共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)_許險(xiǎn)峰

1、第12卷第2期2003年4月Vol. 12 No. 2A pr. 2003激光生物學(xué)報(bào)ACTA LASER BIOLOGY SIN ICA?專題綜述?共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)許險(xiǎn)峰，徐錫金，霍霞*(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí) 驗(yàn)室，中國廣東 汕頭 515031)摘 要：自1985年共聚焦激光掃描顯微鏡問世以來，該項(xiàng)技術(shù)一直在飛速發(fā)展和完善。近年來一系列新型的共聚焦顯微鏡相繼研制成功和投入使用，如視頻共聚焦激光掃描顯微鏡、雙光子顯微鏡、4pi顯微鏡、熒光壽命成像顯微鏡等，它們較傳統(tǒng)共聚 焦顯微鏡有著各自 獨(dú)特的優(yōu)勢，了解它們的基本性能和特點(diǎn)有助于其在生物學(xué)領(lǐng)域更為廣 泛深入的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：共聚焦激光掃

2、描顯微鏡；視頻；雙光子；熒光中圖分類號：Q631文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號:1007-7146 ( 2003) 02-0156-04The Tech nique of Con focal Laser Scanning Microscopy*XU Xian-feng, XU Xi-jin, H UO Xia(Central Laboratory, Shantou University Medical College, Shantou 515031, Guangdong, China)Abstract : Since the intro duction of Confocal Laser Scanni

3、ng M icroscopy(CL SM) in 1985, it has been developed and impr oved incessantly. On the base of conventio nal CL SM, a serials of new types of micro scopes have been developed. such as video- frequency microscopy, two-phot o micr oscopy, 4Pi microscopy, Fluor escence lifet ime imaging micro scopy and

4、 so on, which process especial advantages respectively. 11 is helpful for their uses in biolog ical investigat ion to acknow ledge the basic capabilitiesand character of these microscopes.Key words : Confo cal L aser Scanning M icroscopy; video-sequence;t wo-photon; fluorescence共聚焦激光掃描顯微鏡(Con focal

5、Laser Scanning Microscope, CLSM )是 80 年代發(fā)展起來 的分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，它是隨著激光，視頻，計(jì)算機(jī)等技術(shù)的飛速發(fā)展而誕生的新一代顯微 鏡1- 3。較傳統(tǒng)顯微鏡有著不可比擬的優(yōu)勢，如高空間分辨率、非介入無損傷連續(xù)光學(xué)切片、三維圖像、 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的分析檢測，1- 4這項(xiàng)技術(shù)從問世至今一直處于不斷發(fā)展進(jìn)步中。1共聚焦激光顯微鏡的發(fā)展簡史1957年，Malwin Min sky在他的專利中首次闡 明了共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)的基本原理2。10年后，Egger第一次成功地用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了 一個(gè)光學(xué)橫斷面，所用的共聚焦顯微鏡的核心是尼收稿日期：

6、2003-01-23 普科夫盤(Nipko n disks)，此盤位于光源 和針孔之 后，從盤射出的光束以連續(xù)的光點(diǎn)在盤旋轉(zhuǎn)時(shí)照到3物體上，但該技術(shù)尚不完善。1970年,Sheppard和Wils on共同推薦了一種新型的掃描共聚焦顯微鏡，同時(shí)首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線 性關(guān)系和 激光掃 描器的 拉曼光 譜學(xué)5。1978年， Brankenho ff發(fā)明了高數(shù)值孔徑的透鏡 血。1979年， Ko ester設(shè)計(jì)了一種共聚焦掃描狹縫器，獲得美國專利。1985年,Wiijanedts第一次成功地用共聚焦 激光顯微鏡演示了用熒光探針標(biāo)記的生物材料的光 學(xué)橫斷面，至此,共聚焦激光顯微鏡的

7、關(guān)鍵技術(shù)已基 本成熟7。1997年我院購進(jìn)了一臺美國M eridian公司生產(chǎn)的ACAS U LT IMA 3 1 2型共聚焦激光掃描顯微鏡,其采用氬離子激光光源，有快速鏡掃描和臺Mishing House. All rights reserved, htrp. nc 第2期許險(xiǎn)峰等：共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)159階掃描兩種掃描方式，具有三個(gè)探測器，可以同時(shí)檢 測多種熒光，可進(jìn)行組織細(xì)胞熒光圖像分析，連續(xù)光 學(xué)切片，三維圖像重建，活細(xì)胞分子、離子等時(shí)實(shí)動(dòng) 態(tài)熒光測定，膜電位檢測，膜流動(dòng)性、細(xì)胞間通訊的 熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)，細(xì)胞的自動(dòng)檢測、篩選，顯微 切割、光活化、光陷阱技術(shù)等，為同類儀器中檔次

