鞘內(nèi)注射重組人白細(xì)胞介素10對大鼠CCI模型中HMGB

1、鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對CCI大鼠的痛閾及HMGB1表達(dá)的影響中南大學(xué)湘雅醫(yī)院麻醉科賀正華 郭曲練 肖目張 蔣碧梅 顏璐璐 于鵬【摘 要】目的 構(gòu)建含人白細(xì)胞介素10基因的重組慢病毒載體（Lentivector，LV）LV/hIL-10，觀察鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對坐骨神經(jīng)松結(jié)扎模型（chronic constriction injury，CCI）大鼠的痛閾及高遷移率族蛋白-1（High Mobility Group Box1，HMGB1）表達(dá)的影響，探討IL-10對CCI大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)的可能機(jī)制。為慢性神經(jīng)病理性疼痛的治療提供新的理論依據(jù)。方法 純種健康清潔級成年雄性SD大鼠135只,

2、隨機(jī)分為9組: CCI疼痛模型4組（C0、C1、C2、C3），假手術(shù)4組（S0、S1、S2、S3）和正常對照組（N組）。分別給予蛛網(wǎng)膜下腔注射LV/hIL-10（C1組、S1組）、LV/GFP（C2組、S2組）、生理鹽水（C3組、S3組），C0組、S0組為對照組（不做鞘內(nèi)置管，不給藥）。觀察各組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)痛閾的改變及脊髓、腦皮質(zhì)、海馬中HMGB1的表達(dá)情況；構(gòu)建LV/hIL-10，通過鞘內(nèi)置管注入LV/hIL-10，觀察神經(jīng)組織中IL-10的表達(dá)及對CCI大鼠痛閾和HMGB1表達(dá)的影響。結(jié)果 CCI大鼠術(shù)后7d痛閾明顯下降，同時(shí)伴有HMGB1表達(dá)上調(diào)，14d時(shí)仍維持較高的水平；鞘內(nèi)注射LV

3、/hIL-10 后CCI大鼠神經(jīng)組織中的IL-10表達(dá)明顯上調(diào)；CCI大鼠鞘內(nèi)注射LV/hIL-10 3d后痛覺異常明顯緩解，脊髓中HMGB1的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論 HMGB1在CCI大鼠脊髓內(nèi)的表達(dá)明顯上調(diào)，且出現(xiàn)較晚、維持時(shí)間較長；鞘內(nèi)注射LV/hIL-10后，對CCI大鼠有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并且能顯著抑制HMGB1在CCI大鼠脊髓內(nèi)的表達(dá)，提示HMGB1可能成為慢性疼痛治療的一個(gè)新靶點(diǎn)?！娟P(guān)鍵詞】 坐骨神經(jīng)松結(jié)扎模型；高遷移率族蛋白-1；神經(jīng)病理性疼痛；LV/hIL-10；基因治療神經(jīng)病理性疼痛是一種難治性的慢性疼痛綜合癥，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，療效欠佳。疼痛的轉(zhuǎn)基因治療是一種全新的治療措施，可能提供

4、滿意的治療效果1。病毒載體的生物學(xué)特性決定了其臨床應(yīng)用前景，慢病毒載體2與其它病毒載體相比可以感染分裂期和非分裂期的細(xì)胞，且抗原性和毒性很小，能插入較大的外源基因片段，并可以在體內(nèi)較長期的表達(dá)，且安全性較好，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中作用顯著。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制仍不是很清楚，最近有研究3認(rèn)為神經(jīng)病理性疼痛與脊髓早期炎癥介質(zhì)如TNF-、IL-1和IL-6的高表達(dá)密切相關(guān)。HMGB1是最近發(fā)現(xiàn)的一種晚期炎癥介質(zhì)4，然而HMGB1是否參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持？目前仍不清楚。IL-10是重要的抗炎細(xì)胞因子,有研究5證明IL-10對脊髓損傷、慢性坐骨神經(jīng)壓迫性損傷、鞘內(nèi)注射gp120(HI

