大環(huán)內(nèi)酯類抗生素糖基合成及生物學(xué)功能

1、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素糖基合成及生物學(xué)功能         【摘要】  大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)構(gòu)中的糖基基團(tuán)在抑菌、生產(chǎn)菌自我保護(hù)和調(diào)控大環(huán)內(nèi)酯類抗生素內(nèi)酯環(huán)合成方面有著重要的生物學(xué)功能。了解糖基的合成途徑、糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和糖基生物學(xué)功能對(duì)研制新結(jié)構(gòu)抗生素，解決當(dāng)前日益嚴(yán)重的致病菌耐藥性問(wèn)題起著重             【摘要】; 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)構(gòu)中的糖基基團(tuán)在抑菌、生產(chǎn)菌自我保護(hù)和調(diào)

2、控大環(huán)內(nèi)酯類抗生素內(nèi)酯環(huán)合成方面有著重要的生物學(xué)功能。了解糖基的合成途徑、糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和糖基生物學(xué)功能對(duì)研制新結(jié)構(gòu)抗生素，解決當(dāng)前日益嚴(yán)重的致病菌耐藥性問(wèn)題起著重要的指導(dǎo)作用。通過(guò)基因工程的方法改造糖基，已經(jīng)合成了一系列具有抗菌活性的新結(jié)構(gòu)化合物。本文就目前所了解的糖基合成途徑、糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和糖基重要生物學(xué)功能做一綜述，并簡(jiǎn)單介紹基因工程改造糖基合成新結(jié)構(gòu)抗生素的研究進(jìn)展。 【關(guān)鍵詞】; 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 糖基 生物學(xué)功能 結(jié)構(gòu)改造 ; Glycosyl synthesis and biofunction of macrolide antibiotics ; ABSTRACT;

3、 The review summarized synthesis pathway of glycosyl linked to macrolide antibiotics, the structure feature of their glycosytransferase and glycosyl biofunction of macrolide antibiotics, and briefly introduced progress in modifying glycosyl to synthsize novel structure antibiotics by genetic enginee

4、ring. ; KEY WORDS; Macrolide antibiotics; Glycosyl; Biofunction; Structure modification ; 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)命名的廣譜抗生素，由多元內(nèi)酯環(huán)和后修飾基團(tuán)相連而成。根據(jù)內(nèi)酯環(huán)碳原子數(shù)目不同，可分為1216元環(huán)抗生素，其中，在臨床上最重要、最常見(jiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有12元環(huán)的酒霉素(methymycin)、苦霉素(pikro?mycin)，14元環(huán)的紅霉素(erythromycin)、竹桃霉素(oleandomycin)，15元環(huán)的阿奇霉素(azithromycin)和16元環(huán)的螺旋霉素(spi

5、ramycin)、泰洛星(tylosin)等。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素合成過(guò)程中要經(jīng)過(guò)一些后修飾，如羥基化、甲基化和糖基化等14，這些后修飾基團(tuán)都有著重要的生物學(xué)功能，其中，通過(guò)糖基化后修飾連接于內(nèi)酯環(huán)上的糖基特別是脫氧糖基參與靶位點(diǎn)的分子識(shí)別作用，是抗生素表現(xiàn)抗菌活性的必要組成成分。近幾年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在研究抗生素某些合成基因功能的時(shí)候，又發(fā)現(xiàn)了內(nèi)酯環(huán)上連接的糖基的其它生物學(xué)功能，雖然目前還不清楚其中有些糖基生物學(xué)功能的確切機(jī)理， 但了解了這些生物學(xué)功能對(duì)解決當(dāng)前日益嚴(yán)重的致病菌耐藥性問(wèn)題，研制新結(jié)構(gòu)抗生素起著重要的指導(dǎo)作用。通過(guò)基因工程改造糖基合成一系列具有抗菌活性新結(jié)構(gòu)物質(zhì)的研究已

