接次序：選擇性光譜法、糖苷鍵順序 水解、核磁共振；a 3 -異頭異構(gòu)體：糖苷酶水解、核磁共振；羥基被取代情況：甲基化 反應(yīng)、氣相色譜、過碘酸氧化、 Smith 降解法和測(cè)硫酸基法（ terho 法）、核磁共振、質(zhì)譜法；糖鏈、肽鏈連接方式：?jiǎn)翁桥c氨基酸組成、稀堿水解法、 肼解反應(yīng)； 多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多， 迄今沒有一種方法可以單獨(dú)完成多糖結(jié)構(gòu)的分析。 儀 器分析與化學(xué)方法相結(jié)合是常用的多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定方法。342 多糖高