5、V1的包膜蛋白)等原因?qū)е碌拇笫笊窠?jīng)病理性疼痛有顯著治療作用，且發(fā)現(xiàn)IL-10的鎮(zhèn)痛機(jī)制與抑制早期炎癥介質(zhì)如TNF-、IL-1和IL-6的表達(dá)及釋放有關(guān)，HMGB1是否也參與了IL-10的鎮(zhèn)痛機(jī)制呢？材料與方法主要儀器與試劑 2390觸覺測痛儀（美國IITC 公司）；7370熱痛儀（意大利UGO公司）；鳥類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶（Takara公司）；Taq酶（Promega公司）；兔HMGB1單克隆抗體（Stressgen公司）；Trizol試劑（Gibco公司）；IL-10 ELISA試劑盒（麗欣公司）；DH5大腸桿菌菌種購自Promega公司；人胚腎T細(xì)胞(293T)細(xì)胞株購自湘

6、雅細(xì)胞中心；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y購自ATCC。慢病毒載體的構(gòu)建 含IL-10 CDS序列的pCYIL-10質(zhì)粒由Dr.Xianmin Meng(Thomas Jefferson University，Philadelphia，PA)惠贈，Lentivector：pWPXL-GFP，Packaging plasmid ：psPAX2，Envelope plasmid：pMD2.G， 瑞士Prof.Didier Trono惠贈。合成引物，以pCYIL-10質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出hIL-10基因，并重組到質(zhì)粒pWPXL-GFP，酶切、測序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒pWPXL- hIL-1

7、0與包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，包裝出復(fù)制缺陷的慢病毒顆粒，進(jìn)行病毒滴度的測定，結(jié)果見圖1。動(dòng)物選擇與分組處理 清潔級雄性SD大鼠，體重在220260g 之間，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。隨機(jī)分為9組：CCI+LV/hIL10（C1組）， CCI+空載體（C2組）， CCI+生理鹽水（C3組）， CCI（不做鞘內(nèi)置管，不給藥）（C0組），sham+ LV/hIL10（S1組）， sham+空載體（S2組）， sham+生理鹽水（S3組）， sham（不做鞘內(nèi)置管，不給藥）（S0組），正常對照組（不做任何處理）。（N組），每組15只。CCI疼痛模型和假手術(shù)組術(shù)

8、后3天測痛閾后，治療組分別蛛網(wǎng)膜下腔注射LV/hIL-10、空載體、生理鹽水各10l，再用生理鹽水10l沖管，總?cè)萘?0l。觀察術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d痛閾的改變以及給藥后3d、7d、14d時(shí)點(diǎn)脊髓、腦皮質(zhì)、海馬中IL-10、HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)。C0組、N組與S0組同時(shí)點(diǎn)觀察。保持動(dòng)物在室溫22-25度，正常晝夜節(jié)律、避強(qiáng)光和噪音的刺激，自由進(jìn)食和飲水，手術(shù)后單籠喂養(yǎng)。大鼠鞘內(nèi)置管 用10 % 水合氯醛300mg/ kg 腹腔注射麻醉大鼠后，按改良的Yaksh法6鞘內(nèi)置入Microspinal導(dǎo)管至脊髓腰段（置入長度約），單籠飼養(yǎng)3d后選擇沒有任何運(yùn)動(dòng)障礙的大鼠往導(dǎo)管

9、內(nèi)注射2%利多卡因15l，觀察30s，如果利多卡因注入鞘內(nèi)動(dòng)物會出現(xiàn)雙后肢麻痹現(xiàn)象（表現(xiàn)為后肢拖地行走），如無此現(xiàn)象證明鞘內(nèi)置管無效即淘汰不用，將置管有效的大鼠第二天做CCI模型和假損傷模型。CCI模型的建立 參考Bennett等方法7 ，大鼠用10 % 水合氯醛300mg/ kg 腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，無菌條件下于左股骨中部作縱向切口分離股二頭肌暴露坐骨神經(jīng)干，用4-0鉻制羊腸線輕度結(jié)扎4道，以神經(jīng)外膜輕輕受壓為宜，結(jié)扎間距約為1mm，強(qiáng)度以引起小腿肌肉輕度顫動(dòng)為宜，假損傷組暴露坐骨神經(jīng)不結(jié)扎，術(shù)畢每只大鼠肌注青霉素4萬單位預(yù)防感染。機(jī)械縮爪閾值（Paw withdrawal mech