8、最 高、功能最全的精密儀器之一 8,9。2視頻型共聚焦激光顯微鏡共聚焦顯微鏡的掃描方式幾經(jīng)發(fā)展，起初是狹縫掃描，但圖像的清晰度和質(zhì)量都不是很好，后來又 出現(xiàn)臺階掃描，即光束不動(dòng)載物臺移動(dòng)，特點(diǎn)是光學(xué) 系統(tǒng)穩(wěn)定，成像質(zhì)量好，但掃描速度慢，不適于實(shí)時(shí) 動(dòng)態(tài)觀察。目前使用最廣泛的是鏡掃描，即移動(dòng)光束 而樣本臺不動(dòng)，特點(diǎn)是掃描速度快但成像質(zhì)量不如 臺階掃描。從激光共聚焦顯微鏡的發(fā)展過程來看，成 像質(zhì)量與掃描速度始終是相互矛盾的。為了提高掃 描速度，同時(shí)保持高分辨率和寬廣的視野，增強(qiáng)傳統(tǒng) CLSM的功能，近些年來，不斷有新的顯微鏡技術(shù)或 相關(guān)技術(shù)與共聚焦探測方法聯(lián)合應(yīng)用，出現(xiàn)了幾種視頻CLSM，這類CL

9、SM 可至少以15Hz30Hz的 速率掃描大于480幀的圖像，其采取的改進(jìn)措施有：(1) 雙向掃描(臺階掃描與鏡掃描結(jié)合)；(2)狹縫式 共聚焦孔徑；(3)聲.光調(diào)制裝置(AODs) : ( 4)共鳴 檢流計(jì)10。其中計(jì)算機(jī)控制的聲光調(diào)制器 (AODs) 可對細(xì)胞的極小區(qū)域作毫秒級的瞬間激光脈沖掃 描,較好地解決了熒光漂白、淬滅等問題，通過這些方法瞬時(shí)分辨率大大增加。此外,為了能得到生物樣 本內(nèi)部深層橫斷面精確的分辨圖像，出現(xiàn)了更長工作距離的水浸透鏡，Nikon和Zeiss公司分別推出其 專利產(chǎn)品“水鏡”，Zeiss公司推出的C - Planap063X/ 12W水鏡有一調(diào) 節(jié)環(huán)，可修正因水浸

10、 活體的不同深度所帶來的球差，該水鏡紫外通過率 高,大大提高了成像質(zhì)量1'。3熒光壽命成像共聚焦激光顯微鏡到90年代，熒光壽命成像顯微鏡 (Fluorescenee Lifetim e Imag ing Microscope)與 CLSM 的聯(lián)合應(yīng) 用,大大改進(jìn)了傳統(tǒng)的共聚焦成像，其核心結(jié)構(gòu)是一個(gè)增益調(diào)節(jié)影像增強(qiáng)器和一個(gè)慢掃描CCD攝像 頭12。熒光壽命成像顯微鏡能追蹤觀察1納秒10納秒范圍內(nèi)熒光壽命的熒光團(tuán)。用這種顯微鏡產(chǎn)生的影像對比是基于被測熒光的壽命，而不是熒光的濃度或強(qiáng)度，因此其產(chǎn)生的熒光壽命圖像反映的是活細(xì)胞內(nèi)的隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)反應(yīng)而非靜態(tài)變化。 相比傳統(tǒng)顯微鏡，這種時(shí)間控制

