大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠探索功能的影響

1、大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠探索功能的影響                            作者：王樹(shù) 張力 張丹參 安芳 薛貴平【摘要】  目的觀察大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠認(rèn)知探索功能的影響。 方法采用暫時(shí)性阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制備小鼠腦缺血再灌注損傷的模型，進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，觀察大黃酚10,1，0.1mg

2、?kg-1 ip對(duì)腦缺血再灌注小鼠認(rèn)知探索功能的改善作用，并對(duì)各劑量組全血中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力和血漿中超氧化物歧化酶（SOD）活力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果大黃酚可明顯縮短腦缺血再灌注小鼠到達(dá)暗室時(shí)間、到達(dá)高端時(shí)間、到達(dá)明室時(shí)間，增加爬高端的次數(shù)，使小鼠在暗室和在明室滯留時(shí)間相近；并提高全血中GSH-Px活力和血漿中SOD活力。結(jié)論大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠所致探索認(rèn)知行為功能障礙有明顯的改善作用，其作用機(jī)制可能是增強(qiáng)抗氧化酶GSH-Px和SOD活力。 【關(guān)鍵詞】  大黃酚 腦缺血再灌注 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 超氧化物歧化酶Abstract:ObjectiveTo observe

3、 the effects of chrysophanol on cognitive and exploratory functions in mice with cerebral ischemia reperfusion.MethodsCerebral ischemia reperfusion injury  was produced on conscious mice by temporarily obstructing bilateral common carolid arteries. The improvement effects of chrysophanol（10，1，0

4、.1mg?kg-1，ip） on cognitive and exploratory functions in mice with cerebral ischemia reperfusion was observed using exploratory movement test and the glutathione peroxidase(GSH-Px) activities in blood and the superoxide dismutase(SOD) activities in plasma were measured.ResultsChrysophanol could short

5、en time of entering darkroom, time of climbing height,  time of entering brightroom, increase number of climbing height, and showed no differences between staying time at darkroom and brightroom and increase the glutathione peroxidase(GSH-Px) activities in blood and the superoxide dismutase(SOD

6、) activities in plasma. Conclusion Chrysophanol can improve the effects on the cognitive-behavior impairment in mice with cerebral ischemia reperfusion injury, perhaps the mechanism is involved in enhancing the activities of GSH-Px and SOD.Key words:Chrysophanol;   Cerebral ischemia reperf

7、usion;   GSH-PX;    SOD血管性癡呆(Vascular dementia, VD)是指由各種腦血管疾病引起的以認(rèn)知損害為特征的一種綜合征。VD主要行為表現(xiàn)為高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的智能障礙,特別是認(rèn)知功能障礙,包括學(xué)習(xí)、記憶、思維等障礙，嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量。中藥大黃作用廣泛，有抗高血壓、抗菌、瀉下、抑制膽堿酯酶、抗衰老作用等許多作用。大黃酚（Chrysophanol , Chry）為大黃的有效成分之一，但藥理作用文獻(xiàn)報(bào)道卻很少，僅限于傳統(tǒng)的抗菌、瀉下、止血等方面。我室前期工作已證實(shí)大黃酚能明顯減少大鼠肝、腦過(guò)氧化脂質(zhì)生成1，2

8、。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠短暫性腦缺血模型，研究大黃酚對(duì)腦缺血再灌注損傷后小鼠認(rèn)知探索功能的影響，探討其改善認(rèn)知探索功能障礙的機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床治療血管性癡呆疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  器材1.1  藥品和試劑大黃酚（分析純，中國(guó)藥品生物制品檢定所），實(shí)驗(yàn)前用N，N-二甲基甲酰胺溶解，聚山梨酯-80助溶，生理鹽水稀釋至所需濃度，N，N-二甲基甲酰胺：聚山梨酯-80：生理鹽水等于118。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力測(cè)試盒，超氧化物歧化酶測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水。1.2 儀器XTY-2探索運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)儀，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；80-2B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠

9、； FSH-2內(nèi)切式組織可調(diào)高速勻漿器，江蘇環(huán)保儀器廠；721分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；二列六孔電熱恒溫水浴鍋：北京精科華瑞儀器有限公司。1.3 動(dòng)物昆明種小鼠120只，體重 2830g，均為雄性，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所提供。2  方法2.1  分組每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均取健康小鼠60只，均為雄性，隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（進(jìn)行手術(shù)但不進(jìn)行缺血再灌注）、模型對(duì)照組(缺血再灌注組)、大黃酚高劑量組、中劑量組和低劑量組（高、中、低劑量分別為10，1，0.1 mg?kg-1，ip）。2.2  小鼠腦缺血再灌注模型的制備3.5%水合氯醛（10 ml?kg-1, ip