10、anical threshold，PWMT）測定 將動(dòng)物放入測試圍欄中待其安靜后用探針持續(xù)用力刺向大鼠后爪，大鼠縮腿時(shí)記錄屏幕上顯示的壓力大小，精確度為，該壓力值即為PWMT值，重復(fù)測定3次（間隔5分鐘）取平均值。熱潛伏縮爪閾值（Paw withdrawal thermal latency ，PWTL）測定 將動(dòng)物放入測試圍欄中待其安靜，將I.R.(紅外)光源移到正對動(dòng)物后爪下面，按控制器進(jìn)行測試，當(dāng)動(dòng)物因感覺疼痛將后爪抬起后，記錄顯示器的時(shí)間，精確度為0.1秒，該時(shí)間即為PWTL值。設(shè)定最長的照射時(shí)間為20s，如果20s仍無縮爪反應(yīng)記為20s；重復(fù)測量3次（間隔5分鐘）取平均值。標(biāo)本收集 3

11、d、7d、14d各時(shí)點(diǎn)的痛閾測試完畢后立即在深麻醉下處死大鼠，在冰面上快速取出大腦皮質(zhì)、海馬、以及腰段脊髓分別裝入凍存管，迅速放入液氮罐冷凍，-80保存待測。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription polymerase chain reaction ，RT-PCR）用Trizol 試劑提取組織中的總RNA，并用DNA酶1消化除去總RNA中的微量DNA；1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA。紫外分光光度計(jì)測量A260nm/A280nm比值。用鳥類成髓細(xì)胞瘤病毒 (AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈; 用1的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板 ，以看家基因GAPDH作為內(nèi)參，采用Primer 5.0

12、設(shè)計(jì)引物， HMGB1序列：上游5GTACGG TACCAAGTGCATTTTGGAGGAATT-3，下游5GTACAAGCTT GTACTGCA ATGGCTGTGAGA-3 ；GAPDH序列：上游5-AAGCCCATCACCATCTT CCA-3， 下游5-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定HMGB1和GAPDH基因的PCR反應(yīng)條件分別如下：HMGB1：94變性2min后進(jìn)行循環(huán)， 95變性30，58退火30， 72延伸30，共循環(huán)25次，最后72延伸5min，產(chǎn)物大小658bp GAPDH：94變性2min后進(jìn)行循環(huán)，95變性30， 59退火30， 72延伸30

13、， 共循環(huán)22次，最后72延伸5min，產(chǎn)物大小582bp。 PCR反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色后于紫外透射儀攝像。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immuno-sorbent assay， ELISA）按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，200L濃度為2g蛋白/l組織裂解液中細(xì)胞因子經(jīng)ELISA kits檢測，采用雙抗體夾心ELISA法檢測大鼠神經(jīng)組織中抗炎細(xì)胞因子IL-10的蛋白含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）按蛋白提取試劑盒提取手冊提取各組織蛋白， 收集蛋白質(zhì)，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量后，取20g蛋白質(zhì)樣品經(jīng)10%SDS-

14、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、轉(zhuǎn)膜和2%白蛋白4封閉過夜后，依次加入一抗、辣根過氧化酶（HRP）偶聯(lián)的二抗室溫孵育2h，DAB顯色，拍攝照片，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法為完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析（One-way Analysis of Variance，ANOVA），組間多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用SNK-q檢驗(yàn)(Student-Newman-Kela，S-N-K法)，以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié) 果 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的慢病毒載體是第二代

