大鼠肝再生過(guò)程中線粒體氧化磷酸化的調(diào)控

1、    大鼠肝再生過(guò)程中線粒體氧化磷酸化的調(diào)控*        摘要目的：探討肝部分切除后肝再生過(guò)程中線粒體能量代謝的調(diào)控。方法：用雄性Wistar大鼠施行肝部分切除復(fù)制肝再生模型，肝部分切除后分別觀察0.5、1、2、4和7 d 5個(gè)肝再生組以及5個(gè)相應(yīng)的對(duì)照組，差速離心法分離肝線粒體并用氧電極極譜法測(cè)定其氧化磷酸化活性。結(jié)果：肝部分切除后肝再生過(guò)程中線粒體呼吸控制率(RCR)明顯高于相應(yīng)對(duì)照組，其中肝部分切除后0.5 d和4 d為二個(gè)峰值，7 d時(shí)降至對(duì)照組水平，早期RCR

2、的升高主要是R3升高的所致，1 d后RCR升高是R4下降所致。磷氧比值(P/O)的變化類似于RCR。結(jié)論：肝部分切除后肝再生過(guò)程中線粒體通過(guò)氧化磷酸化偶聯(lián)增強(qiáng)來(lái)適應(yīng)肝再生的能量需求，這種增強(qiáng)機(jī)制很可能主要是通過(guò)降低線粒體內(nèi)膜通透性實(shí)現(xiàn)的。主題詞肝再生；線粒體；氧化磷酸化；大鼠 Regulation of mitochondrial oxidative phosphorylation during rat liver regeneration after partial hepatectomyMIAO Ming-Yong, CAI Zai-Long, LIU Peng-Fei, WANG Xue

3、-Min,MAO Ji-Fang,CHENG Ke-MingDepartment of Biochemistry and Molecular Biology , Department of Basic Medicine,Second Military Medical University, Shanghai, (200433)Abstract AIM：To investigate the regulation of mitochondrial energy metabolism during liver regeneration after partial hepatectomy. METHO

4、DS：Liver regeneration model was produced by partial hepatectomy performed in male Wistar rats. All rats were divided into five experimental groups (0.5, 1, 2, 4 and 7 days groups after partial hepatectomy), and five sham-operated groups. The liver mitochondria were isolated by differential centrifug

5、ation, and its oxidative phosphorylation capacity were measured polarographically with Clark oxygen electrode.RESULTS：The mitochondrial respiratory control rate (RCR) significantly increased during rat liver regeneration after partial hepatectomy, as compared with sham-operated groups, and two peaks

6、 in RCR occured at half day and the fourth day after partial hepatectomy, and then reduced to the level of sham-operated groups at the seventh day. The first peak in RCR was due to the increase of respiratory state (R3), the second due to the decrease of repiratory state (R4). The kind of change of

7、P/O ratio was likely to that of RCR after partial hepatectomy.CONCLUSION：The enhancement of oxidative phosphorylation function occure to meet the increase in cellular energy demand for rat liver regeneration, as was obtained by some regulatory mechanism which might reduce permeability of the inner m

8、itochondrial membrane after partial hepatectomy.MeSHLiver regeneration; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Rats肝臟的外科手術(shù)或有害因素對(duì)肝臟損傷后，殘存的肝細(xì)胞很快會(huì)進(jìn)入一個(gè)復(fù)雜的再生過(guò)程，這個(gè)再生過(guò)程與細(xì)胞的能量供應(yīng)密切相關(guān)，用于合成細(xì)胞各種組分的能量需求增加1。正常情況下細(xì)胞能量供應(yīng)主要由線?；躞w磷酸化提供。有研究表明肝再生時(shí)線粒體形態(tài)發(fā)生了較大的變化，表現(xiàn)為腫脹、增大及聚集等2，還有研究發(fā)現(xiàn)肝再生時(shí)細(xì)胞能量需求增加，線粒體功能增強(qiáng)1，3，而另外研究發(fā)現(xiàn)肝再生早期線

