局灶性腦缺血后鼠腦組織tPA基因表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡

1、    局灶性腦缺血后鼠腦組織tPA基因表達(dá) 及其與細(xì)胞凋亡        摘要：目的探討局灶性腦缺血后組織型纖溶酶原激活物(tPA)基因的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法用原位雜交和免疫組織化學(xué)方法檢測tPA基因在大鼠局灶性腦缺血(大腦中動脈阻塞)后的表達(dá)，用TUNEL法檢測缺血不同時間的細(xì)胞凋亡狀況。結(jié)果腦缺血6h缺血中心部位的膠質(zhì)細(xì)胞和梗死灶周邊缺血半影區(qū)的神經(jīng)元均觀察到tPA免疫反應(yīng)性信號，在大腦皮層后肢體區(qū)、頂皮層區(qū)、海馬區(qū)和齒狀回可見凋亡細(xì)胞，但缺血18h

2、缺血側(cè)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞未見tPA免疫反應(yīng)性信號，僅齒狀回有凋亡細(xì)胞。結(jié)論tPA蛋白在腦缺血6h缺血側(cè)表達(dá)增高，局灶性腦缺血后神經(jīng)元死亡有細(xì)胞凋亡的參與，該凋亡可能與tPA基因表達(dá)和缺血時間有一定關(guān)聯(lián)。關(guān)鍵詞：組織型纖溶酶原激活物；腦缺血；表達(dá)；基因分類號：Q344+.13； Q255文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0529-1356(2000)01-13EXPRESSION OF tPA GENE AND CELL APOPTOSIS FOLLOWINGFOCAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RATPAN Yong(Department of Pharmacology)ZHENG Su-

3、qiu(Department of Pharmacology)XIE Mian(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)XIE Yuan-yun(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)LIN Yi-li(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Scien

4、ces,Guangzhou 510089;China)YAN Guang-mei(Department of Pharmacology)Abstract：ObjectiveTo study the expression of tissue plasminogen activator(tPA) gene and the relationship with cell apoptosis following focal cerebral ischemia in rat.MethodsThe samples of focal cerebral ischemia(middle cerebral arte

5、ry occlusion,MCA occlusion) were analyzed by using in situ hybridization (ISH) and immunohistochemical(IHC) methods.Apoptotic neurons were detected by using TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).ResultsIn the rats 6h after MCA occlusion,posititive immunostaining of tPA was detected in endothel

6、ial cells of small blood vessels,meninges,chorioid,in the glial cells at the zone of ischemic core and neurons at the infarct border zone,apoptotic cells were observed in parietal and hindlimb cerebral cortex,hippocumpus and dentate gyrus,but in the rats 18h after MCA occlusion,immunoreactivity of t

7、PA was not detected in the neurons and glial cells of the ischemic hemisphere,and apoptotic cells were only found in dentate gyrus.ConclusionsExpression of tPA protein in ischemic site 6h after MCA occlusion is higher than that of nonischemic site.Cell apoptosis was involved in neuronal death follow

8、ing focal cerebral ischemia,and the apoptosis might be related with expression of tPA gene and the time after cerebral ischemia.Key words：tPA;Ischemia;Expression;Gene缺血性腦損傷神經(jīng)元死亡的方式主要有壞死和凋亡兩種不同的機(jī)制。近年研究表明，細(xì)胞凋亡與多種絲氨酸(Ser)蛋白酶及其抑制物有關(guān)1，2。組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)是一種Ser蛋白酶，能催化無活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)變成

9、有活性的纖溶酶，使血栓溶解。tPA也是腦內(nèi)主要的纖溶酶原激活物3，它在神經(jīng)組織的異常表達(dá)與神經(jīng)元退變和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)4，5。但tPA通過何種途徑引起中樞神經(jīng)元退化?尚不清楚。國內(nèi)未見類似報道。鑒于臨床可能廣泛應(yīng)用tPA治療中風(fēng)患者，我們研究了腦缺血后tPA基因的表達(dá)及其是否涉及腦缺血后的神經(jīng)元死亡，為進(jìn)一步研究腦缺血后神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制及尋求有效的臨床防治提供科學(xué)依據(jù)。材料和方法1.主要實驗儀器及試劑TTC(Sigma公司，美國)、DIG寡核苷酸尾部標(biāo)記試劑盒、DIG檢測試劑盒和POD原位死亡檢測試劑盒(寶靈曼公司，德國)，PAM-tPA單克隆抗體(Diamercan公司，美國)，SP