11、的觀測方式在活細(xì) 胞動(dòng)態(tài)測定方面有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):(1)定量檢測過程不需要復(fù)雜的活細(xì)胞體內(nèi)校正；(2)僅用一個(gè)探測器就可以檢測多種熒光；(3)背景熒光信號分辨率增 加；(4)對于一些因素如光漂白、 不同染色/光程的偽 像等相對不敏感；(5)由于所有觀測點(diǎn)的信息同時(shí)被 收集，因此掃描圖像不必像傳統(tǒng) CLSM那樣逐點(diǎn)掃 描12； (6)不需要熒光探針有發(fā)射或激發(fā)光譜的改 變，因而擴(kuò)大了熒光探針的應(yīng)用范圍。熒光的壽命對于物理或化學(xué)因子比較敏感，所以這種技術(shù)適合于 pH、氧、陽離子等的測量。但這種顯微鏡也存在尚未 克服的缺點(diǎn)。根據(jù)其原理，熒光壽命是通過檢測激發(fā) 狀態(tài)下熒光物質(zhì)量子產(chǎn)額的改變而確定的 ，而

12、活細(xì) 胞體內(nèi)反應(yīng)有時(shí)會導(dǎo)致熒光猝滅的發(fā)生。因此,所測得的"熒光壽命”就有可能是由于熒光量減少或淬滅 所致,而并非熒光壽命真正發(fā)生了變化，對此目前尚無理想的解決方法。4雙光子共聚焦激光顯微鏡對傳統(tǒng)CLSM改良中應(yīng)用最廣泛的就是雙光 子激發(fā)13。雙光子方法就是利用相對復(fù)雜和昂貴的激光束產(chǎn)生超短期(毫微微秒)、高強(qiáng)度的照射，以一 種非線性方式激發(fā)標(biāo)本內(nèi)熒光探針，使足夠密度的光子到達(dá)樣本的焦平面上。例如in do-1標(biāo)記的樣品 被705nm的激光束照射可以吸收 2個(gè)光子，這與用 單一 355nm紫外光子照射激發(fā)作用相同。與傳統(tǒng)的 CLSM相比，雙光子共聚焦激光掃描顯微鏡(Tw 0-photo

13、Excitati onCon focalLaser ScanningM icr oscope)有以下幾方面的優(yōu)點(diǎn)：(1)使用可見光 而不是更有害的紫外光，降低了光的毒性作用；(2) 將光漂白限定于光束焦點(diǎn)，而不象傳統(tǒng)CLSM在共 聚焦點(diǎn)的上下形成廣泛的照射光錐；(3)減少背景熒光。目前常用發(fā)出藍(lán)寶石激光鈦?zhàn)鳛殡p光子顯微鏡 激發(fā)光源，最近又有人用發(fā)射鎂橄欖石樣激光的鉻 代替鈦?zhàn)黾す夤庠矗笳咻^前者具有功率大、穩(wěn)定性 高、光脈沖寬度短等優(yōu)點(diǎn)14。雙光子技術(shù)的另一個(gè) 優(yōu)勢是增加了對生物樣本成像的深度13,即可以觀察較厚的生物樣本，因?yàn)樵陔p光子激發(fā)中使用了長 波長減少了散射，而且雙光子共聚焦顯微鏡用紅

14、外 線代替紫外線激發(fā)熒光劑，極少造成樣品或雙光子 激發(fā)通路以外熒光分子的淬滅，故這種成像方法在 對樣品觀察深度增加一倍以上時(shí)仍可以取得高信噪 比圖像13。雙光子技術(shù)的缺點(diǎn)(激光復(fù)雜昂貴、橫向分辨率降低)可以由其優(yōu)點(diǎn)(信噪比和組織穿透性增 加)來抵消，可商業(yè)運(yùn)做的雙光子 共聚焦顯微鏡 (BioRad M RC. 1024MP; Leica T CS MP; DeerfieldlL; Zeiss NLO; Thomwood NY)已經(jīng)投入 使用，雙光子共聚焦激光掃描顯微鏡的主要優(yōu)勢在 于活細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化過程的分析檢 測13。雙光子技術(shù)開創(chuàng)了鈣動(dòng)態(tài)分析的非線形相關(guān)的 檢測方式，它的出現(xiàn)

15、使人們看到鈣離子活動(dòng)的更細(xì) 微形式“鈣微粒”。鈣微粒”是目前發(fā)現(xiàn)的心肌鈣信 號系統(tǒng)的最小功能性釋放單位15。不僅如此，先進(jìn)的CLSM技術(shù)與膜片鉗技術(shù)的結(jié)合,甚至能讓人觀 察到少量的鈣離子是怎樣通過膜上的L.類鈣通道和肌質(zhì)網(wǎng)釋放通道來控制肌質(zhì)網(wǎng)對鈣的釋放16。5 4Pi共聚焦激光顯微鏡雙光子顯微鏡之后，4pi顯微鏡的出現(xiàn)大大增 強(qiáng)了共聚焦顯微鏡的分辨率，它是在雙光子顯微鏡的基礎(chǔ)上在一般的共聚焦光路上引入12個(gè)相對立的高數(shù)值孔徑物鏡，以增加光線收集器的角口徑。 改進(jìn)后的顯微鏡與傳統(tǒng)的CLSM相比,其空間分辨率大大增加，可達(dá)到100nm140nm的范圍，是普 通共聚焦顯微鏡分辨率的37倍17。但這種

