組織培養(yǎng)試驗(yàn)植物部分

1、組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)教案實(shí)驗(yàn)一植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的配制、滅菌與儀器操作培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)二 植物的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)三 植物離體培養(yǎng)中的形態(tài)觀察和愈傷組織繼代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)四動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制滅菌與儀器操作培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)五雞胚原代細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)六動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)七動(dòng)物細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇15 / 15實(shí)驗(yàn)一植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的配制、滅菌與儀器操作培訓(xùn)【目的要求】學(xué)習(xí)并掌握植物組織常用培養(yǎng)基的組成、配制與滅菌方法。培養(yǎng)基能夠提供植物生長(zhǎng)、繁殖所必須的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及生長(zhǎng)因子，是開展植物組織培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)和前提。植物的種類不同，研究的目的不同，所需要的培養(yǎng)基的種類也各不相同。【實(shí)驗(yàn)用品】1. 實(shí)驗(yàn)用具：電子天平

2、、燒杯、量筒、三角瓶或培養(yǎng)瓶、移液管、藥匙、玻棒、pH試紙、吸耳球、牛皮紙、皮筋等。2. 藥品：蔗糖、瓊脂、 O.1mol/L NaOH、 0.1mol/L HCL、各種培養(yǎng)基母液、激素母液【內(nèi)容與方法】1. 分組配制培養(yǎng)基激素用分析天平稱取生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素50-100mg。生長(zhǎng)素用少量95%的酒精或0.1mol/L的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素用 0.1mol/LHCL加熱溶解。加蒸餾水定容至100ml配制成0.5-1mg/L 的溶液。v激素配制x培 養(yǎng)基 中所要求的激素濃度十激素母液濃度2. 濕熱滅菌培 養(yǎng)基稱取規(guī)定數(shù)量的瓊脂，加水到培養(yǎng)基最終容積的3/4，水浴或電爐使之加熱溶解。根據(jù)配方要

3、求，把按順序量取的各種母液以及稱取的蔗糖,都加入煮好的瓊脂中， 然后加水定容。包好或蓋好，標(biāo)明編號(hào)。121C(103kPa)用0.1mol/L的NaOH或者HCI調(diào)pH。分裝培養(yǎng)基, 滅菌 15-20min。3. 作好植物組織培養(yǎng)的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作制備無菌水：121 C (103kPa)滅菌40min ;配制0.1% HgCl 2溶液(放置棕色瓶中)；準(zhǔn)備接種用培養(yǎng)皿、金屬器械等用具。注意:1. 實(shí)驗(yàn)前1天，無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面 一次，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75%酒精擦洗。然后紫外線消毒。2. 實(shí)驗(yàn)中所用的各種容器一定要洗凈、烘干。3. 用電子天平稱量藥品時(shí)，一定要

4、用稱量紙，對(duì)于有腐蝕性的藥品，應(yīng)將其放置在小燒杯 中稱量。4. 各種母液應(yīng)保存在 2-4 C的冰箱中，以免變質(zhì)、長(zhǎng)霉。5. 使用高壓滅菌鍋時(shí)，一定要正確操作，并提前檢查其中的水是否合適。6. HgCl2屬于一種腐蝕性極強(qiáng)的劇毒物品，配制時(shí)要注意安全。實(shí)驗(yàn)二 植物的離體培養(yǎng)（兩次課程）【目的要求】1嘗試進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)2: 了解植物組織培養(yǎng)的基本原理【實(shí)驗(yàn)用品】材料：百合鱗莖、菊花，滅菌培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精，體積分?jǐn)?shù)為 20%的次氯酸鈉溶液，無菌水。用具：錐形瓶或大試管，燒杯，酒精燈，恒溫箱，接種箱，濾紙，消毒用酒精棉球，培養(yǎng)皿， 解剖刀，鑷子、打孔器?！緝?nèi)容與方法】1. 外植體消毒