10、）麻醉小鼠后，仰臥位固定，頸部正中切開(kāi)皮膚約mm，分離兩側(cè)頸總動(dòng)脈，按Himori法3埋線后縫合切口。術(shù)后48 h將頸下部?jī)啥私z線拉緊,阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈造成大腦缺血狀態(tài)，5 min后輕拉兩耳后引線，使頸總動(dòng)脈恢復(fù)血液再灌注。2.3  探索運(yùn)動(dòng)探索運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)箱，是檢測(cè)動(dòng)物行為的場(chǎng)所，由一個(gè)暗室和兩個(gè)明室組成，該設(shè)備中裝有傳感系統(tǒng)，可以接受動(dòng)物的活動(dòng)行為信號(hào)并傳送到計(jì)算機(jī)。手術(shù)后48 h將小鼠放入探索運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)儀內(nèi)進(jìn)行預(yù)選，在箱內(nèi)自由活動(dòng)3 min，3 min內(nèi)不進(jìn)入暗室者剔除。將經(jīng)過(guò)預(yù)選的小鼠進(jìn)行分組。 除假手術(shù)組外，其余各組使腦立即缺血5 min，然后恢復(fù)血流。其中大黃酚高、中、低劑量組

11、于缺血前30 min 分別ip大黃酚10，1，0.1 mg?kg-1。24 h后進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，首先將小鼠放在前面的明室中，點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，同時(shí)打開(kāi)箱門，當(dāng)小鼠鉆進(jìn)暗室時(shí)，則關(guān)上門斷其后路。記錄小鼠到達(dá)暗室時(shí)間、到達(dá)高端時(shí)間、到達(dá)明室時(shí)間（指后面的明室）；小鼠在暗室滯留時(shí)間、小鼠在明室滯留時(shí)間（指后面的明室）、小鼠爬高端的次數(shù)。百事通2.4 小鼠全血中GSH-Px活力和血漿中SOD活力測(cè)定將術(shù)后小鼠分組，模型對(duì)照組和大黃酚組均于手術(shù)后48 h阻斷血流5 min，其中大黃酚高、中、低劑量組于阻斷血流前30 min 分別ip大黃酚10，1，0.1 mg?kg-1?；謴?fù)血供后10 min，將小鼠的頸動(dòng)脈

12、切開(kāi)取血,肝素抗凝，將抗凝全血用三蒸水制成1%溶血液，以GSH-Px試劑盒測(cè)定小鼠全血中GSH-Px活力。規(guī)定：每4 l全血在37反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 mol?L-1為一個(gè)酶活力單位。取上述抗凝全血離心（4 000 r?min-1，離心10 min）后取血漿10 l，采用羥胺法以SOD試劑盒測(cè)定。規(guī)定：每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位。2.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)資料用t檢驗(yàn)，并進(jìn)行方差分析，以±s表示。3  結(jié)果3.1  大黃酚對(duì)腦缺

13、血再灌注小鼠探索運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中到達(dá)暗室時(shí)間、到達(dá)高端時(shí)間、到達(dá)明室時(shí)間、爬高端次數(shù)的影響腦缺血再灌注后可造成小鼠明顯的探索認(rèn)知行為功能障礙。和假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組小鼠到達(dá)暗室時(shí)間、到達(dá)高端時(shí)間、到達(dá)明室時(shí)間均明顯延長(zhǎng)（P<0.01），小鼠爬高端的次數(shù)明顯減少（P<0.01）。預(yù)先給予大黃酚，則高、中劑量的大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠所致探索認(rèn)知行為功能障礙有明顯的改善作用。結(jié)果見(jiàn)表1。表1  大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠在探索運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中認(rèn)知探索功能的影響（略）3.2 大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠探索運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中在暗室滯留時(shí)間和在明室滯留時(shí)間的影響   根據(jù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)指

14、標(biāo)的比較要求,只在同一組內(nèi)進(jìn)行這兩項(xiàng)指標(biāo)比較。結(jié)果表明，模型對(duì)照組和大黃酚低劑量組的小鼠在暗室滯留時(shí)間和在明室滯留時(shí)間有明顯差異（P<0.001），而假手術(shù)組，大黃酚高、中劑量組在暗室滯留時(shí)間和在明室滯留時(shí)間無(wú)明顯差異（P0.05），說(shuō)明高、中劑量的大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠所致探索認(rèn)知行為功能障礙有明顯的改善作用。結(jié)果見(jiàn)表2。表2   大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠在探索運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中認(rèn)知探索功能的影響（略）3.3  大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠全血中GSH-Px活力和血漿中SOD活力的影響 腦缺血再灌注后小鼠全血中GSH-Px活力和血漿中SOD活力明顯降低（P