10、免疫組織化學(xué)試劑盒(邁新公司，進(jìn)口分裝，廣州)，UVP-GDS 8000凝膠成像系統(tǒng)(英國)。2.制備鼠局灶性腦缺血模型采用中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，230300g，隨機(jī)分為兩組：缺血組和正常對照組。缺血組采用線栓法制備鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞模型6。先用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)將鼠麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺上，經(jīng)頸正中切口分離暴露右側(cè)頸總動脈，在頸總動脈分叉處插入栓子(直徑約為0.15mm的尼龍線)，栓子前端到達(dá)頸內(nèi)動脈及遠(yuǎn)端，阻斷大腦中動脈的血流。術(shù)后約1h實驗鼠蘇醒，出現(xiàn)左前肢屈曲和前進(jìn)時向左側(cè)劃圈，證明右側(cè)大腦中動脈阻塞成功。實驗鼠按處

11、死時間又分為6h(n=6)和18h(n=6)。用2%氯化三本四氮唑(TTC)染色以證實腦缺血灶的存在，冰凍切片或蠟片用于原位雜交、免疫組織化學(xué)和細(xì)胞凋亡檢測。3.原位雜交3.1探針合成：根據(jù)帶有tPAcDNA序列的PGEM-1質(zhì)粒譜設(shè)計tPA探針，其序列為：GAT GCC CTG GCC CTG GAA GCA GGT TGC TCT GGT ATG TAT ACT由上海申工生物公司合成。3.2探針標(biāo)記：按DIG寡核苷酸尾部標(biāo)記試劑盒指示進(jìn)行標(biāo)記。3.3ISH(參照文獻(xiàn)7)：將鼠冰凍冠狀切片，片厚20m，預(yù)處理后與DIG標(biāo)記的寡核苷酸探針42雜交(50l雜交液/片，探針濃度300g/L)121

12、6h。清洗后在14 000堿性磷酸酶標(biāo)記的DIG抗體中溫育40min，加入NBT和BCIP顯色液室溫避光染色3h，用PBS緩沖液終止反應(yīng)，核固紅復(fù)染。取正常鼠腎冰片作為陽性對照。4.免疫組織化學(xué)SP法8蠟片脫蠟和水化后，加50l過氧化物酶阻斷液；PBS沖洗；再加50l非免疫性動物血清室溫孵育20min;PBS沖洗；加PAM-3tPA單抗室溫孵育1h;再加生物素結(jié)合的二抗，室溫孵育30min；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液孵育30min。DAB染色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陰性對照用正常羊血清取代第一抗體，其余步驟同上。5.TUNEL(TdT介導(dǎo)dUTP-X末端標(biāo)記)染色按原位

13、死亡檢測試劑盒指示進(jìn)行。蠟片脫水后，經(jīng)蛋白酶K處理后在TdT(末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶)與熒光素連接的核苷酸混合液37孵育45min，PBS沖洗兩次，再加HRP連接的抗熒光素抗體，37溫育60min。DAB顯色，核快紅復(fù)染，封片，鏡下分析。陰性對照不加TdT。結(jié)果1.形態(tài)學(xué)觀察TTC染色顯示正常鼠腦組織著深紅色，梗塞灶為蒼白色，位于右側(cè)額、頂、顳葉皮層(1)。TTC染色蠟片顯示缺血灶位于大腦皮層后肢體區(qū)、頂皮層區(qū)和基底節(jié)區(qū)(2)。HE染色缺血區(qū)許多細(xì)胞嗜伊紅，細(xì)胞核固縮深染，核仁消失，胞漿疏松，染色變淺，細(xì)胞水腫，邊界不清，有變性和壞死發(fā)生。缺血18h皮層變性壞死較6h更為明顯。對照組無梗塞灶的出

14、現(xiàn)。    1局灶性腦缺血6h,TTC染色顯示正常鼠腦組織著深紅色(a)，缺血側(cè)為蒼白色(b)Fig.1In rat brain at 6h after MCA occlusion by TTC saining .normal ischemic site is pink(a),ischemic site is pale(b).    2TTC染色局灶性腦缺血6h腦片，表明缺血灶位于大腦皮層后肢體區(qū)、頂皮層區(qū)和基底節(jié)區(qū)Fig.2In coronal section of central nervous system

