血管內(nèi)皮生長因子在先兆子癇大鼠腎損傷中的作用

1、血管內(nèi)皮生長因子在先兆子癇大鼠腎損傷中的作用         06-07-01 10:17:00     作者：蘇華，朱忠華，鄧安國    編輯：studa20 【摘要】  目的  研究血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在先兆子癇大鼠腎損傷中的作用。方法  采用一氧化氮合酶抑制劑復制大鼠先兆子癇模型，通過雙抗酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿及尿液中VEGF含量，應用原位雜交法測定腎小球VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平，利

2、用免疫組化法檢測腎小球VEGF蛋白表達情況。結(jié)果  在先兆子癇大鼠中，尿液中VEGF含量（以尿VEGF/尿肌酐表示）升高且與腎臟局部VEGF的表達強度呈正相關(guān)，腎小球局部VEGFmRNA和VEGF蛋白表達均增強，且表達的強度與24h尿蛋白排泄量呈正相關(guān)。結(jié)論  尿液VEGF可能來源于腎臟局部的分泌，腎小球VEGF可能參與了先兆子癇中大量蛋白尿的產(chǎn)生。        【關(guān)鍵詞】  血管內(nèi)皮生長因子；先兆子癇；蛋白尿        【Abs

3、tract】  Objective  To investigate the effect of vascular endothelial growth factor(VEGF) in kidney lesion of rats with preeclampsia.Methods  A rat model of preeclampsia was developed by inhibitor of nitric oxide synthase. Plasma and urinary VEGF were determined using a sandwich enzyme

4、 immunoassay. The level of VEGFmRNA in glomeruli was measured by in situ hybridization. The expression of VEGF protein in glomeruli was detected by immunohistochemistry method.Results  In rats with preeclampsia， urinary VEGF levels (expressed as VEGF/creatinine ratio) were significantly higher

5、and positively correlated to the expression of VEGF in glomeruli， the level of VEGF mRNA and the expression of VEGF were significantly higher than other groups. There was a positive correlation between the expression of VEGF in glomeruli and 24 h urinary protein excretion.Conclusion  Corrected

6、urinary VEGF levels can stand for the expression of VEGF in glomeruli. VEGF in glomeruli might be involved in the mechanism of proteinuria in preeclampsia.        【Key words】  vascular endothelial growth factor； preeclampsia； proteinuria     

7、60;  先兆子癇是引起孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的重要原因，腎臟損傷所致的大量蛋白尿為其主要的臨床表現(xiàn)。引起腎小球濾過膜通透性增高的原因目前不詳。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種強效的增強血管壁通透性的生物活性物質(zhì)1。有研究表明血漿及胎盤蛻膜局部VEGF水平的改變可能與妊高征的發(fā)病有關(guān)。但血漿、尿液VEGF水平與腎臟局部VEGF表達的關(guān)系及腎臟局部VEGF的表達與先兆子癇腎損傷的關(guān)系至今國內(nèi)外尚未有研究。本試驗擬通過一氧化氮合酶抑制劑亞硝基左旋精氨酸甲酯（L-nitro-arginine，L-NAME）復制大鼠先兆子癇

8、模型2，檢測血漿、尿液中VEGF濃度，觀察腎小球中VEGF的表達及其表達的強弱與24h尿蛋白排泄量的關(guān)系，從而探討VEGF在先兆子癇腎損傷中的作用。        1  材料與方法        1.1  主要試劑與儀器  L-NAME（美國Sigma公司），VEGF Elisa試劑盒（北京中山生物有限公司），地高辛標記的VEGFmRNA探針（德國Biognostik公司），VEGF多克隆抗體（Santa Cruz公司），SABC試劑盒（武漢博士

9、德生物制品公司），大鼠尾動脈袖帶式血壓計（由同濟醫(yī)學院心血管研究中心提供），透射電鏡（由同濟醫(yī)學院超微病理學教研室提供），計算機病理圖像分析儀（由同濟醫(yī)學院清屏影像公司提供）。        1.2  動物模型復制與分組  取200250g普通級Wistar雄性大鼠50只和成年Wistar雄性大鼠25只（由同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供），按雌：雄=2：1比例同籠混合飼養(yǎng)一夜后，次日清晨當雌性大鼠陰道涂片檢查可見活動的精子時，確認為大鼠妊娠第1d。將孕鼠隨機分為兩組，A組：先兆子癇模型組（n=6），B組：正常妊娠對照組

