PCR引物設計法則、特殊PCR技術、PCR產(chǎn)物電泳結果分析和經(jīng)驗總結

1、PCR引物設計法則、特殊PCR技術、PCR產(chǎn)物電泳結果分析和經(jīng)驗總結PCR引物設計的11條黃金法則一、引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內設計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因,通過序列分析軟件(比如DNAman比對(Alignment,各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。二、引物長度一般在1530堿基之間。引物長度(primer length常用的是18-27 bp,但不應大于38,因為過長會導致其延伸溫度大于74,不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。三、引物GC含量在40%60%之間,Tm值最好接近72。GC含量(composition過

2、高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度,一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4(G+C+2(A+T估計引物的Tm值,則有效引物的Tm為5580,其Tm值最好接近72以使復性條件最佳。四、引物3端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域,引物3端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,會影響擴增的特異性與效率。五、引物3端不能選擇A,最好選擇T.引物3端錯配時,不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異,當末位的堿基為A時,

3、即使在錯配的情況下,也能有引發(fā)鏈的合成,而當末位鏈為T時,錯配的引發(fā)效率大大降低,G、C 錯配的引發(fā)效率介于A、T之間,所以3端最好選擇T.六、堿基要隨機分布。引物序列在模板內應當沒有相似性較高,尤其是3端相似性較高的序列,否則容易導致錯誤引發(fā)(False priming。降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布最好是隨機的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G 或C,因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。七、引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列,否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構(Hairpin使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影

4、響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性,尤其應避免3 端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross dimer的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話,應盡量使其G值不要過高(應小于4.5kcal/mo l。否則易導致產(chǎn)生引物二聚體帶,并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。八、引物5 端和中間G值應該相對較高,而3 端G值較低。G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能,它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩(wěn)定性,G值越大,則雙鏈越穩(wěn)定。應當選用5 端和中間G值相對較高,而3 端G值較低(絕對值不超過

5、9的引物。引物3 端的G 值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)D NA 聚合反應。(不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進行分析九、引物的5端可以修飾,而3端不可修飾。引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5 端修飾包括:加酶切位點;標記生物素、熒光、地高辛、Eu3 +等;引入蛋白質結合DNA序列;引入點突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動子序列等。引物的延伸是從3 端開始的,不能進行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級結構可能。十、擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結構的影響,選擇擴

6、增片段時最好避開二級結構區(qū)域。用有關軟件(比如RNAstructure可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結構,有助于選擇模板。實驗表明,待擴區(qū)域自由能(G°小于58.6l kJ/mol時,擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時,用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。十一、引物應具有特異性。引物設計完成以后,應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性,就可以進行下一步的實驗了。值得一提的是,各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難,例如GC含量偏高或偏低,導致找不到各種指標都十分合適的引物;用作克隆目的的PCR,因為產(chǎn)物序列相對固定,引物

7、設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次,盡量去滿足條件。幾種常用特殊PCR技術幾種常用特殊pcr技術一、逆轉錄PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCRRNA經(jīng)逆轉錄后可作為PCR的模板。逆轉錄PCR(RT-PCR常用于基因表達研究(定量pcr和逆病毒檢測。設計RT-PCR引物時,應使引物分別位于不同的外顯子中,以便區(qū)別cDNA和gDNA擴增產(chǎn)物。二、多重PCR(Multiple PCR在同一PCR反應體系中用多對引物(覆蓋不同長度的靶序列同時擴增。例如用多重PCR進行DNA缺失篩選三、套式PCR(nested PCR用第一次PCR擴增區(qū)域內部的第二對(套

8、式引物對第一次PCR產(chǎn)物再次擴增,可以增加特異性和靈敏度。四、非對稱PCR(asymmetric PCR在PCR反應體系中,限制引物之一的濃度(50-100:1進行擴增,可得到單鏈PCR產(chǎn)物,可用于制備單鏈測序模板或單鏈DNA雜交探針。PCR產(chǎn)物電泳結果分析一、PCR產(chǎn)物電泳產(chǎn)物檢測時間一般為48h以內,有些最好于當日電泳檢測,大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。二、假陰性,不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備,引物的質量與特異性,酶的質量及,P CR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。1、模板:模板中含有雜蛋白質,模板中含有Taq酶抑制劑,模板中蛋白質沒有消化除凈,特別

9、是染色體中的組蛋白,在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時,不出現(xiàn)擴增帶,極有可能是標本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應固定不宜隨意更改。2、酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。3、引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值

10、,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。4、Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。5、反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul

11、.或100ul,應用多大體積進行PCR擴增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul 后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。6、物理原因:變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。7、靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。三、假陽性出現(xiàn)的

12、PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。1、引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。2、靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸

13、污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?與引物互補后,可擴增出PCR產(chǎn)物,而導致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。四、出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有:必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量,適當增加模板量,減

14、少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性,65左右退火與延伸。五、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差, dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有:減少酶量,或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)PCR經(jīng)驗總結(先聲明,此文不如分子克隆第三版權威與分子克隆相背處,請信分子克隆一、增加PCR的特異性1、primers design這是最重要的一步。理想的,只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件1足夠長,18-

15、24bp,以保證特異性。當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量2GC% 40%60%35'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性4避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC5避免3'端的互補,否則容易造成DIMER6避免3'端的錯配7避免內部形成二級結構8附加序列(RT site, Promoter sequence加到5'端,在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補和二級結構是要加上它們9需要使用兼并引物時,要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高