5、：在接種箱上將胡蘿卜段用酒精消毒并用無菌水清洗，再用次氯酸鈉處理，立即用無菌水消毒。用無菌濾紙吸去外植體表面的水分，用無菌解剖刀鍥成橫切片，再選取有生命力旺盛的部位，切成小塊。2. 接種：將組織塊接種到培養(yǎng)基上，用錫箔紙封蓋瓶口，并用橡皮筋扎緊。3. 培養(yǎng)：將接種后的組織塊，放在2326 C恒溫避光條件下培養(yǎng)，一周后，檢查培養(yǎng)材料的污染情況；14天后，觀察愈傷組織的生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)三植物離體培養(yǎng)中的形態(tài)觀察和愈傷組織繼代培養(yǎng)【目的要求】誘導(dǎo)愈傷組織是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)，愈傷組織經(jīng)過不斷繼代培養(yǎng)才能變得疏松，易于分散，有利于建立良好的懸浮系。【實(shí)驗(yàn)用品】材料：外植體組織。用具：錐形瓶或大試管，燒杯，酒

6、精燈，恒溫箱，接種箱，濾紙，消毒用酒精棉球，培養(yǎng)皿， 解剖刀，鑷子、打孔器?！緝?nèi)容與方法】1. 設(shè)計(jì)不同激素比例的繼代培養(yǎng)基。2. 選擇待培養(yǎng)物傷口周圍長(zhǎng)出的淡黃色、疏松、生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基中繼代。3. 培養(yǎng)：將接種后的組織塊，放在 2326 C恒溫避光條件下培養(yǎng)，一周后，觀察愈傷組 織的生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)四 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基配制滅菌與儀器操作培訓(xùn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)設(shè)備、器材的使用方法。2、掌握各類器皿、工具的清洗、包裝、滅菌方法3、掌握各類培養(yǎng)基及試劑溶液的配制、滅菌方法二、實(shí)驗(yàn)原理 離體條件下的細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)均十分敏感， 極少的殘留物都可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副

7、作 用，因此， 新的或重新使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，以達(dá)到不含任何殘留物的要求。 而玻璃、橡膠、塑料、布類、紙類等不同類型的材料應(yīng)采用不同的清洗和消毒、滅菌方法。細(xì)胞培養(yǎng)失敗的一個(gè)常見原因是微生物污染， 有時(shí)是操作過中不規(guī)范造成的， 有時(shí)則是 相關(guān)用品本身有污染造成的，因此在培養(yǎng)細(xì)胞前各種用品均需要進(jìn)行嚴(yán)格消毒或滅菌。培養(yǎng)液是進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)最基本、 最主要的條件之一， 掌握常見培養(yǎng)液的成分、 性質(zhì) 與配制方法是細(xì)胞培養(yǎng)操作者應(yīng)具有的基本知識(shí)和能力。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、設(shè)備（1） CO 2培養(yǎng)箱C02培養(yǎng)箱要提前消毒，有些自己帶有高溫干熱滅菌功能， 大部分則宜用“純水擦洗一一 95%酒精擦洗紫外照

8、射殺菌”的消毒方法。初次開啟儀器時(shí)要提前一天矯正C02的濃度值。然后設(shè)定好溫度等參數(shù)。關(guān)于鋼瓶的壓力閥門控制：鋼瓶上的閥門松緊程度不是十分重要，關(guān)鍵靠供氣閥門控 制壓力在 0.1（越擰緊壓力越高，所以可先把供氣閥門打到松弛狀態(tài)，然后再開鋼瓶閥門） （2）倒置顯微鏡打開電源開關(guān)，確保光路桿調(diào)至“觀察”狀態(tài)，選擇所需放大倍數(shù)的物鏡，調(diào)節(jié)至適 當(dāng)亮度。將培養(yǎng)瓶放在載物臺(tái)上，轉(zhuǎn)動(dòng)粗微調(diào)調(diào)節(jié)。如需拍照，則在電腦中打開軟件，并將 光路桿調(diào)至“拍照”狀態(tài)。注意不要隨便誤打開熒光燈，以免浪費(fèi)其壽命。一旦打開熒光光源后，至少要15 分鐘后才能關(guān)閉，關(guān)閉后至少要 5 分鐘才能再次開啟。（3）其他：高壓蒸汽滅菌鍋、