15、慢病毒載體系統(tǒng)，由Lentivector: pWPXL-GFP， Packaging plasmid:psPAX2， Envelope plasmid:pMD2.G三質(zhì)粒組成。目的基因片段是IL-10，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、酶切、連接成功地構(gòu)建了pWPXL-IL-10質(zhì)粒，測序檢驗(yàn)正確。用磷酸鈣沉淀法將三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，12 h 后在熒光顯微鏡下均觀察到GFP 的表達(dá)。轉(zhuǎn)染72 h 后，GFP 熒光強(qiáng)度均較12 h 明顯增強(qiáng)，在每一視野下，GFP 表達(dá)的陽性包裝細(xì)胞達(dá)50 %左右（圖1-A，B）。將轉(zhuǎn)染72h后的包裝細(xì)胞上清液，進(jìn)行超速離心，按梯度稀釋后，再感染SH-SY5Y細(xì)胞(此時(shí)S

16、H-SY5Y作為靶細(xì)胞)，48h后測定6孔板中慢病毒載體濃度，結(jié)果為2×1010U/L。將病毒稀釋105倍后，感染SH-SY5Y細(xì)胞（圖1-C，D）。 CDBA圖1：T細(xì)胞。A，轉(zhuǎn)染后可見光下細(xì)胞 B，轉(zhuǎn)染后熒光下細(xì)胞；C，D：病毒上清感染SH-SY5Y細(xì)胞。C，感染后可見光下細(xì)胞 D，感染后熒光下細(xì)胞（x400）2. 鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對大鼠腦皮質(zhì)、海馬、腰段脊髓內(nèi)IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)的影響RT-PCR測定大鼠鞘內(nèi)注射LV/hIL-10后不同時(shí)間腰段脊髓內(nèi)IL-10 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，鞘內(nèi)注射LV/hIL-10后3d、7d均有顯著表達(dá)，3d表達(dá)

17、最明顯，14d時(shí)表達(dá)明顯下調(diào)（圖2-A）。而且鞘內(nèi)注射LV/hIL-10 3d后脊髓組織中的IL-10 mRNA表達(dá)最高，腦皮質(zhì)、海馬內(nèi)的表達(dá)較少（圖2-B）。ELISA分析發(fā)現(xiàn)，大鼠鞘內(nèi)注射LV/hIL-10后，腦皮質(zhì)、海馬、腰段脊髓內(nèi)IL-10的蛋白分泌明顯增高， 3d達(dá)高峰，7d有所減少（P<0.05）（圖2-C）。BAIL-10GAPDHVect 3d 7d 14dIL-10皮質(zhì) 脊髓 海馬IL-10GAPDH*C圖2. 鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對大鼠腦皮質(zhì)、海馬、腰段脊髓內(nèi)IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。A. RT-PCR檢測大鼠鞘內(nèi)注射LV/hIL-10不同時(shí)間后腰段

18、脊髓內(nèi)IL-10 mRNA的表達(dá)；大鼠鞘內(nèi)注射LV/hIL-10不同時(shí)間后腦皮質(zhì)、海馬、腰段脊髓內(nèi)IL-10的蛋白表達(dá)（*，VS 空載體組 P<0.05）。3. CCI大鼠腦皮質(zhì)、海馬、腰段脊髓內(nèi)HMGB1的表達(dá) RT-PCR測定CCI模型大鼠腰段脊髓HMGB1的mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，術(shù)后7d HMGB1 mRNA開始增加，14d表達(dá)最明顯（圖3-A）。檢測術(shù)后14d大鼠腦皮質(zhì)、腰段脊髓、海馬中HMGB1mRNA的表達(dá)，在脊髓中的表達(dá)最明顯（圖3-B）。Western Blot測定大鼠CCI術(shù)后7d脊髓中HMGB1的蛋白表達(dá)明顯增多，14d時(shí)表達(dá)更加明顯（圖3-C）。Western B

19、lot測定CCI大鼠14d腦皮質(zhì)、腰段脊髓、海馬中HMGB1的蛋白表達(dá)，與腦皮質(zhì)、海馬比較，脊髓中HMGB1的蛋白表達(dá)明顯增多（圖3-D）。HMGB1GAPDH皮質(zhì) 脊髓 海馬Ctrl Sham 3d 7d 14dCCIA1 2 3GAPDHHMGB1BCtrl Sham CCI-3d CCI-7d CCI-14dHMGB1GAPDHCHMGB1GAPDHD 圖3 CCI大鼠腰段脊髓內(nèi)HMGB1的表達(dá). A, RT-PCR檢測CCI大鼠術(shù)后不同時(shí)間腰段脊髓內(nèi)HMGB1 mRNA的表達(dá)；B, RT-PCR測定CCI模型14d大鼠腦皮質(zhì)、腰段脊髓、海馬中HMGB1的mRNA表達(dá), 1, 腦皮質(zhì)；2