10、（n=6）。另取6只無妊娠史雌性大鼠作為C組，即未孕L-NAME處理組。從妊娠第18d開始對A組和B組大鼠分別皮下注射L-NAME和蒸餾水250mg/（kg·d），持續(xù)4d后于妊娠第22d時處死。C組大鼠于皮下注射L-NAME 250mg/（kg·d），持續(xù)4d后處死。        1.3  24h尿蛋白排泄量的測定  用標準代謝籠分別與注射前和注射第2、4d收集各組大鼠24h尿液，采用考馬斯亮藍結(jié)合法測定24h尿蛋白排泄量。      

11、60; 1.4  收縮期血壓的測定  A組和C組大鼠于L-NAME注射前及L-NAME注射第2、3、4d測量尾動脈收縮壓。具體方法是將大鼠置于預熱箱內(nèi)預熱至3840，待其安靜后用大鼠尾動脈血壓儀在5min內(nèi)連續(xù)測量3次收縮期血壓，取平均值。        1.5  血漿及尿液標本的采集與檢測  在注射第4天時經(jīng)眼靜脈竇采集各組大鼠靜脈血2ml，置于經(jīng)肝素抗凝的玻璃管，3000r/min離心10min后取上清液，置于-70冰箱保存待檢。大鼠處死后經(jīng)膀胱穿刺收集各組大鼠尿液，3000r/min離心1

12、0min取上清3ml存放于-70冰箱保存待檢。采用雙抗酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），通過繪制標準曲線求出標本VEGF的濃度，為了糾正尿液濃度不同的影響，尿液VEGF含量以尿VEGF/尿肌酐（ng/mmol Cr）來表達。        1.6  原位雜交法  大鼠處死后，取一側(cè)腎組織將其置于4%多聚甲醛液12h、脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)切片后，具體操作步驟按VEGFmRNA 原位雜交試劑盒說明書進行。實驗設不加探針的陰性對照。顯微鏡下胞漿呈黃色顆粒狀為陽性。     &#

13、160;  1.7  免疫組織化學法  VEGF蛋白用免疫組織化學法檢測，具體操作步驟見試劑盒說明書。實驗均設不加一抗的陰性對照。顯微鏡下胞漿呈棕黃色顆粒狀者為陽性，蛋白表達強弱用吸光度（absorbance，A）表示。每張切片隨機選取5個腎小球，用免疫組化分析軟件（HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)）計算VEGF陽性著色細胞吸光度。        1.8  統(tǒng)計學方法  實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間數(shù)據(jù)差異的顯著性分析，方差齊者采用t檢驗，方差不齊時采用t檢

14、驗。        2  結(jié)果        2.1  24h尿蛋白排泄量  A組大鼠L-NAME注射第2d時24h尿蛋白排泄量（35.16±11.31）mg/24h較注射前（4.52±1.00）mg/24h增高，注射第4d時24h尿蛋白排泄量（55.41±20.25）mg/24h更高，P均<0.01。注射前各組大鼠24h尿蛋白排泄量間無統(tǒng)計學差異（P0.05）。注射后，同一時間段內(nèi)，A組大鼠24h尿蛋白排泄量

15、較B組（P<0.01）及C組（P<0.01）有顯著性增高，見表1。 表1  各組大鼠24h尿蛋白排泄量 (x±s，n=6，mg/24h)注：與A組比較*P<0.01，與注射前比較P<0.01    2.2  收縮期血壓  A組和C組大鼠注射L-NAME后，血壓進行性上升。注射前兩組大鼠血壓間無統(tǒng)計學差異（P0.05）。注射L-NAME后，同一時間點上，A組大鼠血壓明顯高于C組，兩組間有顯著的統(tǒng)計學差異（P<0.01），見表2。表2  A組和C組大鼠收縮期血壓  （x±s，n=6，mmHg）注：與C組比較*P<0.01    2.3  血漿、尿