9、電熱鼓風(fēng)干燥箱等。2、器具（1）玻璃類 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（有的是塑料的） 、吸管、三角燒瓶、玻璃平皿、普通玻璃瓶 方法：玻璃類一般是清水浸泡、洗衣粉液刷洗、浸酸過夜、自來水沖洗、然后依次用去離子水、一蒸水、三蒸水分別潤(rùn)洗56次。然后烘干、包扎、滅菌。（2）塑料類 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板等 方法：一般是一次性用品，拆包后直接使用；如果要重復(fù)使用則參照玻璃器皿的方法， 最后照射紫外線消毒。（3）金屬類 剪刀、鑷子、滅菌筒等 方法：清洗后用紙包扎，高壓滅菌。（3）其他 紗布、脫脂棉、酒精棉、棉繩、牛皮紙、鋁箔、一次性手套、乳膠手套等方法：主要是用于包扎滅菌上述器具等，一般不存在自身如何滅菌的問題。3、試劑

10、（1） 基礎(chǔ)培養(yǎng)液（如 1640、MEM DMEM199等）干粉溶于約800ml超純水（三蒸水），袋子內(nèi)面也沖洗收集進(jìn)去，攪拌助溶（不宜加熱）按說明書，再補(bǔ)加 NaHCO3（2g）、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。用 1M HCl 或 1M NaOH 調(diào) PH 至 7.1定容至1L,過濾除菌（蔡氏濾器抽濾）（2）完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基臨用前加入小牛血清（10% 20%。（注：新買血清要先56 C滅能半小時(shí)，以殺滅其中的補(bǔ)體物質(zhì)，消除對(duì)細(xì)胞的毒性。然后分裝，一70C20C低溫凍存）加抗生素，雙抗終濃度一般為青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml。（傳統(tǒng)市售青霉素80萬U/瓶，可溶于4ml體積

11、；市售鏈霉素為 100萬U/瓶，可溶于5ml體積；用時(shí)每L 培養(yǎng)液各加0.5ml。另：青霉素鈉 1670U/mg,鏈霉素堿1000U / mg,硫酸鏈霉素798U/ mg（3）0.25%胰蛋白酶稱取250mg胰蛋白酶干粉于無菌燒杯中，先用滅菌的D Hanks （即不含CjT、M&+和葡萄糖）液調(diào)成糊狀，然后補(bǔ)足至 100ml，攪拌混勻，在磁力攪拌器攪拌至溶解（室溫和4 C交替進(jìn)行）過濾除菌，分裝入青霉素小瓶，低溫凍存。使用前可用無菌 7.4% NaHCO3調(diào)PH至7.2左右。（4）洗滌液、平衡鹽溶液（Hanks、D-Hanks等）Hanks液成分：NefeHPQ H20 0.06 g/

12、LKH2P040.06 g/LMgSO4 7Hz0 0.20 g/L 葡萄糖 1.00 g/L NaCl8.00 g/LCaCl20.14 g/L 先單獨(dú)溶解CaCl2于100ml超純水（或三蒸水）; 再單獨(dú)溶解 MgSO7Hz0于100ml超純水； 再單獨(dú)溶解其他成分于650ml超純水（按表中順序，每次待前一成分充分溶解再加下一種成分）； 將液和液緩慢倒入液中，并不時(shí)攪動(dòng)，防止沉淀。 將0.35g NaHCO 3溶解于37 C 100ml超純水 用數(shù)滴NaHCO3液溶解0.02g酚紅 將、液逐滴并攪拌加入液 將液移入容量瓶，定容至1L,混勻。 高壓滅菌（8磅10min）, 4C保存。四、總結(jié)

13、與討論1、寫出自己所在的小組準(zhǔn)備出的全部用品，并說明其處理方法。2、寫出實(shí)驗(yàn)室的 CO2培養(yǎng)箱和倒置顯微鏡的型號(hào)和操作要領(lǐng)。3、Hanks液的配制中，為什么鈣鹽和鎂鹽需單獨(dú)溶解？4、 胰酶消化液為什么最好用不含C,、m6+的BBS配制？實(shí)驗(yàn)五雞胚原代細(xì)胞的培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握雞胚組織的取材、剪切、消化技術(shù)2、掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)3、掌握原代動(dòng)物細(xì)胞制備過程4、為細(xì)胞傳代、凍存等后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作提供材料二、實(shí)驗(yàn)原理發(fā)育中的雞胚含有大量處于活躍分裂和生長(zhǎng)過程的細(xì)胞，尤其是其中大量的成纖維細(xì) 胞，是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)良好的取材來源。動(dòng)物組織用中均含有一定量的細(xì)胞間質(zhì)（纖維和基質(zhì)等），對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有妨礙作用，用胰蛋

