鈣整合素結(jié)合蛋白CIB的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備與亞細(xì)胞定位

1、鈣整合素結(jié)合蛋白CIB的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備與亞細(xì)胞定位 11-01-28 16:01:00 編輯：studa20作者：石潔, 惠玲*, 張煦, 王曉輝, 楊金升, 呂同德, 趙治華, 哈小琴【摘要】 目的: 構(gòu)建鈣整合素結(jié)合蛋白( calciumand integrinbinding protein, CIB)的原核表達(dá)載體, 制備小鼠抗人CIB的多克隆抗體并探討其亞細(xì)胞定位。方法: 采用RTPCR方法從人腦組織擴(kuò)增CIB的cDNA片段, 利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32aCIB, 轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中, 以IPTG誘導(dǎo)BL21(DE3)表達(dá)CIB融合蛋白, SDSPA

2、GE鑒定融合蛋白CIB的表達(dá)。用含CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝膠顆粒為抗原免疫小鼠制備抗血清, 抗血清分別經(jīng)Protein G、 抗原親和層析后用Western blot及免疫組化方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果: 通過重組表達(dá)獲得CIB抗原蛋白, 免疫小鼠并純化抗血清得到特異性的抗CIB抗體, 該抗體能檢測細(xì)胞內(nèi)源性CIB蛋白的表達(dá); 同時免疫組化結(jié)果顯示: CIB在SHG44、 Hhu7細(xì)胞株中主要定位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)論: 成功克隆CIB基因并制備了特異性的小鼠抗人的CIB多克隆抗體, 對進(jìn)一步研究CIB的功能奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 CIB; 基因重組; 融合表達(dá); 多克隆抗體; 亞細(xì)胞定位Abstrac

3、t AIM: To construct the prokaryotic expression vector pET32aCIB, prepare the specific polyclonal antibody against CIB and study the subcellular localization of CIB. METHODS: CIB was amplified by RTPCR from human brain tissue and cloned into prokaryotic expression vector pET32aCIB. The CIB fusion pro

4、tein was expressed in BL21 (DE3)/pET system and identified by SDSPAGE. The mice were immunized with the polyacrylamide gel particles containing the CIB fusion protein for polyclonal antibody preparation. The antibody was purified by affinity chromatographic column matrix coupled with protein G, anti

5、gen respectively and then identified by Western blot and immunohistochemistry. RESULTS: The protein of CIB was obtained by recombination expression. The specificity of polyclonal antibody was obtained by immunizing BALB/c mice with polyacrylamide gel particles containing the fusion protein of CIB an

6、d purification. The results of immunohistochemistry demonstrated that CIB was localized predominantly in the cytoplasm of SHG44 and Hhu7 cells. CONCLUSION: The protein of CIB has been cloned and expressed successfully. The specific polyclonal antibody against the protein of CIB has been obtained, wh

7、ich can be used for further research into the function of CIB.KeywordsCIB; gene recombination; fusion expression; polyclonal antibody; subcellular localization鈣整合素結(jié)合蛋白( calciumand integrinbinding protein, CIB) 是1998年研究人員用integrin aIIb subunit為誘餌通過酵母雙雜交得到的一個新基因, 對該蛋白的序列結(jié)構(gòu)分析表明, 它含有4個EFhand結(jié)構(gòu)域, 其中EFhan

8、d3、 4位于C端, 與鈣離子有很高的親和性1。它的許多特性與另一含有EFhand結(jié)構(gòu)域的恢復(fù)蛋白家族的神經(jīng)鈣感受器蛋白(NSC)相似2。與NSC蛋白不同的是CIB不只在神經(jīng)元表達(dá), 它在機體的許多組織如腦、 心臟、 肺等均有表達(dá)。CIB也是3個重要的鈣結(jié)合蛋白之一, 與其他2個已知的參與多種蛋白調(diào)節(jié)的鈣結(jié)合蛋白鈣調(diào)磷酸酶B(calcineurinB, CnB)及鈣調(diào)素(calmodulin, CaM)有很高的同源性, 研究表明CIB也與這個兩鈣調(diào)蛋白一樣, 是一種鈣離子感受器, 它與鈣離子結(jié)合后會引起CIB蛋白構(gòu)象的改變, 使它能與其他的蛋白因子結(jié)合, 從而影響細(xì)胞的功能。表達(dá)并制備其抗體對