9、粒體ATP合成酶活性減低4，呼吸功能下降5。因此，這方面的研究結(jié)果存在較大差別。為此，本文研究分析肝再生不同時(shí)期的線粒體氧化磷酸化諸多參數(shù)，以探明肝再生過(guò)程中線粒體氧化磷酸化的時(shí)相變化規(guī)律，為肝再生機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與分組：雄性Wistar大鼠(200250 g)，本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，參照文獻(xiàn)6復(fù)制肝臟部分切除模型。用乙醚麻醉動(dòng)物，切除大鼠肝的中葉和左葉，約占肝臟的65%70%，分別在手術(shù)后0.5、1、2、4和7 d時(shí)斷頭取肝制備線粒體，這樣分成5個(gè)肝再生實(shí)驗(yàn)組；同時(shí)設(shè)5個(gè)相應(yīng)的對(duì)照組，對(duì)照組的大鼠同樣用乙醚麻醉和手術(shù)處理但不切肝，并在同樣的時(shí)點(diǎn)斷頭取肝

10、分離線粒體。每組為5只大鼠。(二)主要試劑與儀器：魚(yú)藤酮、腺苷二磷酸(ADP)為Sigma公司產(chǎn)品，蔗糖、甘露醇、琥珀酸、谷氨酸和蘋(píng)果酸等為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)試劑。主要儀器CR21高速冷凍離心機(jī)(日立公司)，SP-2溶氧測(cè)定儀(上海植生所)。(三)肝線粒體的分離：參照文獻(xiàn)7，動(dòng)物斷頭取肝，稱重，按10 mL/g tissue加分離介質(zhì)(250 mmol/L蔗糖、220 mmol/L甘露醇、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA, 0.25%牛血清白蛋白，pH7.4)，用Teflon芯的玻璃勻漿器勻漿，差速離心分離線粒體，制成合適的線粒體懸液。雙縮脲法測(cè)定線粒體懸液的蛋白量，整

11、個(gè)過(guò)程嚴(yán)格在冰浴中進(jìn)行。(四)肝線粒體氧化磷酸化功能參數(shù)測(cè)定與計(jì)算：1.測(cè)定條件：在25密閉的連續(xù)攪拌的反應(yīng)體系用氧電極測(cè)定線粒體的耗氧速率來(lái)反映線粒體的功能。加入測(cè)定介質(zhì)(75 mmol/L蔗糖、220 mmol/L甘露醇、20 mmpl/L KCl、5 mmol/L MgCl2、 5 mmol/L K-Pi,20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA、pH7.4)和線粒體(1 mg蛋白/mL)后描記本底耗氧(態(tài)呼吸)，加入底物琥珀酸或谷氨酸+蘋(píng)果酸后耗氧加快(態(tài)呼吸)，加入ADP刺激呼吸明顯加快(態(tài)呼吸)，待ADP消耗完后耗氧又減慢(態(tài)呼吸)，用記錄儀連續(xù)描記這呼

12、吸曲線后進(jìn)行計(jì)算。2.計(jì)算方法：耗氧速率(QO)=氧飽和度×單位時(shí)間耗氧格數(shù)×反應(yīng)體積×2/定標(biāo)格數(shù)，單位nmols O/min.mg-1pr.;呼吸控制率(RCR)=態(tài)耗氧速率/態(tài)耗氧速率；磷氧比值(P/O)=ADP(nmoles)/態(tài)耗氧總量。(五)統(tǒng)計(jì)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用()表示，顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。結(jié)果1示大鼠肝部分切除后不同時(shí)間里肝線粒體以琥珀酸為底物的RCR變化，上面曲線為肝部分切除組，下面曲線為對(duì)照組。從上可以看出肝部分切除后0.5 d時(shí)RCR為最高， 明顯高于對(duì)照組(P0.01)，以后逐步下降，2 d時(shí)為最低但仍高于對(duì)照組，而后又升高，至4 d時(shí)又顯著