16、的引物濃度(1uM-3uM10最好學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online des gin et al.引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度(Tm。這是當50%的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DN A分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55到70。退火溫度一般設定比引物的Tm低5。設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交,適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm.確定引物Tm最可信

17、的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同,Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的T m值,所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5,以2為增量,逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結果,兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5,就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同,將退火溫度設定為比最低的Tm低5或者為了提高特異性,可以在根據(jù)較

18、高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán),然后在根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。2、stability of primers定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物,使其最終濃度為100M.TE比去離子水好,因為水的pH經(jīng)常偏酸,會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20。以大于10M濃度溶于TE的引物在-20可以穩(wěn)定保存6個月,但在室溫(15到30僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20保存至少1年,在室溫(1

19、5到30最多可以保存2個月。3、optimize reactants concentration1magnesiom ionsMg離子的作用主要是dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用并能影響Polymerase聚合酶的活性一般的情況下Mg的濃度在0.5-5mM之間調整同樣要記住的是在調整了dNTPs的濃度后要相應的調整Mg離子的濃度對實時定量PCR,使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液2其他的離子NH4+ K+都會影響PCR.增加K+的濃度后,會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的嚴謹性(stringency。NH4+也有相同的作用。MBI 公司的TAQ酶就

20、提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH42SO4的。當然,過高的陽離子濃度(KCL>0.2M時,DNA在94度根本不會發(fā)生變性,當然也就無從談起PCR了。3polymerase聚合酶不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真沒的效率要遠遠低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些。另外,一般的情況下,變性的溫度可以使用9092度,變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性4template50ul PCR SYSTEMhuman gDNA 0.1ug-1ugE.Coli 10ng-100ngL

21、amadaDNA 0.5ng-5ngPlasmid DNA 0.1ng-10ng4、termperature1denaturation變性常規(guī)是94度5分鐘,GC Rich的摸板是95度5分鐘,除了GC Rich外,常規(guī)的APP LICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘,或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation2annealing 退火5. touchdown PCR原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度94 5min94 30s60 30s72 1min 2cycles94 30s59 30s

22、72 1min 2cycles94 30s58 30s72 1min 2cycles94 30s51 30s72 1min 2cycles94 30s50 30s72 1min 20cycles72 5min6、hot start PCR熱啟動PCR是除了好的引物設計之外,提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq D NA聚合酶的最佳延伸溫度在72,聚合酶在室溫仍然有活性。因此,在進行PCR反應配制過程中,以及在熱循環(huán)剛開始,保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成,就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時,如site-directed突變

23、、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作,熱啟動P CR尤為有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液,并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜,但并不能完成抑制酶的活性,因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成,直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入T aq DNA聚合酶,在反應體系達到90度時,PAUSE,將溫度保持在70度以上,手工加入polymerase,但這個方法過于煩瑣,尤其是對高通量應用,并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分,入鎂離子或酶,包裹起來,或者將反應成分,如模板和緩沖液,物理

24、地隔離開。在熱循環(huán)時,因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。ampliwax PCR Gems (Perkin ElmerTaq Bead Hot Start Polymerase (PromegaMagnesium wax beads (Stratagene。像手動熱啟動方法一樣,蠟防護層法比較煩瑣,易于污染,不適用于于高通量應用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活,當變性溫度超過7 0度時,抗體也變性了,這樣polymerase又被激活了。7、Booster PCR我們知道1ug human g

25、enomic DNA 大約在3X105冪個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結合。當模板的濃度過低,比如低于100個分子時,引物和模板之間就很難發(fā)生反應。引物容易自身進行反應形成二聚體。這樣就有來了個booster P CR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的。開始幾個cycles保持prime r的低濃度,保證primer:template的molar ratio在10 7 10 8. 以確保開始擴增的準確性。然后booste Primer的濃度到正常的水平8、循環(huán)數(shù)和長度確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進一步分析操作的最小循環(huán)數(shù)。因為過多的循

26、環(huán)數(shù)容易造成errors和非特異性產(chǎn)物的積累產(chǎn)物的量不夠,優(yōu)化的方法有:1增加template模板2增加循環(huán)數(shù)如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法。做一個PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析。從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個會影響PCR特異性的是PCR cycling時在兩個溫度間變化的速率(ramping rate。當然是越高越好。不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地9、thermal cyclerPCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視。長時間的使用后需要調整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度?，F(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢

27、功能(self- diagnosis。10PCR additives附加物附加物或者說enhancer實在是多種多樣?；旧习◣最?能夠增加反應退火效率的化學因子,DNA結合蛋白和一些商業(yè)試劑?；镜脑聿煌馐窃黾右锿嘶鹛禺愋?減少錯配,增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量。在GC Rich情況中,additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴增的效率。而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-templ ate 復合物的極大的不穩(wěn)定,而提高了擴增的忠實性。要注意的是,沒有萬能的enhancer 全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結合gradient pcr選擇最優(yōu)條件。d

28、imethyl sulfoxide(DMSO 二甲基亞砜up to 10%formamide 甲酰胺at 5%trimethylammonium chloride 10-100uMdetergents去污劑such as Tween 20 0.1-2.5%polyethylene glycol 聚乙二醇(PEG6000 5-15%glycerol 甘油;丙三醇10-15%single stranded DNA binding proteinsDNA脫氧核糖核酸結合蛋白Gene 32 protein 1nME.coli single-stranded DNA binding protein 5uM大腸桿菌單鏈DNA結合蛋白7 deaza-dGTP(for GC rich 150uM with 50uM dGTPTaq Extehder (stratagenePerfect Match