20、，腰段脊髓；3，海馬。C, Western Blot測定不同時(shí)點(diǎn)大鼠腰段脊髓中HMGB1的蛋白表達(dá);D, Western Blot測定CCI大鼠模型14d腦皮質(zhì)、腰段脊髓、海馬中HMGB1的蛋白表達(dá). Ctrl，正常對照組；Sham，假手術(shù)組；GAPDH，內(nèi)參。4. 鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對CCI大鼠痛閾的影響手術(shù)同側(cè)機(jī)械性觸誘發(fā)痛（PWMT）和熱刺激誘發(fā)痛（PWTL）的測定：C0組與C1，C2，C3 組比較BL值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）（圖4-A、B） 假手術(shù)各組組間PWMT測定結(jié)果、PWTL測定結(jié)果的差異比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4-C、D）。手術(shù)對側(cè)PWMT測定結(jié)果：C

21、0組與C1，C2，C3 組比較BL值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）（圖4-E）。假手術(shù)各組組間對側(cè)PWMT測定結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果未顯示。鞘內(nèi)注射LV/hIL-10后4d(CCI術(shù)后7d)開始有鎮(zhèn)痛作用，術(shù)后14d最為顯著，術(shù)后28d時(shí)鎮(zhèn)痛效應(yīng)仍然明顯。ABCDE圖4 鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對CCI大鼠痛閾的影響。A，B：手術(shù)同側(cè)CCI組的PWMT和PWTL的測定結(jié)果；C，D：手術(shù)同側(cè)S組PWMT和PWTL的測定結(jié)果；E：手術(shù)對側(cè)PWMT測定結(jié)果C0組與C1，C2，C3 組比較：BL值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）， 給藥后各時(shí)點(diǎn)C1組與其它各組比較（P<

22、0.001）。S1，S2，S3，S4 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果說明鞘內(nèi)注射LV/hIL-10有明顯的鎮(zhèn)痛作用，為了進(jìn)一步分析鞘內(nèi)注射LV/hIL-10后各組大鼠痛覺異常差異的發(fā)生機(jī)制，本研究對各組大鼠神經(jīng)組織進(jìn)行了晚期炎癥介質(zhì)HMGB1的表達(dá)分析。5. 鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對CCI大鼠腰段脊髓內(nèi)HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響RT-PCR及Western-blot檢測鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對CCI大鼠模型14d后腰段脊髓晚期炎癥介質(zhì)HMGB1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C0、C2、C3各組比較，C1組HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)抑制明顯（圖5-A、B）。BA

23、HMGB1GAPDHCtrl CCI NS Vect IL-10CCIHMGB1GAPDHCtrl CCI NS Vect IL-10CCI圖5 鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對CCI大鼠腰段脊髓內(nèi)HMGB1表達(dá)的影響.A, 鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對CCI大鼠模型14d后腰段脊髓HMGB1 mRNA表達(dá)的影響;B, 鞘內(nèi)注射LV/hIL-10對CCI大鼠模型14d后腰段脊髓HMGB1蛋白表達(dá)的影響.討 論基因治療是二十世紀(jì)八十年代以后發(fā)展起來的一種全新的疾病治療模式，其定義是將人的正常基因或有治療作用的外源基因通過一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用?；蛑委煹年P(guān)鍵是使目的基