14、白酶消化法能去除間質(zhì)，使組織松散成單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞則容易生長(zhǎng)。三、實(shí)驗(yàn)用品1器材超凈臺(tái)（或生物安全柜）、CO?培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、小玻璃瓶（青霉素 小瓶）、不銹鋼滅菌筒、100目不銹鋼網(wǎng)篩（1個(gè)）、滅菌吸管、解剖剪（中號(hào) 1把；小型眼 科剪1把）、鑷子（中號(hào)鑷子2把，彎頭眼科鑷1把）、吸耳球、計(jì)數(shù)板、手動(dòng)計(jì)數(shù)器、酒精 棉、滅菌的平皿（3個(gè)）、無菌離心管（10ml規(guī)格，2只）。2、試劑Hanks液（或 D- Hanks液）、DMEM （須含10-20%血清）、0.25%胰蛋白酶3、材料9-12日齡雞胚（即雞胚預(yù)先在培養(yǎng)箱中37C培養(yǎng)9-12日，大頭朝上，每天翻蛋至少 2次，

15、用水盤保證濕度）四、實(shí)驗(yàn)步驟（需提前準(zhǔn)備：雞胚提前9天孵化、開啟 CO2培養(yǎng)箱、器材用品包扎滅菌并烘干、培養(yǎng)液從冰箱中取出并融化、超凈臺(tái)提前開紫外燈半個(gè)小時(shí)進(jìn)行消毒、37 C恒溫水浴準(zhǔn)備好）1、取材取9-12d的雞胚2個(gè)，放入超凈臺(tái)中，大頭（氣室）朝上放置于蛋托上，酒精棉消毒氣 室部位。用鑷子敲破和剝?nèi)馐也课煌鈿?，換一把鑷子挑破尿囊膜和羊膜，再換一把鑷子小心 取出雞胚，放于無菌平皿中。用小剪刀和小鑷子配合，去除頭和內(nèi)臟，用Hanks液清洗2-3次，用吸管洗棄清洗液，以洗去紅細(xì)胞。2、剪碎將胚體移入另一無菌平皿中，用Hanks液清洗3次去除血污，切成小塊，然后移入無菌青霉素小瓶中，在小瓶?jī)?nèi)用眼

16、科剪反復(fù)剪成1mm3的小塊。3、消化加入適量0.25%胰蛋白酶液（一般每 10個(gè)雞胚加20ml消化液），蓋好橡皮塞，置 37 C 恒溫水浴中消化 20-30min，每隔5min搖動(dòng)1次，使組織塊散開。視組織塊變得疏松、顏色 略變白時(shí)，從水浴中取出。4、終止在超凈臺(tái)中，用吸管輕輕吸棄消化液，加入2-3ml含小牛血清的培養(yǎng)液，以終止消化。靜置片刻，使未能消化的大塊組然后用吸管反復(fù)吹打，使大部分組織塊分散成單細(xì)胞狀態(tài)，織自然下沉，然后將上層液通過 100 目不銹鋼網(wǎng)篩，制備細(xì)胞懸液。轉(zhuǎn)移入無菌離心管。5、稀釋、接種離心(lOOOrpm, 10min),棄上清，加入適量培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打混勻。取少

17、量樣 品計(jì)數(shù)，根據(jù)結(jié)果再對(duì)擬培養(yǎng)的細(xì)胞稀釋到濃度為1X106個(gè)/ml。將稀釋好的細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液的量以充分覆蓋瓶底為度。6、培養(yǎng)將培養(yǎng)瓶置于37C、5%C2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)瓶的蓋子不要擰得太緊， 以不會(huì)往下掉為度，以便 CO2進(jìn)入。細(xì)胞貼壁后延展成長(zhǎng)梭形，培養(yǎng)7 - 10d后即可長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞。五、結(jié)果與討論在倒置顯微鏡上觀察和記錄雞胚原代細(xì)胞的形態(tài)， 以及培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁時(shí)間、 增殖時(shí)間 和完全匯合的時(shí)間，同時(shí)拍攝部分代表性的照片。六、注意事項(xiàng)1、消化培養(yǎng)法效率高，可得到大量的原代細(xì)胞用于培養(yǎng)，但操作步驟較多，操作時(shí)要特別 注意無菌操作，以防微生物污染而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。

