卵黃囊抗體制備及其應(yīng)用研究進(jìn)展

1、卵黃囊抗體制備及其應(yīng)用研究進(jìn)展         【關(guān)鍵詞】 卵黃囊抗體 卵黃囊抗體即卵黃免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin，IgY)是抗原免疫禽類(lèi)后由卵黃中分離得到的特異性抗體。與哺乳動(dòng)物來(lái)源的IgG比較，卵黃囊抗體具有取材方便、分離純化方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高，同時(shí)具有特異性高、穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷、防         【關(guān)鍵詞】; 卵黃囊抗體 卵黃囊抗體即卵黃免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglob

2、ulin，IgY)是抗原免疫禽類(lèi)后由卵黃中分離得到的特異性抗體。與哺乳動(dòng)物來(lái)源的IgG比較，卵黃囊抗體具有取材方便、分離純化方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高，同時(shí)具有特異性高、穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷、防治等諸多方面得到了廣泛的應(yīng)用，一直是生命科學(xué)相關(guān)科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文就卵黃囊抗體的分離純化方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述。 1; 卵黃囊抗體的基本結(jié)構(gòu)及其性質(zhì) 與哺乳動(dòng)物血清免疫球蛋白相似，卵黃囊抗體的基本結(jié)構(gòu)包括2條輕鏈和2條重鏈，分子量約為180kD。卵黃囊抗體的疏水性大于IgG。Lee和Kim等1,2研究表明，卵黃囊抗體具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)pH及酶等作用引起的失活效應(yīng)有較強(qiáng)的抵抗力。 2; 卵黃囊

3、抗體的制備 21; 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫; Schwarzkopf等3研究結(jié)果表明：經(jīng)皮下注射的方法比肌肉注射能產(chǎn)生更高滴度的抗體，免疫間隔時(shí)間對(duì)抗體的產(chǎn)生影響較大。通常，初次免疫與第一次加強(qiáng)免疫之間的時(shí)間間隔至少4周。另有研究分別于第0d，10周及15周免疫產(chǎn)蛋雞，獲得了高達(dá)1160000的抗體滴度。 22; 卵黃囊抗體的分離; 從卵黃液中分離卵黃囊抗體的關(guān)鍵是除去卵黃中高含量的脂肪及脂蛋白，以獲得水溶性組分(Water Soluble Fraction，WSF)。根據(jù)純度要求、技術(shù)工藝以及對(duì)環(huán)境的影響等因素，可以選擇不同的分離方法。常見(jiàn)分離方法包括以下幾種。 221; 水稀釋法; 先將卵黃液用蒸

4、餾水稀釋10倍，調(diào)整pH值至5052，4靜置6h以上，上清液即為水溶性組分。水稀釋法工藝簡(jiǎn)單，若采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行純化，可獲得較高的回收率和純度。 222; 有機(jī)物沉淀法; 聚乙二醇(PEG)法是較常用的方法。Bizanov和Normantiene4用仙臺(tái)病毒免疫產(chǎn)蛋母雞，收獲高免雞蛋。以TBS作為緩沖液，將卵黃液稀釋4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂類(lèi)，卵黃囊抗體保留在上清液中。應(yīng)用這種方法從每毫升卵黃液中獲得約45mg的特異性卵黃囊抗體，純度達(dá)95%。 223; 有機(jī)溶劑抽提法; 脂類(lèi)易溶于有機(jī)溶劑，可采用氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行分離。用經(jīng)TBS沖洗過(guò)的雞蛋黃制成15ml蛋黃液，

5、加入40ml TBS充分混勻后加入40ml氯仿，冷凍離心，分三相。棄去氯仿層，保留水層，中間的半固體相用40ml TBS萃取，取水層，與前一步水層合并即為水溶性組分。 224; 天然膠法; 一些天然膠如卡拉膠和黃原膠等可用于卵黃抗體分離。將9倍體積的01%(w/v)卡拉膠溶液與卵黃混合，離心得到水溶性組分。也可將卵黃先用雙蒸水稀釋1倍后再與4倍體積的黃原膠混勻，離心即得水溶性組分。使用天然膠法去除脂類(lèi)效果較好，獲得的水溶液中脂類(lèi)含量少于04%。 225; 中鏈脂肪酸法; 辛酸是用于卵黃囊抗體分離最常用的中鏈脂肪酸。蛋黃用去離子水稀釋75倍，混勻，離心，上清液再用醋酸鹽緩沖液稀釋2倍，調(diào)pH值至

6、50，加辛酸至終濃度為1%，靜置分層，卵黃囊抗體在水層中。 227; 超臨界氣體提取法; 該法的基本原理是在高壓下二氧化碳液化，將卵黃中的脂溶性物質(zhì)溶解在其中，并隨氣流帶走。將卵黃粉末裝入超臨界氣體抽提裝置，通入300kg/cm2，40二氧化碳超臨界氣體與卵黃粉末混合，在60kg/cm2，40的減壓條件下，被抽提出的雜質(zhì)與超臨界氣體分開(kāi)而進(jìn)入分離室，即可得到去除脂類(lèi)的卵黃粉末。將去脂的卵黃粉末溶于20倍磷酸鹽緩沖液中，攪拌，離心，即可得水溶性組分。 23; 卵黃囊抗體的提取方法; 提取的目的是將大量卵黃囊抗體從水溶液中分離出來(lái)，得到卵黃抗體。目前主要通過(guò)超濾法或沉淀法來(lái)實(shí)現(xiàn)。沉淀法所用的沉淀劑

