人乳頭瘤病毒基因分型液態(tài)芯片的構(gòu)建

1、人乳頭瘤病毒基因分型液態(tài)芯片的構(gòu)建        【摘要】  目的: 通過構(gòu)建人乳頭瘤病毒基因分型的液態(tài)芯片, 建立高通量、 靈敏和特異的HPV型別檢測系統(tǒng)。方法: 在LuminexTM平臺(tái)上, 采用國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)HPV質(zhì)粒建立13種基因分型HPV 芯片, 選擇引物及探針, 將探針有效的偶聯(lián)到微球上。結(jié)果: 用LuminexTM平臺(tái)建立了13型HPV芯片, 對(duì)單一或兩種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；旌系臉悠肪蓽?zhǔn)確分型。對(duì)分型檢測的陽性標(biāo)本進(jìn)行基因測序, 經(jīng)美國NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì)符合其檢測型別。結(jié)論: 利用Lumi

2、nexTM平臺(tái)構(gòu)建了13種HPV型別液相芯片的診斷體系, 具有高通量、 快速準(zhǔn)確等特點(diǎn), 適用于大規(guī)模臨床樣本的HPV基因分型的診斷。 【關(guān)鍵詞】  人乳頭瘤病毒（HPV） 基因分型 芯片人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV）基因分型, 對(duì)臨床HPV感染疾病的診斷與具有重要的意義。目前采用的PCR檢測技術(shù)假陽性率較高、   Southern blot或反向雜交方法進(jìn)行操作繁瑣, 一次檢測樣本量有限, 限制了其大規(guī)模篩查中的需要。我們擬利用LuminexTM平臺(tái)系統(tǒng)1-3, 構(gòu)建人乳頭瘤病毒基因分型的液態(tài)芯片, 建立特異性強(qiáng)、高通量、高靈

3、敏度的HPV型別檢測系統(tǒng)。1  材料和方法1.1  材料 HPV31、 HPV35、 HPV56全基因序列質(zhì)粒, 由美國 Research and Development Digene Corporation Attila Lrincz教授惠贈(zèng); HPV58 全基因序列質(zhì)粒由日本Toshihiko Matsukura 教授惠贈(zèng); HPV45、 HPV51、 HPV53全基因序列質(zhì)粒, 由德國Heidelberg E.M.de Villiers 教授惠贈(zèng); HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18含HPVL1區(qū)質(zhì)粒的菌懸液, 由第四軍醫(yī)大學(xué)皮膚科惠贈(zèng)。fl

4、uorescencelabeled polystyrene beads （Luminex microsphere熒光聚苯乙烯球, 直徑為5 600 nm , 帶有功能性羧基, 密度1.25×109/L）購自Luminex公司。TMAC(temtrameihylammdnium chloride)Lot 043k82108、 MES (2NMorpholino ethanesulfonic acid) (C6H13NO4S FW 195.2) lot 042k5467; NLauroylsarcosine Sodium Salt Lot 082k1028均購自Sigma公司, 

5、; EDC: 1ethyl3 (3dimethylamin opropyl)carboclirmide hyddrocloride 購自Pierce (Rockford, IL); streptavidinphycoerythrin(SAPE):  購自Molecular Probes Lot: 83C21。1.2  方法根據(jù)LuminexTM平臺(tái)系統(tǒng)的要求, 選擇GP5+/GP6+系統(tǒng), 采用 de Roda Husman4設(shè)計(jì)。所有選擇的探針M. V. JACOBS5, 通過使用美國NCBI數(shù)據(jù)庫做BLAST比對(duì)研究。選擇占外生殖器部位HPV感染類型的96%左右的HPV