13、高于對(duì)照組(P0.05)，第7 d時(shí)接近對(duì)照組；2是以蘋(píng)果酸+谷氨酸為底物的肝線粒體RCR的變化曲線，基本與1的情況相似，但變化更明顯，同樣在肝切后0.5和第4 d為高峰與對(duì)照組相差極顯著(P0.01)，第1和第2 d也顯著高于對(duì)照組(P0.05)。對(duì)照組的肝線粒體RCR在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中波動(dòng)很小。Fig 1 Change of mitochondrial RCR with succinate as substrate after rat partial hepatectomy (,n=5)-hepatectomy -sham-operation*P0.05, *P0.01, vs sham-o

14、peration group1大鼠肝部分切除后肝線粒體以琥珀酸為底物的RCR變化Fig 2 Change of mitochondrial RCR with malate+glutamate as substrate after rat partial hepatectomy (,n=5)-hepatectomy -sham-operation*P0.05, *P0.01, vs sham-operation group2大鼠肝部分切除后肝線粒體以蘋(píng)果酸+谷氨酸為底物的RCR變化3以琥珀酸為底物的R3、R4的變化曲線，上二條曲線代表肝部分切除組和對(duì)照組的R3，下二條曲線為肝部分切除組和對(duì)照組的

15、R4。肝部分切除后0.5 d，R3極明顯高于對(duì)照組(P0.01)，以后迅速下降，并與對(duì)照組無(wú)明顯差異；而R4在肝部分切除后1 d以后逐漸低于對(duì)照組，在第2和第4 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P0.05)，7 d時(shí)基本恢復(fù)與對(duì)照組無(wú)差別。4是以蘋(píng)果酸+谷氨酸為底物的R3、R4變化曲線，其變化情形與3類似，其中肝切后1 d時(shí)R4就顯著低于對(duì)照組(P0.05)，在第4 d時(shí)下降最明顯，與對(duì)照組相差極顯著(P0.01)。從R3、R4的變化可以看出，肝部分切除后早期(0.5 d)RCR的升高主要是R3升高所至，而第2 d以后RCR升高是由于R4下降所至。Fig 3 Change of mitochondrial

16、 oxygen comsuption with succinate as substrate after rat partial hepatectomy (,n=5)-R3 (hepatectomy) -R4 (hepatectomy)-R3 (sham-operation) -R4 (sham-operation)*P0.05, *P0.01, vs sham-operation group3大鼠肝部分切除后肝線粒體以琥珀酸為底物的耗氧變化Fig 4 Change of mitochondrial oxygen comsuption with malate+glutamate as subs

17、trate after rat partial hepatectomy (,n=5)-R3 (hepatectomy) -R4 (hepatectomy)-R3 (sham-operation) -R4 (sham-operation)*P0.05, *P0.01, vs sham-operation group4大鼠肝部分切除后肝線粒體以蘋(píng)果酸+谷氨酸為底物的耗氧變化表1表明肝部分切除后分別以琥珀酸和谷氨酸+蘋(píng)果酸為底物的肝線粒體磷氧比值(P/O)的變化。P/O在肝部分切除組各個(gè)時(shí)點(diǎn)皆高于對(duì)照組，與RCR的變化是一致的，反映了肝再生期肝線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)增強(qiáng)和效率提高。表1大鼠肝再生過(guò)程中

18、線粒體磷氧比值(P/O)的變化Tab 1 Change of mitochondrial P/O ratio during ratliver regeneration (,n=5)TimeSuccinateMalate+glutamate(day)HepatectomySham-operationHepatectomySham-operation0.51.64±0.12*1.49±0.142.46±0.21*2.2±0.151.01.49±0.201.34±0.112.14±0.172.0±0.122.01.44&

19、#177;0.161.38±0.132.30±0.14*2.04±0.104.01.51±0.13*1.38±0.152.38±0.13*2.06±0.177.01.40±0.131.39±0.112.11±0.122.08±0.11*P0.05,vs sham-operation group討論研究結(jié)果表明，肝部分切除后的再生過(guò)程中肝線粒體氧化磷酸化功能發(fā)生了明顯的變化，肝 部分切除組的線粒體功能明顯高于對(duì)照組，經(jīng)歷了早期升高而后下降，又升高，最后下降接近對(duì)照組的過(guò)程。這表明在肝再生