16、方法在實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像上，因?yàn)闊晒庑盘栂鄬^弱，所得圖 像不夠清晰。最近有用水浸透鏡同 4Pi型顯微鏡相 結(jié)合的方式，解決了熒光信號較弱的問題，使得這類 顯微鏡也能夠用于活體標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測 18。6多焦點(diǎn)多光子共聚焦激光顯微鏡雖然雙光子共聚焦顯微鏡使共聚焦成像產(chǎn)生一 個(gè)質(zhì)的飛躍，但其掃描速度相對較慢,最近出現(xiàn)的多 焦點(diǎn)多光子顯微鏡(Multifo cal M ultiphotonM icroscope)較好地解狹了這一問題，其設(shè)計(jì)新穎的 分光鏡系統(tǒng)可以產(chǎn)生多重高穿透性的激光束 ，從而 產(chǎn)生多個(gè)焦點(diǎn)，不同的焦點(diǎn)互不干擾，因?yàn)椴煌募?光束之間有一個(gè)短暫的時(shí)間延擱。與以前的單焦點(diǎn)高了檢測速度。由

17、于檢測時(shí)間相對的縮短,進(jìn)一步降低了熒光劑對樣品的毒性作用19, 20。成像相比，利用這種技術(shù)能夠同時(shí)掃描視野中的多 個(gè)點(diǎn),克服了雙光子顯微鏡逐點(diǎn)掃描的缺點(diǎn)，大大提光產(chǎn)生效率，可使其用低強(qiáng)度的激光照射，減少了樣品的光漂白，從而更有利于實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的長期分析。將這種提高后的光學(xué)效率與快速掃描CLSM相結(jié)合，可以提高四維分析即長時(shí)間動(dòng)態(tài)的三維成像能力。 處理四維數(shù)據(jù)的軟件已經(jīng)用于細(xì)胞內(nèi)各種時(shí)實(shí)動(dòng)態(tài) 變化的分析。假若因焦點(diǎn)深度增加而信號衰退的問 題可以用適當(dāng)?shù)姆椒ń鉀Q的話，這種方法可用于配子、卵子等較大細(xì)胞內(nèi)的鈣變化追蹤。四維數(shù)據(jù)將會應(yīng)用于描述各種細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)反應(yīng)(如鈣波動(dòng))空間特征的數(shù)學(xué)模式，反過來這些數(shù)

18、學(xué)模式可以對以往靠 經(jīng)驗(yàn)觀察的圖像提供更深入的闡述。以上是近年來陸續(xù)出現(xiàn)的新型共聚焦激光顯微 鏡,盡管共聚焦激光顯微鏡的出現(xiàn)僅有十余年的時(shí) 間，但由于其獨(dú)特的激光掃描成像方式及精確的計(jì) 算機(jī)測量定位系統(tǒng)，使其在各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域發(fā)展非常 迅猛。由于CLSM新型功能和相關(guān)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，且價(jià)恪昂貴，了解該技術(shù)的基本知識，將有助于其引 進(jìn)、推廣和應(yīng)用。Refere nces1 WHIT E JG, A M OS WB. Confocal m icroscopy comes ofageJ . Nature, 1987,328(6126) : 183-184.2 M I NSKY M. Memoir on i

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22、l Colleg e,2001, 1 4(3): 174-176( in Chinese).第2期許險(xiǎn)峰等：共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)#7其他促進(jìn)共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)成像的技術(shù)還有其他一些技術(shù)也可促進(jìn)共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài) 成像,如增加傳統(tǒng)CLSM或轉(zhuǎn)盤型共聚焦顯微鏡的8 HU O Xia, L U Jian-xun, YA NG Ren-dong, et al. Study of optical sections and F-actin in amnion of early human embryo with Confocal Laser Scanning MicroscopyJ.A cta Anato

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