24、因能夠在體內(nèi)特定組織內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定地表達(dá)。目前基因治療中目的基因的轉(zhuǎn)移工具多采用病毒載體，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體最為常用。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，容納外源基因的DNA片段長度不超過8kb；腺病毒載體感染細(xì)胞時(shí)，病毒DNA游離在細(xì)胞核內(nèi)，并不整合到染色體上，在體內(nèi)不能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的長期表達(dá)且反復(fù)應(yīng)用容易引起免疫反應(yīng)，而以人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)來源的慢病毒載體由于可以感染非分裂期細(xì)胞，容納外源性目的基因片段大，免疫反應(yīng)小等特點(diǎn)越來越受到人們的重視8-9。第二代慢病毒載體系統(tǒng)以自身失活的慢病毒為代表，使該載體系統(tǒng)更加安全。本實(shí)驗(yàn)通過運(yùn)用克隆重組、三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)包括包裝質(zhì)

25、粒、包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞包裝出高滴度的LV/hIL-10，超速離心后病毒滴度可達(dá)2×1010U/l。CCI大鼠鞘內(nèi)注射LV/hIL10后脊髓神經(jīng)組織中IL-10的表達(dá)明顯上調(diào)，鎮(zhèn)痛效應(yīng)顯著。說明通過鞘內(nèi)注射LV/hIL10治療神經(jīng)病理性疼痛的基因治療方法是有效的。CCI是學(xué)者Bennett和Xie于1988年建立的，它是以成年大鼠的坐骨神經(jīng)主干四道輕度結(jié)扎來模擬臨床中的神經(jīng)病理性異常疼痛。目前是最常用的經(jīng)典的慢性神經(jīng)痛的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)參考Bennett等方法制作CCI疼痛模型，大鼠術(shù)后第3天開始出現(xiàn)痛覺異?，F(xiàn)象，一周左右最明顯，術(shù)后第7d C0組大鼠的對側(cè)也可見明

26、顯的觸痛異常（鏡像痛）。本實(shí)驗(yàn)觀察到28d時(shí)術(shù)側(cè)痛覺過敏仍然明顯。目前研究發(fā)現(xiàn)慢性神經(jīng)痛的發(fā)生與早期炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)，但是慢性神經(jīng)痛的癥狀維持時(shí)間長久，單用早期炎癥介質(zhì)的釋放很難說明問題。HMGB1由Johns在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)，其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有很高的遷移率而得名，巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、垂體細(xì)胞等受內(nèi)毒素、IL-1、TNF刺激后均能釋放HMGB1，反過來HMGB1也可刺激TNF-、IL-1的釋放10-11。HMGB1與炎癥反應(yīng)的關(guān)系日益引起人們的重視，越來越多的證據(jù)表明HMGB1是膿毒癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷等引起的致死性全身炎癥反應(yīng)的晚期介導(dǎo)因子。有研究發(fā)現(xiàn)提示HMGB1可能參與了類風(fēng)濕性

27、關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程12。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCI大鼠模型伴有HMGB1的表達(dá)增高，提示HMGB1可能參與慢性神經(jīng)痛的發(fā)生及維持。IL-10是一種抗炎介質(zhì)，研究13-14發(fā)現(xiàn)IL-10對慢性神經(jīng)病理性疼痛有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其鎮(zhèn)痛機(jī)制與抑制早期炎癥介質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射LV/hIL10后，產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)的同時(shí)，也可抑制晚期炎癥介質(zhì)HMGB1的表達(dá)，提示HMGB1的表達(dá)下調(diào)可能參與了IL-10的鎮(zhèn)痛機(jī)制。進(jìn)一步證實(shí)HMGB1是否參與了慢性神經(jīng)痛的維持及其致痛機(jī)制還有待深入研究，比如在已恢復(fù)痛覺異常的CCI大鼠鞘內(nèi)再注射HMGB1拮抗劑是否能再次產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)，HMGB1除了導(dǎo)致促炎癥因子的釋

28、放外，是否還直接或間接通過其它致痛因子而發(fā)揮作用，這些都是下一步繼續(xù)研究的方向。成功治療慢性病理性疼痛可能寄希望于針對那些已知的晚期、下游炎癥介質(zhì)進(jìn)行防治,由于HMGB1 出現(xiàn)較晚且持續(xù)時(shí)間長,我們推測它可能成為反映慢性病理性疼痛病理過程更為方便、實(shí)用的監(jiān)測指標(biāo), 為慢性病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制研究和治療奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，HMGB1可能會成為慢性疼痛治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。參考文獻(xiàn)1 Minjj,Gambhirss. Gene therpy progress and prospects.Gene Ther,2004,11:115 -1252 Trono,D Lentiviralvectors:tur

