小白菜葉綠素含量的測定方法的比較_徐芬芬(精)

1、#研究簡報#北方園藝 2010(23 :3234第一作者簡介：徐芬芬（1978-,女,江西奉新人，碩士，講師，現(xiàn)主要從事植物 生理教學(xué)與研究工作。E-mail:xffylm7875163. com。基金項目：江西省教育 廳2010年度青 年科學(xué)基金資助項目（GJJ10255 ;上饒師范學(xué)院2010年教學(xué)改 革研究資助項目。收稿日期:2010-09-06小白菜葉綠素含量的測定方法比較徐芬芬，葉利民，徐衛(wèi)紅，鄭靜萍（上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江西上饒334001摘要:以小白菜為試材，研究了 5種提取方法對小白菜葉片葉綠素提取效果的影響，并測定葉綠素在5種不同提 取液中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明:小白菜葉綠

2、素提 取效果最好的是混合液（乙醇B丙酮=1B 1浸提法，其次為混合液（乙醇B丙酮B水=4. 5B 4. 5B 1浸提法和混合液（乙醇B丙酮=2B 1浸提法，丙酮研磨法和乙醇 浸提法效果較差。關(guān)鍵詞：小白菜；葉綠素；提取方法；穩(wěn)定性中圖分類號:S 634. 3文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1001-0009（201023-0032-03葉綠素是光合作用最重要的產(chǎn)物，同時葉綠素含量也是植物重要的生理指標(biāo) 之一。因此，研究葉綠素的提 取方法意義重大。葉綠素含量測定方法一般有分光 光度法、活體葉綠素儀法和光聲光譜法，以分光光度法應(yīng)用最廣泛。因所用提取 葉綠素的溶劑不同又有多種測 定方法，早期葉綠素 測定廣泛

3、采用Aron法1,但該 方法由于先研磨后除渣，工作量大、步驟多，且容易受光氧化 而引起偏差，不適宜田間大量樣品的提取和測定2。徐邦發(fā)等3通過比較幾種不同混合提取液的 提取，提出測定棉花葉片葉綠素含量的最佳方法為丙酮浸提法。陳福明等4和劉絢霞等 分別對不同配比的丙酮、乙醇和水的混合液的浸提效果進(jìn)行了研究 證明利用混合液進(jìn) 行葉綠素浸提的可行性。洪法水等 研究表明，丙酮與乙醇 混合液提取葉綠素存在協(xié)同效應(yīng)，且二者在等摩爾 混合時提取效果最好，而彭運(yùn)生 等7研究認(rèn)為，丙酮乙醇(2B 1混合液浸提葉綠素效果較好。該試驗在前人 研究 的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討葉綠素含量測定各方法的優(yōu) 劣及快速測定的步驟，為小白

4、菜 田間大樣本葉綠素含量測定提供依據(jù)。1材料與方法1. 1試驗材料將新鮮小白菜葉片洗凈、 晾干、去大葉脈后剪碎混 勻。試驗采用752S紫 外可見分光光度計，丙酮、95%乙醇等試劑均為分析純，試驗用水為二次水。1.2 試驗方法1.2. 1不同浸提液提取效果試驗 稱取0. 5g試材于試管中，剪取葉片成2mm碎條，在室溫下立即用 丙酮研磨法和直接浸提法(4種提取液:95%乙醇,丙酮、乙醇(1B 1 , 95%乙醇、丙酮、水(4.5B 4. 5B 1,丙酮、95%乙醇(2B 1提取葉綠素,3次重復(fù)。研磨法參照張志良方 法8。浸提在黑暗中進(jìn)行，每支試管加入浸提 液10mL,并不時搖動，等葉片變白， 約1