6、取得了一定進(jìn)展。本文就目前所了解的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素上連接糖基的合成途徑，糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，糖基在抑菌、生產(chǎn)菌自我保護(hù)和調(diào)控大環(huán)內(nèi)酯類抗生素內(nèi)酯環(huán)合成方面的生物學(xué)功能做一綜述，簡(jiǎn)單介紹基因工程改造糖基合成具有抗菌活性新結(jié)構(gòu)物質(zhì)的研究進(jìn)展。 ; 1; 糖基合成途徑及其轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ; 連接于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素內(nèi)酯環(huán)上的后修飾糖基基團(tuán)大部分屬于6?脫氧己糖(6?deoxyhexose，6?DOHS)，以2，6?脫氧己糖(2，6?dideoxyhexose)居多，迄今至少有80種不同的6?DOHS被報(bào)道57，其中大多數(shù)參與構(gòu)成不同的抗生素。在臨床上常見(jiàn)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素上連接的脫氧糖基有D?紅霉

7、糖胺(desasomine)、L?夾竹桃糖L?oleandrose)和D?碳霉糖(D?mycaminose)等等(表1)。 目前這些脫氧糖生物合成過(guò); 表1; 幾種常見(jiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素上連接的脫氧糖 ; 糖基添加到內(nèi)酯環(huán)上需要糖基轉(zhuǎn)移酶的作用。許多大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的糖基轉(zhuǎn)移酶具有底物靈活性的特點(diǎn)。根據(jù)其針對(duì)的底物靈活性不同，可把糖基轉(zhuǎn)移酶分為對(duì)脫氧糖具有靈活性、對(duì)底物內(nèi)酯環(huán)具有靈活性、對(duì)脫氧糖和內(nèi)酯環(huán)都具有靈活性三種。已報(bào)道對(duì)底物糖基具有靈活性的糖基轉(zhuǎn)移酶有OleG2、對(duì)底物內(nèi)酯環(huán)具有靈活性的糖基轉(zhuǎn)移酶有DesvII、TylM2、MycB等1012，而糖多孢紅霉菌中的eryCIII編碼的紅霉糖

8、胺糖基轉(zhuǎn)移酶卻具有相對(duì)嚴(yán)格的底物特異性13。研究發(fā)現(xiàn)這些糖基轉(zhuǎn)移酶在一級(jí)結(jié)構(gòu)序列上幾乎不具相似的保守性，卻具有高級(jí)結(jié)構(gòu)上相似性：有雙葉狀的兩個(gè)結(jié)合域，一個(gè)是具有親核性內(nèi)酯環(huán)骨架的結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)是具有親電性NDP?糖的結(jié)合位點(diǎn)14。轉(zhuǎn)移糖基的過(guò)程也就是NDP?糖捕獲內(nèi)酯環(huán)的過(guò)程。在利用整合生物合成的方法合成新結(jié)構(gòu)抗生素方面，具有底物靈活性糖基轉(zhuǎn)移酶是一種重要的工具。近年來(lái)隨著生物技術(shù)發(fā)展，對(duì)其編碼基因的深入了解，可以通過(guò)突變、敲除等方法來(lái)改變糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合域的特異性，產(chǎn)生更多具有底物靈活性轉(zhuǎn)移酶，為合成新結(jié)構(gòu)抗生素提供有力工具15。 ; 2; 糖基的生物學(xué)功能 ; 2.1; 活化內(nèi)酯環(huán)的作用

9、; 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素內(nèi)酯環(huán)本身沒(méi)有抑菌活性，要經(jīng)過(guò)后修飾基團(tuán)如甲基、羥基、糖基等活化后才具有抗菌活性14。其中糖基尤其氨基糖基是活化內(nèi)酯環(huán)關(guān)鍵性基團(tuán)，在抑菌方面起著關(guān)鍵性作用(以紅霉素和泰洛星為例說(shuō)明)。 ; 14元環(huán)的紅霉素主要通過(guò)與核糖體50S亞型的23S rRNA的domainV結(jié)構(gòu)域A2058位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄階段的肽早熟性分離和阻礙新生肽的釋放來(lái)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。與A2058結(jié)合的是紅霉素內(nèi)酯環(huán)C?5位紅霉糖胺的2?OH16。A2058的殘基N1離domainV中二脫氧?D(L)?己糖合成路徑細(xì)菌生長(zhǎng)。與A2058結(jié)合的是紅霉素內(nèi)酯環(huán)C?5位紅霉糖胺的2?OH16。A2058的殘基N1離