29、ning a deadly foe into a thyapeutioc agent.Gene Ther,2000,7:20 -233 DeLeo JA, Tanga FY, Tawfik V. Neuroimmune activation and neuroinflammation in chronic pain and opioid tolerance hyperalgesia. The Neuroscientist 2004, 10: 40-52.4 Wang H, Bloom O, ZhangM, et al. HMGB1 as a late mediator of endotoxin

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35、okine, interleukin-10. Mol Pain. 2005 Feb 25;1(1):9. The effect of intrathecal administration LV/hIL-10 on pain threshold and the expression of HMGB1 in CCI rat modelHezhenghua Guoqulian Xiaomuzhang Jiangbimei Yanlulu YupengXiangya Hospital of Central South UniversityAbstract:objective: construct Le

36、ntivector that contains gene of hIL-10,to observe the effect of intrathecal administration LV/hIL-10 on controlling neuropathic pain and the expression of HMGB1 of sciatic nerve ligation rat model （CCI rat model）.To investigate probable analgetic mechanism of IL-10 for CCI rat model ,to provide orig

37、inal theoretical therapic project for neuropathic pain.Method: 135 sheer breed pathogen-free adult male Sprague-Dawley rats, divided into 9 arrays at random: CCI models 4 arrays (C0、C1、C2、C3), sham operatived rats 4 arrays (S0、S1、S2、S3) and a normal contrast array (N), each respectively intrathecal

38、injection LV/hIL-10 (C1、S1)、LV-GFP (C2、 S2)、isotonic Nachloride (C3、S3) and control (no implanted catheters and no administration, C0、S0), to observe each arrays alteration of algesic ethology and pain threshold on day 3、7、14、21、28 after CCI and sham surgery,and the expression of mRNA and protein of

39、 IL-10、HMGB1 in their spinal cord、pallium、seahorse on day 3、7、14 after surgery or administration. Construct LV/hIL-10 and intrathecal injection LV/hIL-10 to rats, to observe the expression of mRNA and protein of IL-10、HMGB1 in their spinal cord、pallium、seahorse.Result: CCI rats show pain facilitatio

40、n on 7d with significant expression of HMGB1 ,maintain in a fairly high level at 14d.After intrathecal injection LV/hIL-10,the expression of IL-10 in their spinal cord、pallium、seahorse show significant, the expression of HMGB1 in the spinal cord down-regulate notably, intrathecal injection LV/hIL-10

41、 will manifest relieve mechanical allodynia and thermal hyperalgesia in the CCI rats on 3d.Conclusion: The expression of HMGB1 in the spinal cord up-regulate notably in the CCI, the secretion of HMGB1 appear later and maintain longer in the rats spinal cord；intrathecal injection LV-h-IL10 can effici

42、ently reverse hyperalgesia of CCI rats,and can make a notable depressant effect on the expression of HMGB1 in the rats spinal cord, demonstrate that HMGB1 may be contribute to the development and maintenance of chronic neuropathic pain,propably HMGB1 will be a new target of treatment of chronic pain

43、.key words: sciatic nerve ligation rat model, HMGB1, neuropathic pain, LV/hIL-10, gene therapy.IntroductionNeuropathic pain is a refractory chronic pain syndrome with complicated mechanism,and effective therapies remain elusive. Algesic transgene therapy is a kind of original therapeutic measure,whi

44、ch is possible to lead to satisfactory therapeutic efficacy1 .The bionomics of viral vector reveal its prospect in clinical application，compared to the other viral vectors ,lentivirus vector has the ability to infect the cells no matter in dividing phase or non-dividing phase,moreover,with light ant

45、igenicity and toxicity,it is very safe;it can not only be inserted in fairly large exogenous gene fragment but also is able to express in vivo in a long-term,therefore, its effect on the gene therapy of nervous system disease is very notable.It is still not very clear about the mechanism of neuropat