20、時(shí)，肝細(xì)胞以及線粒體發(fā)生了調(diào)控，以滿足肝再生時(shí)對(duì)能量需求的增強(qiáng)，也提示細(xì)胞及線粒體的結(jié)構(gòu)和代謝功能發(fā)生了很大的變化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)依賴NADH(蘋(píng)果酸+谷氨酸)呼吸鏈的功能增強(qiáng)要比琥珀酸呼吸鏈的明顯，這對(duì)能量供應(yīng)更有意義。RCR是指線粒體在有ADP時(shí)的快速攝氧速率(R3)與ADP耗盡后較低的攝氧速率(R4)之比值，它是評(píng)價(jià)線粒體結(jié)構(gòu)完整性和氧化磷酸化偶聯(lián)程度的靈敏指標(biāo)之一，主要包括線粒體內(nèi)膜呼吸鏈和內(nèi)膜通透性。R3反映了底物通透性(底物載體)、呼吸鏈、ATP合成酶和ATP/ADP移位體。R4則依賴于膜的天然質(zhì)子傳導(dǎo)性即內(nèi)膜通透性8。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能得出：肝再生早期RCR的高峰(見(jiàn)1，2)，主要是R3上

21、升結(jié)果，R4只有輕微上升(見(jiàn)3、4)，這表明與R3相關(guān)的因素即呼吸鏈酶系、ATP合成酶、ATP/ADP移位體和底物載體等活性增強(qiáng)，而線粒體內(nèi)膜通透性沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。早期(12 h)的線粒體功能增強(qiáng)未見(jiàn)有報(bào)導(dǎo)，其機(jī)制可能與應(yīng)激有關(guān)9，但不能完全用應(yīng)激來(lái)解釋，因?yàn)橥瑫r(shí)觀察到對(duì)照組的R3、R4僅輕微升高(見(jiàn)3、4)。手術(shù)1 d以后，肝切組和對(duì)照組的R3沒(méi)有差別，而肝切組的R4卻明顯低于對(duì)照組，這是肝切組RCR高于對(duì)照組的主要原因。表明在這個(gè)時(shí)期再生肝線粒體內(nèi)膜通透性明顯降低即氧化磷酸化偶聯(lián)增強(qiáng)、效率提高，這對(duì)肝再生提供更多的ATP具有重要意義；內(nèi)膜通透性下降直接反映了內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生了改變，這

22、也說(shuō)明細(xì)胞和線粒體本身進(jìn)行了一系列的調(diào)控，以適應(yīng)肝細(xì)胞再生時(shí)的能量需求。線粒體功能增強(qiáng)有二個(gè)方面：一方面可能通過(guò)表達(dá)合成大量有關(guān)氧化磷酸化酶系的蛋白質(zhì)來(lái)提高ATP的合成功能，這樣必然會(huì)消耗過(guò)多的ATP，這顯然是不經(jīng)濟(jì)的；另一方面通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜理化特性，呼吸鏈多酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)環(huán)境等提高氧化磷酸化的功能和效率，這是一個(gè)經(jīng)濟(jì)的途徑。從本文研究結(jié)果分析提示，整個(gè)肝再生過(guò)程中線粒體內(nèi)膜理化特性的變孔，可能是一個(gè)主要的方面。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，就必須進(jìn)一步研究肝部分切除后線粒體內(nèi)膜的理化特性，如內(nèi)膜膜脂組分分析、膜電位(m)、膜流動(dòng)性、膜通透性轉(zhuǎn)換(PT孔)等。*國(guó)家自然科學(xué)基金資助(396001

23、39)作者單位:繆明永蔡在龍王學(xué)敏毛積芳陳克明第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，劉鵬飛第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院 (上海 200433)參考文獻(xiàn)1Tsai IL,King KL, Chang CC, et al. Changes of mitochondrial respiratory functions and superoxide dismutase activity during liver regeneration. Biochem Int 1992, 28:205.2韓淑媛，黃志強(qiáng)，劉永雄，等.大鼠肝部分切除后肝再生細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1993，10(2)：54.3Nagino M, Tanaka M, Nishikimi M, et al. Stimulated rat liver mit