10、domainV中心A2451位點(diǎn)大約有15nm的距離，A2451是肽酰轉(zhuǎn)移酶催化中心的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)合成的新生肽鏈長(zhǎng)度達(dá)到35個(gè)氨基酸時(shí)，紅霉素通過(guò)與A2058位置結(jié)合阻斷肽鏈的延伸，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄階段的肽早熟性分離。位點(diǎn)A2058又是靠近肽酰轉(zhuǎn)移酶的底部，并且在新生肽釋放隧道的入口處，結(jié)合在此位點(diǎn)上紅霉素分子又會(huì)有效地阻礙新生肽的釋放。 ; 16元環(huán)泰洛星作用機(jī)理是通過(guò)影響肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)阻礙新生肽的肽鍵形成，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。泰洛星內(nèi)酯環(huán)上連接的二糖上的mycarose是其活性所必不可少的基團(tuán)，缺乏mycarose會(huì)使泰洛星失去抑制細(xì)菌蛋白合成的能力17。研究發(fā)現(xiàn)mycarose的結(jié)合位點(diǎn)是U25

11、0618，U2506與肽酰轉(zhuǎn)移酶(tRNAPhe)3端的2N3A76在P位點(diǎn)上的結(jié)合位點(diǎn)橫穿連接19，而U2506又距離domainV中心位點(diǎn)A2541(A2451是肽酰轉(zhuǎn)移酶催化中心的結(jié)合位點(diǎn))只有大約90nm。由于空間距離上的靠近，使內(nèi)酯環(huán)上連接的另外一個(gè)糖基mycinose直接干涉了肽酰轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)，阻礙新生肽肽鍵形成，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。 ; 2.2; 調(diào)節(jié)內(nèi)酯環(huán)合成的作用 ; 泰樂(lè)酮(tylactone)內(nèi)酯環(huán)上連接的碳霉糖糖基具有調(diào)節(jié)內(nèi)酯環(huán)合成的作用，是1997年Fish等20在研究泰洛星產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌(S.fradiae)中的碳霉糖轉(zhuǎn)移酶基因tylM2功能時(shí)候發(fā)現(xiàn)的。Fish發(fā)現(xiàn)敲除

12、基因tylM2的弗氏鏈霉菌不能合成內(nèi)酯環(huán)泰樂(lè)酮，當(dāng)只有外加碳霉糖基化的泰樂(lè)酮或其它連有碳霉糖基的抗生素后，弗氏鏈霉菌才恢復(fù)合成泰樂(lè)酮的能力。在弗氏鏈霉菌的染色體上，tylM2處于泰樂(lè)酮合成基因tylG和調(diào)控基因tylR的下游，基因tylM2的敲除可能不會(huì)直接影響tylG和tylR的表達(dá)，但可能會(huì)影響調(diào)控基因tylR表達(dá)的調(diào)控因子TylR的功能。推測(cè)碳霉糖基化的泰樂(lè)酮可能是作為調(diào)控蛋白TylR的一個(gè)輔因子，與調(diào)控蛋白結(jié)合，共同調(diào)節(jié)tylG表達(dá)20，21，但是對(duì)于具體調(diào)控機(jī)理至今未有文獻(xiàn)報(bào)道。 ; 同樣的調(diào)控機(jī)理可能也存在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素spinosad的生產(chǎn)菌S.spinosa中，鼠李糖(rha

13、mnose)是第一個(gè)連接到spinosad內(nèi)酯環(huán)上的糖基，當(dāng)敲除L?鼠李糖基(L?rhamnosyl)轉(zhuǎn)移酶基因spnG后，生產(chǎn)菌沒(méi)有spinosad和其它前體的合成22，同樣，當(dāng)加入外源的糖基化前體后，菌株恢復(fù)合成spinosad和其內(nèi)酯環(huán)的能力，具體的調(diào)控機(jī)理也不清楚。 ; 2.3; 失活抗生素的作用 ; 某些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素生產(chǎn)菌為防止抗生素對(duì)自身致死性作用，進(jìn)行自我保護(hù)，需要具有失活抗生素的作用。就目前所了解，這種失活抗生素作用的機(jī)制有三種：對(duì)細(xì)菌核糖體上的抗生素結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行甲基化或磷酸化等修飾機(jī)制；加速抗生素外排機(jī)制；糖基化失活抗生素機(jī)制。其中，第三種是生產(chǎn)菌對(duì)抗生素內(nèi)酯環(huán)上6?脫氧