7、包括無(wú)機(jī)物、有機(jī)物或有機(jī)溶劑，也可以采用多種方法聯(lián)合沉淀，或者沉淀法和超濾法相結(jié)合的方法提取卵黃囊抗體。 231; 超濾法; 超濾法具有濃縮、除鹽、分級(jí)和純化作用。卵黃囊抗體的分子量約為180kD，在提取時(shí)可采用截流值為100kD的超濾膜。研究表明，在水稀釋法分離后經(jīng)硫酸鈉沉淀，超濾，回收率為98mg卵黃囊抗體/ml蛋黃，純度94%。超濾法具有所需設(shè)備較簡(jiǎn)單、操作方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模工業(yè)化提取卵黃囊抗體。 232; 無(wú)機(jī)物沉淀法; 向含有卵黃囊抗體的水溶液中加入無(wú)機(jī)鹽或無(wú)機(jī)鹽過(guò)飽和溶液，使卵黃囊抗體在高鹽條件下鹽析。常用的無(wú)機(jī)鹽有硫酸鈉和硫酸銨。Kritratanasak等7利用硫酸銨鹽

8、析法成功獲得較高純度的抗鼠IgG卵黃抗體(IgYantimouse IgG)，每個(gè)雞蛋可收獲約40mg卵黃囊抗體。采用無(wú)機(jī)鹽沉淀后所得固體，一般需經(jīng)半透膜透析以除去殘留的鹽分。Ko和Ahn8比較了硫酸銨沉淀法及離子交換法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者所制備的卵黃囊抗體純度高于后者，而且適合于大量樣品的制備。 233; 有機(jī)物及有機(jī)溶劑沉淀法; Polson最初的PEG法采用終濃度為35%的PEG 6000對(duì)卵黃進(jìn)行分離獲得水溶性組分，用12%PEG進(jìn)行沉淀，沉淀物經(jīng)磷酸鹽緩沖液溶解后再用12%PEG沉淀，得到卵黃囊抗體。之后，Polson9對(duì)此方法加以改進(jìn)，先后經(jīng)12%PEG和-20的50%乙醇兩步沉淀法獲

9、得卵黃囊抗體，蛋黃回收率49mg/ml，純度89%。卵黃囊抗體的提取一般采用聯(lián)合沉淀法，即利用不同的沉淀劑對(duì)水溶性組分經(jīng)過(guò)2次或多次沉淀，從而獲得純度較高的卵黃囊抗體。 24; 卵黃囊抗體的純化方法; 為了滿(mǎn)足不同的使用目的，許多情況下需對(duì)提取的卵黃囊抗體進(jìn)一步純化，除去其中的雜蛋白、鹽或其他雜質(zhì)，獲得高純度的卵黃囊抗體。目前主要采用層析方法純化卵黃囊抗體，包括凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析以及親和層析等。 241; 凝膠過(guò)濾層析; 主要利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分子篩作用，可根據(jù)被分離物的分子大小不同選擇不同的凝膠介質(zhì)進(jìn)行層析。卵黃囊抗體純化時(shí)，常用交聯(lián)葡聚糖作為凝膠層析介質(zhì)。研究人員對(duì)PEG法分離

10、獲得的卵黃抗體采用疏水層析(HIC)和凝膠過(guò)濾(GF)兩步法純化，產(chǎn)物純度較高。1ml含58mg卵黃抗體的稀釋液，經(jīng)過(guò)PEG分離、HIC和GF處理后，卵黃抗體含量依次為35，47和12mg。 242; 離子交換層析; 純化卵黃囊抗體時(shí)多采用以葡聚糖交聯(lián)的弱堿性陰離子交換劑DEAE為載體，磷酸鹽緩沖液作為吸附洗脫體系進(jìn)行分離純化。用DEAESephacel柱層析可獲得純度為98%卵黃囊抗體，每個(gè)雞蛋黃可收獲70100mg卵黃囊抗體。 243; 親和層析; 純化卵黃囊抗體采用的親和層析方法包括親硫?qū)游?、固相金屬離子親和層析、合成配體親和層析以及免疫親和層析等。 244; 方法應(yīng)用比較; 綜上所述，經(jīng)過(guò)分離和提取方法通常就可以得到純度較高的卵黃抗體。衡量一個(gè)制備方法的優(yōu)劣要考慮分離、提取和純化的全過(guò)程，從工藝路線(xiàn)、工藝條件以及回收率和純度等方面綜合評(píng)價(jià)。從工藝路線(xiàn)上看，水稀釋法(WD法)、卡拉膠法(CAR法)、超臨界氣體提取法(SFE法)和硫酸銨法(AMS法)工藝路線(xiàn)較短，而其他方法需兩步