5、4h后定容25mL,測定吸光值。室溫下以相應(yīng)試劑為參比,分別在645nm和663nm處測定吸光度,由Arnon公式計算葉綠 素a與葉綠素b的含量。葉綠素a(chla 含量(mg/g =(12. 7A663-2. 69A645 V/(1000W ;葉綠素 b(chb 含量 (mg/g=(22. 7A645-4. 68A663 V/(1000W;葉綠素總含量(mg/g =chla 含量 +chlb含量。式中A663、A645分別為相應(yīng)波長下的吸光度值,V為提取液 體積,W為所取葉片質(zhì)量。1.2. 2不同浸提液提取效果及穩(wěn)定性試驗 光穩(wěn)定性 試驗：將樣品于測定后見光放置，分別于放置1、3、5h后再次

6、測定提取液中葉 綠素的變化，比較葉綠素在 不同提取液中的穩(wěn)定性。熱 穩(wěn)定性試驗：用浸提法進(jìn)行葉綠素 提取試驗，取提取 液10mL于有塞試管中,水浴中加熱,分別在30、50、70e條件下保溫10min,冷 卻到室溫后，測定葉綠素含量。2結(jié)果與分析2. 1不同提取方法的提 取效果及光穩(wěn)定性比 較由表15可知，5種不同提取方法以混合液（乙醇B丙酮=1B 1浸提法所得總 葉綠素含量最高（為0. 438;乙醇浸提法最低（僅0. 305;其它3種提取方法 相差不 大。降解值以丙酮研磨法最快（為0. 263 ;混合液（乙醇B丙酮B水=4. 5B 4. 5B 1 浸提法其次（為0. 208 ;混合液（乙醇B丙

7、酮=2B 1和混合液（乙醇B丙酮=1B 1浸 提法較慢（分別為0. 185和0. 165。說明，丙酮研磨法可能因研磨 過程破壞了葉綠 體，所提取的葉綠 素在光下極不穩(wěn)定。而混合液（乙醇B丙酮=2B 1和北方園藝2010（23 :3234#研究簡報#混合液（乙醇B丙酮=1B 1浸提法可獲得較高的葉綠 素含量，同時在光下 也 有較好的穩(wěn)定性。隨見光時間的延長，各種提取方法均以葉綠素a降解值遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于葉綠素b。不同提取方法葉 綠素a降解值在0. 1330. 288之間變化,而葉綠素b降解值0.020 0. 053之間變化。另外，每種提取方法的chla/c hlb值均隨見光時間的延長表 現(xiàn)出逐漸減小的趨

8、勢，也可反映出 表1丙酮碾磨法所得葉綠素 含量及光穩(wěn)定性比 較丙酮碾 磨 0h 1h 3h 5h 7h降解 值 chla 0. 3030. 2400. 1230. 0980. 0750. 228 chlb 0.1000. 0880. 0830. 0700. 0650. 035 c hla+b 0. 4030. 3280. 2050. 1680. 1400. 263 chla/chib 3. 0252. 7431.4851.3931. 154注：降解值=各時間點(diǎn)比前一時間點(diǎn)相差之和，下同。表2乙醇浸提法所得葉綠素含 量及光穩(wěn)定性比較 乙醇浸 提0h 1h 3h 5h 7h降解 值 chla 0.

9、 1950. 1400. 1050. 0900. 0550. 140 chlb 0. 1100. 0850. 0730. 0630. 0580.053 c hla+b 0. 3050. 2250. 1780. 1530. 1130. 193 chla/chib 1. 7701.6501.4501.4400.960表3乙醇B丙酮=1B 1浸提法所得葉綠素 含量及光穩(wěn)定性比較乙醇 B 丙酮=1B 1 浸提 0h 1h 3h 5h 7h 降解值 chia 0. 3080. 2600. 2330. 2050.1600. 148 c hl b 0. 1300. 1100. 1000. 0980. 093