18、2、 對(duì)于不同的組織需用不同的消化方法， 一般而言，胚胎類軟組織用胰蛋白酶和 EDTA即可 得到理想的消化效果， 而對(duì)于成體組織由于存在大量的細(xì)胞外基質(zhì)， 需用膠原酶， 有時(shí)配合 使用透明質(zhì)酸酶會(huì)加速消化過程。3、在組織消化過程中， 為了防止消化過度影響細(xì)胞細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)， 要隨時(shí)取樣進(jìn)行觀察， 發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞時(shí)應(yīng)立即終止消化。4、細(xì)胞接種濃度不宜過大，否則會(huì)影響細(xì)胞貼壁和細(xì)胞生長(zhǎng)。5、 培養(yǎng)后要隨時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和培養(yǎng)液的變化，以便發(fā)現(xiàn)異常情況后及時(shí)對(duì)癥處理。附：細(xì)胞計(jì)數(shù)簡(jiǎn)要步驟1、計(jì)數(shù)板整個(gè)計(jì)數(shù)室分成 9個(gè)大方格，本實(shí)驗(yàn)用到四角的4個(gè)大方格，這些大方格又各自分成16個(gè)

19、中方格。（每個(gè)大方格容納體積為“ 0.1cm x 0.1 cm x 0.01cm = 10 -4 ml ”）中央大方格的25個(gè)中方格，每個(gè)還繼續(xù)分成16小方格，主要用于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)不使用。計(jì)殖池正面觀二穿孚二）測(cè)面觀支持堤支持堤（0. ImmM#）I0.005mni2、加樣：將蓋玻片放在技術(shù)板正中。 用毛細(xì)管輕輕吹打細(xì)胞懸液使其混合均勻后， 取少許細(xì)胞懸 液，在技術(shù)板與蓋玻片之間加少量細(xì)胞懸液， 由于毛細(xì)作用細(xì)胞懸液會(huì)充入技術(shù)室內(nèi)。 加樣 量不要過少或帶氣泡，也不能溢出蓋玻片。如出現(xiàn)失敗，需洗凈計(jì)數(shù)室并干燥后重新操作。3、計(jì)數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)液滴入計(jì)數(shù)室后， 須靜置2- 3min ,然后在低倍鏡

20、下計(jì)數(shù)。 在顯微鏡下，用10X 物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角的大方格中的細(xì)胞數(shù),為降低誤差，應(yīng)計(jì)四個(gè)大方格的總和以求平均值。對(duì)于橫跨刻度上的細(xì)胞，則一般按照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”原則。4、計(jì)算細(xì)胞數(shù)/每ml體積=（四個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)之和 /4 ） X104實(shí)驗(yàn)六 動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握細(xì)胞培養(yǎng)傳代技術(shù)2、掌握判斷動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的要領(lǐng)3、進(jìn)一步鞏固細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作二、實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)原代細(xì)胞或細(xì)胞系增殖到一定密度（一般長(zhǎng)成致密單層） ，則需要做再培養(yǎng)，即將培 養(yǎng)的細(xì)胞分散后，以適當(dāng)比例轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，此過程為傳代培養(yǎng)。 一般所說的細(xì)胞代數(shù)即是指細(xì)胞傳代培養(yǎng)的次數(shù)。三、

21、實(shí)驗(yàn)用品1、器材超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、 CO2 培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、吸管、三角瓶、膠頭等。2、試劑Hanks 液（或 D-Hanks 液）、消化液（ 0.25%胰蛋白酶液） 、完全 DMEM 液（含 10%胎 牛血清 FBS+ 抗生素）3、材料匯合的雞胚成纖維細(xì)胞四、實(shí)驗(yàn)步驟1、清洗取 80% 或接近匯合的培養(yǎng)細(xì)胞，使培養(yǎng)瓶的細(xì)胞面向上，將培養(yǎng)液倒入盛污物的三角 瓶?jī)?nèi)（或用吸管吸出培養(yǎng)液） ，用約 2ml Hanks 液清洗 23 次。2、消化向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入消化液約2ml，室溫（或 37C）下消化，消化的時(shí)間非常關(guān)鍵，須掌握好。將培養(yǎng)瓶放于倒置顯微鏡下或靠肉眼觀察，鏡下當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞與細(xì)