6、低危類型HPV6、 HPV11和HPV53及高危類型HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV45、 HPV51、 HPV52、 HPV53、 HPV56、 HPV58等為構(gòu)建液態(tài)芯片的首批HPV型別。通過寡核苷酸5氨基與微球表面的羧基在偶聯(lián)反應(yīng)液中偶聯(lián), 微球表面的羧基點(diǎn)通過MES 和EDC 而激活, 為了減少蛋白在寡核苷酸與微球雜交中的相互干擾現(xiàn)象, 探針設(shè)計(jì)時(shí)通過加上帶生物素酶的碳臂, 而有效的結(jié)合在微球表面。為了檢測探針是否已連接到微球上, 設(shè)計(jì)偶聯(lián)探針的互補(bǔ)探針, 在互補(bǔ)探針序列5端加Biotin 修飾。將帶有C14臂探針的微球與待測的PCR產(chǎn)物按比

7、例在終濃度為3 mol/L的TMAC反應(yīng)液中混合, 通過核酸解連、 雜交反應(yīng)和SAPE染色后, 通過Luminex 100儀器（BIARAD技術(shù)平臺(tái)）檢測。陽性質(zhì)粒抽提后, 以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 將擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃度梯度稀釋, 各稀釋產(chǎn)物分別與帶有各型HPV探針的微球進(jìn)行雜交、 染色, 最后進(jìn)行LuminexTM100儀器BioPlex系統(tǒng)檢測, 根據(jù)BioPlex管理軟件分析采用The Logistic5PL標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 對(duì)陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)的檢測數(shù)據(jù), 采用判別分析法, 對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析, 建立判別函數(shù)。1   &#

8、160;     2  結(jié)果2.1  陽性質(zhì)粒抽提及PCR檢測 各型質(zhì)粒經(jīng)過重新抽提后, 檢測結(jié)果見圖1。2.2  陽性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物與微球探針的雜交反應(yīng)結(jié)果用13種帶有不同編號(hào)的微球分別與HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV45、 HPV51、 HPV52、 HPV53、 HPV56、 和HPV58型探針偶聯(lián)后, 使13種微球分別帶有不同的探針。將這13種微球同時(shí)放入一個(gè)反應(yīng)體系中, 在一個(gè)反應(yīng)體系中加入一種HPV的PCR產(chǎn)物, 進(jìn)行雜交

9、反應(yīng), 經(jīng)LuminexTM100 BioPlex軟件分析平臺(tái)檢測（表1）。表1  應(yīng)用液態(tài)懸浮芯片技術(shù)檢測單純一型HPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒結(jié)果（略）將2種或3種質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物等量混合后變性, 再分別與13型HPV DNA探針雜交, 經(jīng)SAPE熒光染色后檢測。結(jié)果顯示2型PCR產(chǎn)物與相應(yīng)2型探針雜交后, 檢測出所對(duì)應(yīng)的熒光值均高于無PCR產(chǎn)物未發(fā)生雜交反應(yīng)探針的熒光值, 平均高出3倍以上。經(jīng)檢測全部13種質(zhì)粒的檢測結(jié)果均符合預(yù)期值, 沒有出現(xiàn)混亂雜交現(xiàn)象, 同時(shí)各混雜的陽性PCR產(chǎn)物均可被檢出(表2)。表2  應(yīng)用液態(tài)懸浮芯片技術(shù)檢測兩型混合HPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒結(jié)果（略）2.3 

10、; 對(duì)照檢測 采用HPV液相芯片系統(tǒng)對(duì)30例尖銳濕疣標(biāo)本均檢出分型, 檢出率為100%, 而采用反向雜交技術(shù)建立的人乳頭瘤病毒基因分型試劑盒檢測, 只有21例可檢出基因分型, 檢出率為70%。為了驗(yàn)證液相芯片檢測的結(jié)果, 選擇經(jīng)液相芯片檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行基因測序。115號(hào)為尖銳濕疣標(biāo)本, 經(jīng)芯片檢測為HPV11型和HPV6型混合感染。選擇115#PCR產(chǎn)物送測序, 經(jīng)上海博亞生物技術(shù)有限公司測序GP5+端測序的結(jié)果: GAC ACT ATG TGC ATC CGT GAC TAC ATC TGC CAC ATA CAC NAA TTC CGA TTA TAA GGA GAT ACA