46、hic pain,some of the latest research consider that there is a intimate relation between neuropathic pain and the high expression of earlier period inflammation mediators in the spinal cord such as TNF-、IL-1 and IL-6. HMGB1 is a kind of advanced stage mediators of inflammation discovered recently4 ,

47、however,it is still not clear that whether HMGB1 does participate in the occurrence and maintenance of neuropathic pain.IL-10 is a very important anti-inflammatory cytokine,some research 5prove that IL-10 has a notable therapeutical effect on the neuropathic pain of rat induced by spinal cord injury

48、、chronic sciatic nerve constriction injury、intrathecal administration gp120(envelope protein of HIV1)and so on,moreover, it is found that the analgesia mechanism of IL-10 is relevant to the expression and release of earlier period mediators of inflammation such as TNF-、IL-1 and IL-6,our apartment ad

49、vance approach if HMGB1 is involved in the analgesia mechanism of IL-10?Materials and methodsMain equipment and reagent: 2390 haptics dolorimeter（AmericanIITC company）; 7370 thermalgia equipment，AMV retroviridase（Takara company）；Taq enzyme（Promegacompany）；rabbit HMGB1 monoclonal antibody（Stressgen c

50、ompany）；Trizol reagent（Gibcocompany）；IL-10 ELISA kit（lixing company）；DH5 Bacillus coli strain（Promega company）; human embryo kidney Tcell(293T) cell line buy from Xiangya cell center, human neuroblast neoplastic cell line (SH-SY5Y) buy from ATCC.Construction of lentivirus vector pCYIL-10 plasmid con

51、tains IL-10 CDS sequence was given as a present from Dr.Xianmin Meng(Thomas Jefferson University，Philadelphia，PA); Lentivector：pWPXL-GFP，Packaging plasmid ：psPAX2，Envelope plasmid：pMD2.G，was given as a present from Switzerland Prof.Didier Trono. synthetic primer,make pCYIL-10 plasmid as the template

52、, amplified hIL-10 gene by PCR,then recombinate to plasmid pWPXL-GFP，evaluate its exactitude through cutting DNA at defined postion by restriction enzymes、packaging plasmid psPAX2 to 293T cell, to pack out lentivirus particle with replication defective,to determine virus titer, result showed in figu

53、re 1.Animal selection and divide into groups sheer breed pathogen-free adult male Sprague-Dawley rats,（220260g）, provided by experimental zoology apartment of Central Southern University.Divided into 9 arrays at random: ：CCI+LV/hIL10（C1）， CCI+ no-load vector（C2）， CCI+ isotonic Nachloride（C3）， CCI（no

54、 implanted catheters and no administration）（C0），sham+ LV/hIL10（S1）， sham+ no-load vector（S2）， sham+isotonic Nachloride（S3）， sham surgery （S0），control array（no implanted catheters and no administration）（N），15 per array.observing CCI arrays and sham arrays alteration of algesic ethology on day 3 after

55、 CCI and sham surgery,then cavitas subarachnoidealis inject 10uL LV/hIL-10、no-load vector、isotonic Nachloride in treat array respectively,then flush test tubes with 10l isotonic Nachloride respectively, total capacity is 20Ul.Observe each arrays alteration of algesic ethology on day 3、7、14、21、28 aft

56、er CCI and sham surgery,and the expression of mRNA and protein of IL-10、HMGB1 in their spinal cord、pallium、seahorse on day 3、7、14 after surgery or administration. Observe C0、N and S0 array at the same time point.Keep the room temperature at 22-25, maintain the rats Normal circadian rhythm,protect th

57、em from stimulation of highlight and noise,ensure them take food and water freely, feed them separately after surgery.Chronic intrathecal catheters Lumbosacral intrathecal catheters were constructed and implanted by lumbar approach under anesthesia according advanced method of Yaksh6. The indwelling catheters were used to microinject LV/hIL-10、NS or vehicle into the CSF space surrounding the lumbosacral spinal cord. All intrathecal microinjections were performed using 10uL volume to ensure complete drug deli