10、0. 038 chia +b 0. 4380. 3700. 3330. 3030.2530. 185 c hl a/c hl b 2. 3652. 3642. 3252. 1031. 730表4乙醇B丙酮=2B 1浸提法所得葉綠素 含量及光穩(wěn)定性比較乙醇 B 丙酮=2B 1 浸提 0h 1h 3h 5h 7h 降解值 c hl a 0. 3000. 2350. 2030. 1850.1680. 133 c hlb 0. 1080. 0980. 0900. 0830. 0750. 033 c hl a+b 0. 4080. 3330. 2930. 2680.2430. 165 c hla/chl

11、b 2. 7912. 4102. 2502. 2422. 233表5乙醇B丙酮B水=4. 5B 4. 5B 1浸提法所得 葉綠素 含量及光穩(wěn)定性比較乙醇B丙酮B水=4. 5B 4. 5B 1 浸提0h 1h 3h 5h 7h 降解值 c hl a 0. 3080. 2680. 2150. 1730. 1200. 188 c hlb 0. 0980.0950. 0930. 0830. 0780. 020 c hl a+b 0. 4050. 3630. 30820. 25520. 1980. 208 c hla/chlb 3. 1542. 8162. 3242. 0911.548葉綠素a降解速度快

12、于葉綠素b。說明在可見光下，葉綠素a較葉綠素b更易降解。2. 2不同浸提液提取方 法的熱穩(wěn)定性比較由表6可知,各浸提方法所得chla、chlb和Chla+b含量均隨溫度升高而降低,在70e下，乙醇浸提法幾乎 全變褐色，而其它處理仍可見到綠色，其中，以混合液（乙醇B丙酮=1B 1浸提法Chla+b含量為最高。說 明,單一乙醇浸提所得葉綠素含量較低且不穩(wěn)定，而加入丙酮后葉綠素含量提高且較穩(wěn)定。各處理 chia/chib值也隨溫度升高而減小，說明在高溫下葉綠素a較葉綠 素b更易降解，與在光下的變化一致。表6不同提取方法的熱穩(wěn)定性 比較e浸提液30c hla chib Chia +b chia /ch

13、i b50c hl a chib Chia +b chia /chi b70c hi a chib Chia+b chia /chi b10. 2700. 0930. 3632. 9030. 2200. 0830. 3032. 6510. 1050. 0440. 1492. 386 20.2780. 1150. 3932. 4170. 2380. 1030. 3412. 3110. 1460. 0780. 2241.872 30. 2500. 0830.3333. 0120. 1900. 0660. 2562. 8790. 1660. 0480. 2142. 862 40. 1640. 085

14、0. 2491. 9290.0960. 0520. 1481.8460. 0540. 0360. 0901.50注 :1,丙酮 B 乙醇（2B 1 ; 2,丙酮 B 乙 醇（1B 1 ; 3,乙醇B丙酮B水（4. 5B 4. 5B 1 ; 4,乙醇。3小結(jié)與討論混合液浸提法不但所得葉綠素含量高于乙醇浸提法,且對光熱的穩(wěn)定性也優(yōu)于乙醇浸提法。其中以混合 液（乙醇B丙酮=1B 1浸提所得葉綠素含量最高。試 驗中單一乙醇浸提所得葉綠素含量較低，且不穩(wěn)定，當(dāng)加入丙酮后葉綠素提取更完全，且穩(wěn)定性較好。結(jié)果表 明，丙酮與乙醇混合液提取葉綠素存在協(xié)同效應(yīng)，且二者在等摩爾混合時提取效果最好，這與洪法水等3研究