9、于基因的功能研究將起重要作用, 如免疫組化、 蛋白質(zhì)相互作用的鑒定等許多方面工作的開展都需要有特異的抗體作為輔助。因此, 我們構(gòu)建了CIB的原核表達(dá)載體, 進(jìn)行了原核表達(dá)和純化, 并免疫小鼠獲得抗體, 為進(jìn)一步研究CIB的功能提供參考。1 材料和方法1.1 材料 限制性內(nèi)切酶、 T4 DNA連接酶、 各種工具酶均購自TaKaRa公司, Taq PlusI DNA聚合酶、 dNTPs、 引物購自上海生工生物公司, DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司, 胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品, 異丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)、 弗氏佐劑均為Sigma公司產(chǎn)品, 辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、

10、 TITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為北京中杉公司產(chǎn)品; 大腸桿菌BL21(DE3)和pET32 質(zhì)粒（NOVAGEN）購自北京天為時代; BALB/c小鼠（雌性, 體質(zhì)量1822 g）由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物科提供; SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞株、 Huh7肝癌細(xì)胞株由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心惠玲博士提供。1.2 方法2 結(jié)果2.1 目的基因的擴(kuò)增及載體構(gòu)建 提取人腦組織的總RNA, 經(jīng)RTPCR擴(kuò)增出約574 bp的目的片段, 與預(yù)期結(jié)果一致; 擴(kuò)增片段與載體pET32a同時用EcoR I和Sal I雙酶切, 回收后將目的片段連接到pET32a上, 得到重組質(zhì)粒pET32aCIB（圖1）,

11、 測序結(jié)果與pET32a載體多克隆位點和CIB序列進(jìn)行同源比較后證明插入序列的讀碼框正確, 并有正確的方向, 表明質(zhì)粒pET32aCIB克隆正確。圖1 酶切鑒定 pET32CIB重組質(zhì)粒（略）Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of pET32a（+）CIBM: DL 2 000 DNA marker; 1: Recombinant plasmid pET32CIB; 2: Digestion with EcoR I and Sal I; 3: Plasmid pET32; 4: PCR product of CIB gene.2.2 CIB

12、的原核表達(dá)及目的蛋白的純化 將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)大腸桿菌中, 用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。120 g/L SDSPAGE電泳結(jié)果可見與理論Mr 42103大小相符的目的蛋白帶, 將切下的含目的蛋白的凝膠塊用PBS(pH7.2)4溶解過夜后, 離心收集上清, 用120 g/L SDSPAGE對純化效果進(jìn)行鑒定。純化后的CIB蛋白幾乎不含雜蛋白, 純化效果理想(圖2)。圖2 CIB的原核表達(dá)及目的蛋白的純化（略）Fig 2 Analysis of CIB recombinants protein and Purification of CIB protein by 120 g/

13、L SDSPAGEM: Protein marker; 1: CIB protein after purification; 2: pET32CIB/BL21 induced by IPTG; 3: pET32CIB/BL21 uninduced by IPTG; 4: pET32/BL21 induced by IPTG.2.3 多克隆抗體的制備 SDSPAGE電泳分析表明, 經(jīng)過Protein G和CIB蛋白親和柱兩步純化后, 可見清晰的抗體重鏈和輕鏈條帶, 表明抗CIB多克隆抗體的純化是成功的（圖3）。2.4 Western blot特異性檢測結(jié)果 為了驗證CIB抗體能否特異性的與內(nèi)源性CI