15、<0.01）；高劑量大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠全血中GSH-Px活力明顯提高（P<0.01），高，中劑量的大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠血漿SOD活性明顯提高（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。表3  大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠全血GSH-Px和血漿SOD 的影響（略）4  討論探索是人類在長(zhǎng)期的認(rèn)識(shí)自然和改造自然過(guò)程中所形成的一種高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)，探索實(shí)驗(yàn)是行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中很重要的實(shí)驗(yàn)方法，體現(xiàn)認(rèn)知能力，從多方面尋求答案，解決疑難問(wèn)題，更好地適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷的小鼠表現(xiàn)出明顯的探索認(rèn)知行為功能障礙。而腦缺血前給予大黃酚后，則對(duì)腦缺血再灌注小鼠所致探索認(rèn)知行為

16、功能障礙有明顯改善作用，小鼠到達(dá)暗室時(shí)間、到達(dá)高端時(shí)間、到達(dá)明室時(shí)間縮短，爬高端的次數(shù)明顯增加（P<0.05）。對(duì)于小鼠在暗室滯留時(shí)間和在明室滯留時(shí)間的比較，根據(jù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)指標(biāo)的比較要求,只在同一組內(nèi)進(jìn)行這兩項(xiàng)指標(biāo)的比較，小鼠在暗室滯留時(shí)間和在明室滯留時(shí)間越相近，說(shuō)明小鼠認(rèn)知探索功能越強(qiáng)；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高、中劑量的大黃酚組在暗室滯留時(shí)間和在明室滯留時(shí)間無(wú)明顯差異（P0.05），而模型對(duì)照組小鼠在暗室滯留時(shí)間和在明室滯留時(shí)間有明顯的差異（P<0.001），進(jìn)一步說(shuō)明大黃酚對(duì)腦缺血再灌注小鼠所致探索認(rèn)知行為功能障礙有明顯改善作用，另外，低劑量大黃酚組的小鼠在暗室滯留時(shí)間和在明室滯留時(shí)間

17、有明顯的差異，說(shuō)明大黃酚作用有劑量依賴性。癡呆是一種臨床綜合征，主要表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知、語(yǔ)言和行為障礙及人格改變等，老年期發(fā)生的癡呆為老年性癡呆，其又分阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和血管性癡呆(vascular dementia, VD)，嚴(yán)重地影響著人類的生活4。血管性癡呆是指各種腦血管病引起腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合征,為慢性進(jìn)行性疾病,主要與缺血性腦血管病有關(guān)。多灶性梗死是導(dǎo)致血管性癡呆的重要病因5。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腦缺血再灌注血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶障礙模型,觀察了大黃酚對(duì)模型小鼠探索功能的影響, 腦缺血再灌注的小鼠有明顯的探索認(rèn)知行為功能障礙，

18、而腦缺血前給予大黃酚后，則對(duì)小鼠所致探索認(rèn)知行為功能障礙有明顯改善作用，提示大黃酚有益智作用，可提高認(rèn)知探索能力，有可能開(kāi)發(fā)成為VD治療的新型藥物，可能降低血管性癡呆的嚴(yán)重程度或減少血管性癡呆的發(fā)生，有助于改善缺血性腦血管病的預(yù)后。腦缺血再灌注損傷與興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基的生成、白細(xì)胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有關(guān)。腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制和藥物治療的研究近年來(lái)一直是國(guó)際生物醫(yī)學(xué)界關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)，研究認(rèn)為6腦缺血對(duì)機(jī)體是一種嚴(yán)重的應(yīng)急反應(yīng)，對(duì)腦缺血這一嚴(yán)重應(yīng)急反應(yīng)，機(jī)體必然存在著一種內(nèi)源性的抗缺血損傷的體系，包括熱休克蛋白70（HSP70）的作用、興奮與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的影響、腺苷及其受體的作用、一些細(xì)胞因子的作用和抗氧化酶的作用。體內(nèi)抗氧化酶主要有SOD和GSH等。腦缺血時(shí)，大量的自由基產(chǎn)生，引起脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，抗氧化酶具有清除氧自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，大黃酚