15、結(jié)果一致。試驗中丙酮研磨法也可得到較高的葉綠素含量，這與前人4,7研究結(jié)果不同，具體原因有待于進(jìn)一步研究。但因研磨法所提取的葉綠素在光下極不穩(wěn)定，因而 這種方法也不可取。綜合分析得出，小白菜葉綠素提取效果 最好的是混合液（乙 醇B丙酮=1B 1浸提法，其次為混 合液（乙醇B丙酮B水=4. 5B 4. 5B 1浸提法和 混合液（乙醇B丙酮=2B 1浸提法，丙酮研磨法和乙醇浸提法 效果最差。隨見光時間的延長和溫度的增加，各種提取方法均以葉綠素a降解值遠(yuǎn)遠(yuǎn)快 于葉綠素b。說明葉綠素a降解速度快于葉綠素b,這與李得孝等9和郭勝偉等10的研究結(jié)果一致。結(jié)果 表明，影響葉綠素提取效率的關(guān)鍵 是葉綠素a的提

16、取 速度及其穩(wěn)定性保持。參考文獻(xiàn)1Ar non D I. Copper En zymes in Isolated Chlor oplas ts Pheno loxi dases i n BetaVulgaris J. P la nt P hys iol, 1949, 24:1-15.2蘇正淑，張憲政.幾種測定植物葉綠素含量的方法比較J.植物生理學(xué)通訊, 1989, 5:77-78.3徐邦發(fā)，徐雅麗.棉花葉片的葉綠素含量測定J.塔里木農(nóng)墾大學(xué) 學(xué)報,1995, 7(2:29-31.4陳福明，陳順偉.混合液法測定葉綠素含量的研究田J.林業(yè)科技 通訊,1984(2:4-8.#研究簡報#北方園藝 20

17、10(23 :3436劉絢霞，董振生，劉創(chuàng)社，等.油菜葉綠素提取方法研究J .中國農(nóng)學(xué)通報, 2004, 20(4:62-63.洪法水，魏正貴，趙貴文.菠菜葉綠素的浸提和協(xié)同萃取反應(yīng)J.應(yīng)用化學(xué), 2001,8(7:532-535.7彭運(yùn)生，劉恩.關(guān)于葉綠素方法的比較研究田J.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué) 報，1992,18(3:247-249.8張志良，瞿偉菁.植物生理學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)M.3版.北京:高等教育出版社, 2003:67-70.9李得孝，郭月霞，員海燕，等.玉米葉綠素含量測定方法研究J.中國農(nóng)學(xué) 通報，2005, 25(6:153-155.10郭勝偉，高云東.比色法測定中華蘆薈葉片中葉綠素含量方法的

18、研究J.中醫(yī)藥學(xué)刊，2004, 22(1:53-76.C 0 mp aris on of Method s o f C h lorop hyll Extractio n in C hin ese C ab b ageXU Fen -fen, YE L-i min, XU We-i hong , ZHENG Jing -ping(Dep artme nt of Life Scie nee, Sha ng rao Normal College,Sha ngrao, Jia ngx i 334001A bstract:The effects of five kinds of extracti on

19、methods on the chlor op hyll ex tractio n and extract stability in Chin ese cabbage Chlor op hyll were studied. The results showed that the best extract ion method w as the extract ion mixture (etha nol B acet one =1B 1 , followed by waere the mixture (etha nol B acet one B w ater =4. 5B 4. 5B 1 and

20、 the mixture (etha nolB acet one =2B 1 extract ion, acet one and etha nol extracti on grinding were the w orst extracti on method. Key words:Ch in ese cabbage; chlor op hyll; extracti onmethod; stability第一作者簡介：劉樂承(1964-,男，博士，教授，現(xiàn)主要從事園藝植物育種的教學(xué)與研究工作 。E -mail:lchliu18yangtzeu. edu. cn。收稿日期:2010-09-19茼蒿品種比較試驗劉樂承，張洪濤（長江大學(xué) 園藝園林學(xué)院,湖北荊州434025摘要:從植物學(xué)性狀、生物學(xué)性狀、產(chǎn)量等方面對茼蒿進(jìn)行品種比較。結(jié) 果表明：在荊州及類似地區(qū),大葉茼蒿（湖南,CK、大葉茼蒿（湖北2個品種有推 廣價值，2個小葉品種茼蒿（遼寧、密圍（山東有推廣價值，而