流式細胞儀(檢驗儀器)課件

1、流式細胞儀flow cytometer;FCM定義：將流體噴射技術(shù)、激光技術(shù)、空氣技術(shù)、射線能譜術(shù)及電子計算機等技術(shù)與顯微熒光光度計密切結(jié)合的一種非常先進的檢測儀器。通過測量細胞及其他生物顆粒的散射光和標記熒光強度，來快速分析顆粒的物理或化學(xué)性質(zhì)，并可以對細胞進行分類收集，可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個細胞特征參數(shù)，進行定性或定量分析，具有速度快、精度高、準確性好等特點。  流式細胞儀流式細胞儀是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定

2、的細胞亞群從中分選出來。多數(shù)流式細胞計是一種零分辨率的儀器，它只能測量一個細胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細節(jié) 分辨率為零。·  查看精彩圖冊目錄基本結(jié)構(gòu)工作原理技術(shù)參數(shù)調(diào)試和使用應(yīng)用展開基本結(jié)構(gòu)工作原理技術(shù)參數(shù)調(diào)試和使用應(yīng)用展開基本結(jié)構(gòu)組成流式細胞儀主要由四部分組成。它們是：流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。上圖為其結(jié)構(gòu)示意圖。流動室和液流系統(tǒng)流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計和制作均很精細，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣

3、品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號可發(fā)生振動。激光源和光學(xué)系統(tǒng)經(jīng)特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm

4、和藍光488nm的譜線最強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以647nm較強。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,則可得到550650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。為使細胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4f/D。為激光波長；f為透鏡焦距；D為激

5、光束直徑。色散棱鏡用來選擇激光的波長，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長。為了進一步使檢測的發(fā)射熒光更強，并提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區(qū)段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。光電管和檢測系統(tǒng)經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)

6、后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。光電倍增管（PMT）最為常用。PMT的響應(yīng)時間短，僅為ns數(shù)量級；光譜響應(yīng)特性好，在200900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續(xù)調(diào)節(jié)，因此對弱光測量十分有利。光電管運行時特別要注意穩(wěn)定性問題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因為光譜響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強光下穩(wěn)定性比PMT好。從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經(jīng)過放大后才能輸入

7、分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號，例DNA測量等。另一類是對數(shù)放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測量中常使用對數(shù)放大器。因為在免疫分析時常要同時顯示陰性、陽性和強陽性三個亞群，它們的熒光強度相差12個數(shù)量級；而且在多色免疫熒光測量中，用對數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié)便利、細胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點。計算機和分析系統(tǒng)經(jīng)放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數(shù)是和電信號的脈沖高度相對應(yīng)的，也是和光信號的強弱相關(guān)的。對

8、應(yīng)道數(shù)年縱坐標通常代表發(fā)出該信號的細胞相對數(shù)目。多道分析器出來的信號再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計算機的硬盤和軟盤上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的68個參數(shù)。存貯于計算機內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實測后脫機重現(xiàn)，進行數(shù)據(jù)處理和分析，最后給出結(jié)果。除上述四個主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。工作原理下面分別簡要介紹流式細胞儀有關(guān)的參數(shù)測量、樣品分選及數(shù)據(jù)處理等工作原理。參數(shù)測量原理流式細胞儀可同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單

9、個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射會向立體角為2的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因為這些生物學(xué)參數(shù)又和細胞對光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經(jīng)染色活細胞進行分析和分選。經(jīng)過固定的和染色處理的細胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號當(dāng)然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。在流式細胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：前向角（即0角）散射（FSC）；側(cè)向散射（

10、SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經(jīng)實驗表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對于形狀復(fù)雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測量主要用來獲取有關(guān)細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關(guān)，但它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時，可

11、鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。熒光信號主要包括兩部分：自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學(xué)等測量中，對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關(guān)鍵。一般說來，細胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高

12、，自發(fā)熒光越強。減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：盡量選用較亮的熒光染料；選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；采用電子補償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。樣品分選原理流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的?？偟倪^程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。穩(wěn)定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數(shù)百m。實驗經(jīng)驗公

13、式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數(shù)十ms。精確測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來產(chǎn)生延遲?？筛鶕?jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。（50）數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解