14、己糖做進(jìn)一步糖基化修飾以失活抗生素。這種自我保護(hù)機(jī)制最初在淡青紫鏈霉菌(S.lividans)中發(fā)現(xiàn)23。之后又在竹桃霉素的產(chǎn)生菌抗生素鏈霉菌(S.antibioticus)、酒霉素和新酒霉素(neome?thymycin)產(chǎn)生菌委瑞內(nèi)拉鏈霉菌(S.venezuelae)中發(fā)現(xiàn)24?，F(xiàn)已知道，在32種生產(chǎn)聚酮類抗生素的鏈霉菌中有15種存在這種抗性機(jī)制25。下面就以抗生素鏈霉菌為例來(lái)說(shuō)明這種作用機(jī)制。 ; 在抗生素鏈霉菌中，糖基化作用是以UDP?葡萄糖為糖基的供體，在位于細(xì)胞質(zhì)中的糖基轉(zhuǎn)移酶OleI作用下，對(duì)竹桃霉素內(nèi)酯環(huán)C?5位單糖夾竹桃糖的2?OH進(jìn)行糖基化修飾。2?OH是與核糖體靶位點(diǎn)結(jié)合

15、的功能性基團(tuán)，修飾后葡萄糖基阻礙了2?OH與靶位點(diǎn)的結(jié)合，致使竹桃霉素失去活性。同時(shí)，分泌到細(xì)胞外的竹桃霉素在胞外?糖苷脫糖基酶OleR作用下脫去2?OH上的糖基26，重新得到活化。正是這種糖基化修飾與脫糖基化平衡機(jī)制的存在，為抗生素生產(chǎn)菌提供了自我保護(hù)，而又不會(huì)使合成的抗生素永久性失活。 ; 3; 改造糖基的研究進(jìn)展 ; 一些糖基與抗生素的活性密切相關(guān)，可以通過(guò)基因工程對(duì)糖基進(jìn)行改造，合成新結(jié)構(gòu)的抗生素，來(lái)解決當(dāng)前日益嚴(yán)重的致病細(xì)菌耐藥性問(wèn)題。其方法歸納起來(lái)有三種：改變脫氧糖基結(jié)構(gòu)；替換連接的糖基；去除糖基。 ; 3.1; 通過(guò)基因工程改變脫氧糖基結(jié)構(gòu) ; 隨著對(duì)抗生素上連接的糖基特別是脫氧

16、糖基合成過(guò)程和具有靈活性的糖基轉(zhuǎn)移酶的了解，可以通過(guò)兩種方法來(lái)改變脫氧糖基結(jié)構(gòu)，一是通過(guò)表達(dá)外源基因?qū)γ撗跆腔鲞M(jìn)一步的修飾。1999年Zhao等27通過(guò)對(duì)紅霉糖胺進(jìn)一步的氨基化修飾合成了新結(jié)構(gòu)紅霉素衍生物。Gaisser28將來(lái)源于S.spinosa的甲基化酶基因spnI和spnK轉(zhuǎn)入糖多孢紅霉菌突變體SGT2中時(shí)，可把3?O?鼠李糖?紅霉內(nèi)酯B轉(zhuǎn)化成3?O?(2"?O?甲基鼠李糖)?紅霉內(nèi)酯B和3?O?(2"，3"?雙?O?甲基鼠李糖)?紅霉內(nèi)酯B。如在糖多孢紅霉菌SGT2中再轉(zhuǎn)入eryCIII，則可以合成3?O?(2"，3"?雙?O?甲基