22、胞間相 互接觸松散、間隙增大，細(xì)胞變圓或出現(xiàn)蜘蛛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時(shí)即為適當(dāng)時(shí)候（約3min ） 。肉眼觀察則會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底面出現(xiàn)類似水汽的一層結(jié)構(gòu)，即發(fā)霧現(xiàn)象， 這是因?yàn)榧?xì)胞與細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙后， 透光性變得不均勻， 從而產(chǎn)生水汽樣結(jié)構(gòu)。 此時(shí)應(yīng)立即將培養(yǎng)瓶直立并進(jìn)行 下面操作以終止消化。3、終止向瓶?jī)?nèi)加入等量含有小牛血清的培養(yǎng)液以終止消化。拍打培養(yǎng)瓶，促使已松動(dòng)的細(xì)胞 從瓶壁脫落。然后用吸管將細(xì)胞從瓶壁吹打下來。移入離心管，1000rpm 離心 10min ，棄上清以去除胰蛋白酶。4、重新懸浮離心完畢后，重新加入培養(yǎng)液約 5ml ，混勻，吹打勿用力過猛，以免傷害細(xì)胞。5、接種按照“1瓶傳 3瓶”

23、的一般原則，細(xì)胞懸液按 1：3的比例分配，接種到 3個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)， 再向各瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液到 5ml，作標(biāo)記后進(jìn)行培養(yǎng)。此后每 3天換液1次，并注意觀察細(xì)胞傳 代培養(yǎng)后的形態(tài)變化。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)初代細(xì)胞的首次傳代是很重要的， 它是建立細(xì)胞系的關(guān)鍵時(shí)期。 首次傳代一般應(yīng)注意以 下幾點(diǎn)：1、細(xì)胞沒有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代。把握好傳代時(shí)機(jī)， 在細(xì)胞生長(zhǎng)到 80% 90%匯合時(shí)傳代最好， 過早傳代細(xì)胞產(chǎn)量少， 過晚傳代細(xì)胞健康狀態(tài)不 佳。2、各種細(xì)胞對(duì)消化的反應(yīng)不同，有的敏感，有的遲鈍，因此應(yīng)根據(jù)所用細(xì)胞特點(diǎn)制定適宜 的消化措施。 有的細(xì)胞附著瓶壁不牢， 用吸管可以從瓶壁上直接

24、吹下來， 但這樣容易傷害細(xì) 胞，細(xì)胞大片脫落， 不易計(jì)數(shù)， 因此， 應(yīng)盡可能采用消化法分散細(xì)胞為妥。 消化傳代良好時(shí)， 細(xì)胞受損害少， 細(xì)胞懸液均勻， 各分裝樣品中數(shù)量誤差小，細(xì)胞生長(zhǎng)速度一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可 靠性大。3、消化液濃度要適宜，過濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反應(yīng)快，所需消化時(shí)間短，掌握不好， 細(xì)胞易流失。用胰蛋白酶與 EDTA 的混合液進(jìn)行細(xì)胞消化時(shí)，要用 Hanks 液充分洗滌細(xì)胞 以去除 EDTA ，因?yàn)?EDTA 的殘留會(huì)影響細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1、肉眼觀察細(xì)胞消化時(shí)培養(yǎng)瓶底部的變化，并與顯微鏡下細(xì)胞的變化相比較，分析出現(xiàn)這 種變化的原因。2、觀察傳代培養(yǎng)后不同時(shí)間細(xì)胞形

25、態(tài)變化，并與原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)七動(dòng)物細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握細(xì)胞的凍存方法2、掌握凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞在低溫凍存時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中的水會(huì)形成冰晶， 造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破 裂。但如果在培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑（如甘油或二甲基亞砜），則可降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，提高膜對(duì)水的通透性， 能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前滲出細(xì)胞外， 在細(xì)胞外形成冰晶， 減少胞內(nèi) 冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。復(fù)蘇時(shí)，為了保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短時(shí)間內(nèi)融化，以避免緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，因此采用快速融化的方法。三、實(shí)驗(yàn)用品 1器材超凈臺(tái)、移液槍（1ml規(guī)格）及相應(yīng)槍頭