14、決的具體問題而定。數(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖、二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。直方圖是一維數(shù)據(jù)用作最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般XY平面描圖儀給出的曲線。根據(jù)選擇放大器類型不同，坐標可以是線性標度或?qū)?shù)標度，用“道數(shù)”來表示,實質(zhì)上是所測的熒光或散射光的強度。坐標一般表示的是細胞的相對數(shù)。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個參數(shù)與細胞之間的關(guān)系是它的局限性。二維點圖能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系。坐標和坐標分別為與細胞有關(guān)的兩個獨立參數(shù)，平面上每一個點表示同時具有相應(yīng)坐標植的細胞存在（圖10-3）?？梢杂啥S點

15、圖得到兩個一維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點圖的信息量要大于二個一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個細胞具有相同的二維坐標在圖上只表現(xiàn)為一個點，這樣對細胞點密集的地方就難于顯示它的精細結(jié)構(gòu)。    圖10-2直方圖 圖10-3二維點圖二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高所代表的細胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。假三維圖是

16、利用計算機技術(shù)對二維等高圖的一種視覺直觀的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中的隱坐標細胞數(shù)同時顯現(xiàn)，但參數(shù)維圖可以通過旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細節(jié)，這無疑是有助于對數(shù)據(jù)進行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。    圖10-4二維等高圖 圖10-5假三維圖列表模式其實只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計算機存貯方式，三個以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的。可用ListMode中的特殊技術(shù)，開窗或用游標調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進行顯示。例如，“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來；“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來。

17、圖10-6給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。  圖10-6從二維圖設(shè)窗調(diào)出直方圖示意上面簡要地介紹了幾種數(shù)據(jù)顯示形式，在實際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來自所測的數(shù)據(jù)。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標準偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用最小二乘法。而非參

18、數(shù)分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進行比較。逐點描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統(tǒng)）是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們?？梢杂脕砹私鈹?shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計分析的模型、顯示最終結(jié)果等。事實上，不經(jīng)過先對數(shù)據(jù)進行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對這批數(shù)據(jù)進行數(shù)值分析。從這一點來看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對照組和測試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組

19、、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進行比較時對曲線的總細胞數(shù)進行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到“差結(jié)果曲線”往往是適宜的。因為數(shù)據(jù)分析往往和結(jié)果解釋關(guān)系十分密切，也就是說和生物學(xué)背景相關(guān)，因此具體的分析法和原理將在后面結(jié)合實例再介紹。技術(shù)參數(shù)指標為了表征儀器性能，往往根據(jù)使用目的和要求而提出幾個技術(shù)參數(shù)或指標來定量說明。對于流式細胞儀常用的技術(shù)指標有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測量參數(shù)等。熒光分辨率強度一定的熒光在測量時是在一定道址上的一個正態(tài)分布的峰，熒

20、光分辨率是指兩相鄰的峰可分辨的最小間隔。通常用變異系數(shù)（C.V值）來表示。C.V的定義式為：C.V=/式中，為標準偏差，是平均值。在實際應(yīng)用中，我們使用挖關(guān)系式=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。目前儀器的熒光分辨率均優(yōu)于2.0%。熒光靈敏度反映儀器所能探測的最小熒光光強的大小。一般用熒光微球上所標可測出的FITC（fluorescein isothiocyanate 異硫氰基熒光素）的最少分子數(shù)來表示。目前儀器均可達到1000左右。分析速度/分選速度儀器每秒種可分析/分選的數(shù)目。一般分析速度為500010000；分選速度掌握在1000以下。樣品濃度主要給出儀器工作時樣

21、品濃度的適用范圍。一般在1010細胞/ml的數(shù)量級。其它技術(shù)參數(shù)尚多，不再一一介紹。調(diào)試和使用簡介古語說：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應(yīng)用流式細胞分析和分選技術(shù)，必需先對儀器進行調(diào)試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡要介紹細胞計的調(diào)試項目及要點、使用的程序等等。調(diào)試和校準流式細胞儀在使用前，甚至在使用過程中都要精心進行調(diào)試，以保證工作的可靠性和最佳性。調(diào)試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區(qū)的光路等。激光強度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為最大。液流速度：可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié)氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。測量區(qū)光路調(diào)節(jié)：這是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點較小。一般可在用標準熒光微球等校準中完成。流式細胞術(shù)中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進行校準或標定，這樣才能通過相對測量獲得絕對的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的準直調(diào)整和定量標度。標準樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟、容易獲得。常用標準熒光微球作為非生物學(xué)標準樣品，雞血紅細胞做為生物學(xué)標準樣品。微球用樹脂材料制作，或標有熒光素，或不