11、TGC GCC ATG TGG AGG AAT ATG ATT TAC AGT TTA TTT TTC A。GP6+端開始測序的結(jié)果: TCC TTA TAA TCT GAA TTN GTG TAT GTG GCA GAT NTA GAC ACA GAT GCA CAT AGT GTC ATN TTN GTA CTG CGT GTA GTA TCT ACC ACA GTA ACA AAA。經(jīng)美國NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì), 結(jié)果符合HPV11型和HPV6型。3  討論    本研究是在LuminexTM100技術(shù)平臺(tái)上開發(fā)對(duì)人乳頭瘤病毒基因分型的檢測和

12、定量分析。應(yīng)用國際上已公認(rèn)的HPV質(zhì)粒作為陽性參照標(biāo)準(zhǔn), 建立了13種HPV型別液相芯片的診斷體系; 對(duì)HPV公用引物和13種HPV的探針進(jìn)行了篩選, 建立了PCR反應(yīng)體系、 雜交反應(yīng)體系。研究結(jié)果顯示, 13種微球探針對(duì)相應(yīng)的產(chǎn)物具有特異的雜交反應(yīng), 彼此之間并不相互干擾, 對(duì)于產(chǎn)物中有混合型同時(shí)存在時(shí)也可以有效的檢出。通過建立了陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV35、 HPV51、 HPV56和HPV58的雜交后反應(yīng)的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線, 可有效的通過調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線, 對(duì)樣品的含量進(jìn)行定量分析。通過對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析, 確立了陽性診斷的標(biāo)準(zhǔn)和

13、特征判別的函數(shù), 檢測結(jié)果顯示每通道通過的微球?yàn)?0個(gè)以上時(shí), 檢測的熒光值視為有效值, 同時(shí)檢測的熒光值去除背景值后, 判別函數(shù)大于2時(shí), 視為陽性值。根據(jù)特別函數(shù), 對(duì)349例標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)行回代特別函數(shù)判別分析, 判定在特別函數(shù)大于2時(shí), 其檢測陽性標(biāo)本的陽性準(zhǔn)確率在96.7%以上。    為了驗(yàn)證液相芯片檢測的結(jié)果, 實(shí)驗(yàn)中選擇經(jīng)液相芯片檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行基因測序, 經(jīng)美國NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì), 結(jié)果符合檢測型別。本研究建立的HPV基因分型的液相診斷芯片與采用反向雜交技術(shù)HPV型別診斷試劑盒同時(shí)檢測臨床樣品, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)一些陽性PCR產(chǎn)物的樣品, 反向

14、雜交方法未檢測出, 而液相診斷芯片可以檢出, 說明液相診斷芯片診斷方法的靈敏性優(yōu)于反向雜交方法；本研究構(gòu)建的液相診斷芯片操作步驟簡單, 診斷方法準(zhǔn)確, 一次可進(jìn)行大量樣本的檢測, 每一板可上樣96份, 因此可完成高通量的檢測；同時(shí)液相HPV基因分型診斷芯片不僅可精確的檢測出HPV的基因型別, 還可對(duì)陽性標(biāo)本進(jìn)行定量分析, 這對(duì)臨床HPV感染疾病的診斷和都有著重要的意義?！尽?#160; 1Ye F, Li MS, Taylor DJ, et al. Fluorescent microspherebased readout technology for multiplexed human sin

15、gle nucleotide polymorphism analysis and bacterial identificationJ. Human Mutation Hum Mutat, 2001, 17(4): 305-316.2Chen J, Iannone MA, Li MS, et al. A Microspherebased assay for single nucleotide polymorphism analysis using single base chain extensionJ. Genome Reash, 2000, 10(4): 549-557.3Kaderali

16、L, Deshpande A, Nolan JP, et al. Primerdesign for multiplexed genotypingJ. Nucleic Acids Research, 2003, 31（61）: 796-802.4Jacobs MV, Husman AM, Van den brule AJC, et al. GroupSpecific Differentiation between high and lowrisk human papillomavirus genotypes by general primermediated PCR and two cocktails of oligonucleotide probesJ. J Clin Microb