17、鼠李糖)?紅霉素D。二是失活糖基的某些合成基因。酒霉素上連接有紅霉糖胺，敲除其相關(guān)合成基因desI、desII，利用糖基轉(zhuǎn)移酶DesVII具有底物靈活性的特點(diǎn)，合成了一些紅霉糖胺結(jié)構(gòu)改變的酒霉素類似物29，30。紅霉素含有mycarose和紅霉糖胺兩種脫氧糖，它們的合成和轉(zhuǎn)移分別由6個(gè)eryB和6個(gè)eryC基因控制。通過(guò)破壞基因eryBII、eryBIII、eryBIV、eryBV和eryBVII，合成了mycarose結(jié)構(gòu)改變的紅霉素類似物31，32；而破壞eryCIV則獲得了帶羥基紅霉糖胺的紅霉素A、B和C的衍生物31。 ; 3.2; 通過(guò)基因工程替換連接的糖基 ; Doumith33在研

18、究基因oleP1、oleG1和oleG2生物功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)oleG2編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶OleG2可以將鼠李糖連接到6?dEB或EB的C?3位，合成C?3位為鼠李糖的新結(jié)構(gòu)紅霉素衍生物。2000年Aguirrezabalaga等34也在鑒定L?夾竹桃糖合成基因的時(shí)候合成了3?L?olivosyl?紅霉內(nèi)酯B等具有生物活性的抗生素。隨后Gaisser35不僅證實(shí)了OleG2是個(gè)具有底物靈活性糖基轉(zhuǎn)移酶，而且發(fā)現(xiàn)將來(lái)源于弗氏鏈霉菌的tylM2整合于糖多孢紅霉菌突變體染色體上時(shí)，可以將外加的16?元環(huán)泰樂(lè)酮進(jìn)行紅霉糖胺糖基修飾。2004年Ward等36利用TylM2具有底物靈活性的特點(diǎn)，將chalcomy

19、cin的合成基因表達(dá)于突變的弗氏鏈霉菌株中，合成了將C?5位D?查耳糖(D?chalcose)替代為碳霉糖且C?3位為羰基16元環(huán)的類似物。 ; 2001年Tang等37利用紅霉糖胺轉(zhuǎn)移酶DesVII具有底物靈活性的特點(diǎn)，將來(lái)源于委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的紅霉糖胺糖合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶基因整合到淡青紫鏈霉菌K4?114染色體上，構(gòu)建了淡青紫鏈霉菌K39?22菌株,該菌株將添加到培養(yǎng)基中的narbonolide、10?deoxymethylnolide、6?dEB、3?keto?6?dEB進(jìn)行紅霉糖胺糖修飾，合成了具有生物活性的物質(zhì)。2004年Hong等38在委瑞內(nèi)拉鏈霉菌突變株內(nèi)，利用具有底物靈活性的糖基

20、轉(zhuǎn)移酶DesVII，將來(lái)源于竹桃霉素合成菌株的TDP?4?keto?6?deoxy?D?glucose和urdamycin合成菌株的TDP?D?olivose添加到外加的12?和14?元環(huán)的內(nèi)酯環(huán)上，合成了異鼠李糖(quinovose)或olivose糖基化的10?去氧微甘菊內(nèi)酯(10?deoxymethynolide)和narbonolide活性物質(zhì)。2006年Jung等39將泰樂(lè)酮合成基因tylG表達(dá)于突變的委瑞內(nèi)拉鏈霉菌突變株內(nèi)，在糖基轉(zhuǎn)移酶DesVII作用下，合成了紅霉糖胺糖基化的泰樂(lè)酮。 ; 3.3; 通過(guò)基因工程去除糖基 ; 原來(lái)認(rèn)為紅霉素C?3位克拉定糖(cladinose)是抗菌活性的必需基團(tuán)，C?3脫糖即意味著活性下降。1977年，Allen40證明了C?3位克拉定糖并不是紅霉素抗菌活性所必須的基團(tuán)，它的存在可誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生MLSB抗性。通過(guò)化學(xué)方法把C?3位克拉定糖水解，氧化為羰基，再進(jìn)一步修飾所得到的以泰利霉素(telithromycin)為代表的酮內(nèi)酯類抗生素依然保持著良好的抗菌活性，且對(duì)多種耐藥菌有效。這為通過(guò)基因工