15、in rats at 6h after MCA occlusion .Ischemic region lies to parietal and hindlimb cerebral cortex,basal ganglia by TTC saining.2.tPAmRNA的表達(dá)原位雜交除極少數(shù)毛細(xì)血管呈現(xiàn)紫藍(lán)色陽性信號外，在鼠腦組織均未見陽性信號。鑒于對照腎冰片ISH顯示部分陽性信號，本實驗用非放射性ISH在腦組織未檢測到tPA陽性雜交信號，可能與其表達(dá)量太低有關(guān)，與Kittaka等9的報道類似。3.tPA蛋白的分布免疫反應(yīng)性細(xì)胞呈棕色，清晰可見，背景呈淡灰色。局灶性腦缺血6h腦片在腦膜、脈絡(luò)膜

16、、小血管內(nèi)皮均可見tPA免疫反應(yīng)性細(xì)胞，在細(xì)胞漿內(nèi)呈棕色顆粒狀，缺血側(cè)中心區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞和梗死灶周圍的缺血半影區(qū)的神經(jīng)元也顯示tPA強(qiáng)免疫反應(yīng)性信號(3a,b)，但小腦、海馬區(qū)未見tPA免疫反應(yīng)性信號。缺血18h梗塞側(cè)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞均未見免疫反應(yīng)性信號。    3局灶性腦缺血6ha.缺血中心部位的膠質(zhì)細(xì)胞顯示tPA免疫反應(yīng)性信號；b.梗死周邊區(qū)的神經(jīng)元顯示tPA免疫反應(yīng)性信號×200Fig.3In coronal paraffin section of central nervous system in rats at 6h afeter MC

17、A occlusion.a,Immunocytochemical demonstration of tPA positive signal in glias of the zone of ischemic core.b,Immunocytochemical demonstration of t PA positive signal in neurons of infarct border zone.×200    4用TUNEL法檢測局灶性腦缺血6h蠟片a.大腦皮層細(xì)胞顯示凋亡陽性信號；b.陰性對照片×200Fig.4Histolog

18、ical features of apotosis in coronal paraffin sections in rats at 6h after MCA occlusion .a,apoptotic cells (arrow)are present among cerebral cells by TUNEL method ,b,negative control.×2004.TUNEL檢測腦缺血側(cè)缺血6h：在大腦皮層后肢體區(qū)、頂皮層區(qū)、海馬和齒狀回均可見散在的凋亡細(xì)胞(4a,b)，免疫反應(yīng)性信號局限在細(xì)胞核內(nèi)，對側(cè)僅見極少數(shù)凋亡細(xì)胞；缺血18h僅在齒狀回有散在的凋亡細(xì)胞，正常側(cè)未見

19、凋亡細(xì)胞。討論tPA是腦內(nèi)主要的絲氨酸蛋白酶，腦缺血后tPA與神經(jīng)元死亡的關(guān)系已日益引起人們的重視。tPA基因是一種即刻早期基因。在腦組織，驚厥發(fā)作、刺激引起癲癇樣后放電和短暫高頻刺激通道引起長時程增強(qiáng)(LTP)，均可使tPA在全腦和局部增加10。Wang等11給tPA-/-鼠或野生鼠靜注tPA,MCA阻塞后，tPA-/-鼠和野生鼠梗死范圍均有不同程度的增加，提示外源性tPA可增加誘導(dǎo)中風(fēng)樣的損傷。Tsirka等12用tPA抗體顯示tPA存在于小鼠CA2CA3海馬亞區(qū)和齒狀回的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞，注射海人藻酸(KA)可引起tPA在同側(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，表明tPA表達(dá)具有可誘導(dǎo)性。本實驗在大鼠