26、、吸耳球、吸管、離心管，塑料細(xì)胞凍存管（或用eppendof管代替）、低速離心機(jī)、70C低溫冰箱、液氮罐、水浴鍋（提前開37C）。2、試劑0.25%胰蛋白酶、細(xì)胞凍存液（用含20%牛血清的完全培養(yǎng)液配制的10%二甲基亞砜，或用甘油代替）3、材料培養(yǎng)瓶生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞（在凍存前一天最好傳代或換液1次）,倒棄培養(yǎng)液。2、用胰蛋白酶消化單層生長(zhǎng)的細(xì)胞。3、 消化好的細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管，1000rpm離心10min，棄上清。4、加入凍存液，重懸細(xì)胞。675、 計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞凍存液中的細(xì)胞密度為5X 10個(gè)/ml1 X 10個(gè)/ml。用吸管輕輕吹打細(xì)胞分散均勻，然后分裝

27、入無菌凍存管中，每支2ml凍存管加細(xì)胞懸液1ml。6、凍存管做好標(biāo)記后，放入小袋或凍存管架。7、 依次采用4 C 1小時(shí)，20C 1小時(shí)，70 C過夜，然后投入液氮儲(chǔ)存。（課堂內(nèi)受時(shí) 間限制，采用70 C半小時(shí)，液氮半小時(shí)，僅進(jìn)行模擬）8、 從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞，立即投入37C水浴中，輕搖至完全融化。9、 將凍存管在離心機(jī)上 1000rpm離心10min。10、棄上清，用移液槍加少量培養(yǎng)液入凍存管，輕輕吹打，將其移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，坐好標(biāo) 記。11、放入CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)， 培養(yǎng)至次日時(shí)可換液，以棄去漂浮的死亡細(xì)胞，余下的存活細(xì)胞大部分可生長(zhǎng)繁殖。一般一支凍存管內(nèi)的細(xì)胞接種1瓶，培養(yǎng)3 5

28、d后方能長(zhǎng)好。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1、通過計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞貼壁情況、漂浮的死細(xì)胞等可以判斷凍存效果。2、根據(jù)所學(xué)知識(shí)判斷復(fù)蘇的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)如何。實(shí)驗(yàn)一 總結(jié)1用PPT在理論課講解2節(jié)課（用簡(jiǎn)并的課件，大規(guī)模培養(yǎng)部分沒有講，其他部分能講完） 然后講解分組情況， 1班分 10組， 2班分 9組，按學(xué)號(hào)來。2，每組出 1名學(xué)生到實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)取東西，分發(fā)好的用具后，自行負(fù)責(zé)清洗、滅菌、烘干，在 實(shí)驗(yàn)開始前準(zhǔn)備好。3，但是后來實(shí)驗(yàn)結(jié)束后沒有按組別上交，導(dǎo)致小瓶和瓶塞丟失數(shù)個(gè)，原因是時(shí)間倉促，兩 個(gè)半接連做，沒來得及逐組核對(duì)。4，發(fā)現(xiàn)由學(xué)生自己滅菌還是容易丟失東西實(shí)驗(yàn)二 總結(jié)1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備當(dāng)天提前 1個(gè)小時(shí)去整

29、理實(shí)驗(yàn)室， 發(fā)現(xiàn)超凈臺(tái)紫外燈損壞很多， 只有開房間里的紫外燈整體 殺菌，并把每個(gè)臺(tái)子的風(fēng)機(jī)打開。酒精燈均無，臨時(shí)問陳虹領(lǐng)。超凈臺(tái)共有10 個(gè)，用記號(hào)筆標(biāo)上編號(hào)，讓學(xué)生按組入座。問陳虹借用細(xì)胞計(jì)數(shù)板 10 個(gè)，普通顯微鏡 10臺(tái)。 這次實(shí)驗(yàn)放在同一個(gè)下午做，發(fā)現(xiàn)很緊張，預(yù)計(jì)的1班 13:30-15:30, 但實(shí)際發(fā)現(xiàn)時(shí)間不夠，沒有來得及計(jì)數(shù)，應(yīng)該安排 3 個(gè)小時(shí)為宜。2班抽樣計(jì)數(shù)了 2組，發(fā)現(xiàn)如果用5mL培養(yǎng)液溶解離心后的細(xì)胞（來自2個(gè)雞胚，用3mL胰酶消化了 20min）的話，濃度均在 11 x 106左右，參照此經(jīng)驗(yàn)值，每組將細(xì)胞懸液均進(jìn)一步 稀釋了 8 倍。2物品消耗組數(shù)： 2 個(gè)班共 19 個(gè)組雞胚：實(shí)得 9 日齡雞胚