20、局灶性腦缺血6h的蠟片，發(fā)現(xiàn)腦膜、脈絡(luò)膜、小血管內(nèi)皮細(xì)胞和缺血側(cè)中心區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞和梗死灶周圍的缺血半影區(qū)神經(jīng)元均顯示tPA免疫反應(yīng)性信號，而缺血18h缺血側(cè)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞則未見免疫反應(yīng)性信號，僅腦膜、脈絡(luò)膜、小血管內(nèi)皮細(xì)胞有免疫反應(yīng)性信號，該反應(yīng)主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，與蛋白合成部位相符，證實這些部位有tPA蛋白的存在。tPA蛋白在腦損傷6h左右高表達(dá)，它在受損神經(jīng)細(xì)胞中的超量表達(dá)具有可誘導(dǎo)性，缺血可誘發(fā)tPA蛋白表達(dá)，由于tPA是早期反應(yīng)性基因，出現(xiàn)時間相對較早，故缺血18h則未見tPA蛋白在神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。腦缺血6h缺血中心區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞和梗死灶周圍缺血半影區(qū)的神經(jīng)元均顯示tPA強(qiáng)免疫反應(yīng)性信號，

21、提示該區(qū)在MCA缺血損傷中為神經(jīng)元選擇性易損部位，因神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞可能對缺血的敏感性不同，前者對缺血的耐受性較差，導(dǎo)致缺血中心部位的神經(jīng)元死亡，故只能觀察到膠質(zhì)細(xì)胞，而梗死灶周邊缺血半影區(qū)缺血程度相對較輕，大部分神經(jīng)元仍然存活，因而可觀察到兩種細(xì)胞。正常區(qū)域神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞未見免疫反應(yīng)性信號，可能是tPA蛋白在正常神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)量較低。Murtomaki等5用IHC法在Weaver鼠小腦粒細(xì)胞層、分子層和蒲肯野細(xì)胞層均檢測到tPA免疫反應(yīng)性信號，Seed等13也在正常和運(yùn)動后的小鼠小腦檢測到tPA蛋白。我們在大鼠小腦組織未檢測到tPA蛋白表達(dá)，可能與有關(guān)文獻(xiàn)報道的動物種屬不同，該實驗現(xiàn)象有待

22、于進(jìn)一步研究。以往人們一直認(rèn)為腦缺血后神經(jīng)元死亡形式是壞死，但近年資料顯示，無論是急性局灶性腦缺血，還是短暫性腦缺血后的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(DND)，都有細(xì)胞凋亡的參與。大多數(shù)情況下，細(xì)胞凋亡的發(fā)生可被蛋白合成抑制劑所阻抑，說明細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控。大鼠和沙土鼠全腦缺血24h和48h海馬和紋狀體，大鼠局灶性腦缺血1824h皮質(zhì)和紋狀體神經(jīng)元瓊脂糖DNA電泳均呈典型梯帶14。然而，這種方法只能反映所研究組織的DNA平均狀態(tài)，并不能特異地鑒別凋亡細(xì)胞。TUNEL法是識別細(xì)胞凋亡的較新方法，該法重復(fù)性好，分辨率較高，使用方便。我們用該法檢測局灶性腦缺血6h缺血側(cè)，在大腦皮層后肢體區(qū)、頂皮層區(qū)、海馬和齒狀

23、回均可見散在的凋亡細(xì)胞，反映了tPA可能涉及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而缺血18h，僅在齒狀回有凋亡細(xì)胞，可能是腦缺血損傷18h，大部分神經(jīng)細(xì)胞已發(fā)生壞死。該結(jié)果與柯等15報道類似，提示細(xì)胞凋亡與缺血時間有一定的關(guān)聯(lián)，缺血時間短，較溫和的腦損傷以誘發(fā)細(xì)胞凋亡為主，缺血時間長，劇烈的腦損傷則以細(xì)胞壞死為主。本研究在缺血6h正常側(cè)也檢測到極少量凋亡細(xì)胞，這可能是腦組織發(fā)育過程中一種正常的生理性死亡?；痦椖浚簢医艹銮嗄昊鹳Y助項目(39625022)作者簡介：潘涌(1956)，女，福建人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師作者單位：潘涌（中山醫(yī)科大學(xué)藥理教研室）鄭素秋（中山醫(yī)科大學(xué)藥理教研室）謝勉（解剖學(xué)教研室

24、，廣州510089）謝元云（解剖學(xué)教研室，廣州510089）林以理（解剖學(xué)教研室，廣州510089）顏光美（中山醫(yī)科大學(xué)藥理教研室）參考文獻(xiàn)：1Marthinuss J,Andrade-Gordon P,SeibergM.A secreted serine protease can induced apoptosis in Pam212 keratinocytesJ.Cell Growth Differ,1995,6(7):807-816.2Hara S,Halicka HD,Bruno S,et al.Effect of protease inhibitor on early events

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