版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、1章(節(jié)、目)授課計(jì)劃授課章節(jié)名稱第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法授課 時(shí)數(shù)2 2教學(xué)目 的1 1、 使學(xué)生掌握細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法,了解主要工具,側(cè)重掌握基本原理和基本應(yīng)用2 2、了解細(xì)胞組分的分析方法及細(xì)胞培養(yǎng)3 3、了解細(xì)胞工程技術(shù)教學(xué)要 求1 1、掌握細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法,掌握光學(xué)顯微鏡技術(shù)2 2、了解細(xì)胞組分的分析方法及細(xì)胞培養(yǎng)3 3、了解細(xì)胞工程技術(shù)教學(xué)重占八、1 1、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法2 2、細(xì)胞組分的分析方法及細(xì)胞培養(yǎng)。教學(xué)難占八、1 1、觀察細(xì)胞形態(tài)的主要方法及工具的介紹。2 2、細(xì)胞組分的分析方法教學(xué) 方法與手段講授法、互動(dòng)討論法作業(yè)與 思考題部分課后作業(yè)閱讀 書目或4 -
2、IV.參考 資料1 1、細(xì)胞生物學(xué)(第 3 3 版)濯中和等)()(高等教育出版社)(20092009)2 2、細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)展(鄭國錩等)(高等教育出版社)(19941994)3 3、 分子細(xì)胞生物學(xué)(韓貽仁)(高等教育出版社)(20072007)教學(xué)后 記2教學(xué)內(nèi)容小結(jié)第頁、課時(shí)教學(xué)內(nèi)容3技術(shù)的進(jìn)步在一門學(xué)科的建立與發(fā)展過程中起著巨大的作用。沒有顯微鏡的發(fā)明就沒有細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),更不會(huì)有細(xì)胞學(xué)說的建立,沒有電子顯微技 術(shù)及其分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合,就不會(huì)有細(xì)胞生物學(xué)今天的發(fā)展。細(xì)胞生物學(xué)研究方法:一般來說,凡是用來解決細(xì)胞生物學(xué)問題所采用的方法,都屬于細(xì)胞生物學(xué)研究方法。當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)研究中常用到
3、的方法有:核酸和蛋白質(zhì)成分的分析和序列測定、研究特異DNADNA RNARNA 常用的 southernsouthern 雜交、NorthwreNorthwre 雜交及蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)、基因打靶技術(shù)等等。第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、有關(guān)顯微鏡的一些概念(1 1 分辨率(resolution)resolution):指分辨物體最小間隔的能力。光學(xué)顯微鏡的分辨率 R=0.61R=0.61XN N . sinsin (2 2 ).其中入為入射光線波長;N N = =介質(zhì)折射率;空氣中 N N =1=1a=物鏡鏡口角(樣品對物鏡鏡口的張角)。(2) 放大倍數(shù)(magnificationmagni
4、fication):是指眼睛看到像的大小與對應(yīng)標(biāo)本大小的比值。它指的是長度的比值而不是面積的比值。例:放大倍數(shù)為 100100 x,指的是長度是 1 1m的標(biāo)本,放大后像的長度是100100 mm,要是以面積計(jì)算,則放大了 10,00010,000 倍。顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。(3) 有效放大倍數(shù)(effectiveeffective magnificationmagnification :物鏡的數(shù)值孔徑(NANA )決定了顯4微鏡有效放大倍數(shù)。有效放大倍數(shù),就是人眼能夠分辨的d d 與物鏡的 d d 間的5比值,即不使人眼看到假像的最小放大倍數(shù):M=dM=d /d/d
5、二、顯微鏡的分類現(xiàn)代顯微鏡可以分為兩大類:一類是光學(xué)顯微鏡,另一類是非光學(xué)6教學(xué)內(nèi)容小結(jié)7顯微鏡。這兩類顯微鏡又可根據(jù)不同的情況分成若干類型。明視野顯微鏡按照明技術(shù)暗視野顯鍛頤_熒光顯微領(lǐng)相差顯微鏡可見光顯微鏡按像的老成分干涉相差顯微績扁光顯鍛鏡 倒置顯微鏡按鏡體結(jié)構(gòu)分-實(shí)體顯微鏡比較顯微競紫外光顯鍛鏡 不可見光顯微瞬紅外光顯戲窺廁線顯微鏡超聲波顯微鏡三、光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù)至今仍是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要手段。(一)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)1.1.構(gòu)成:1照明系統(tǒng):光源、折光鏡、聚光鏡2光學(xué)放大系統(tǒng):為兩組玻璃透鏡,目鏡與物鏡3機(jī)械裝置和支架系統(tǒng),由 鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、推動(dòng)器
6、、粗動(dòng)螺旋和微動(dòng)螺旋等部件組成,保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配置和靈活調(diào)控。光學(xué)顯微鏡顯微鏡電子顯微鏡透射電子顯微鏡 掃描電子顯微彊82.2.原理:經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像,經(jīng)目鏡放大成虛像。教學(xué)內(nèi)容E E 11112 2 亠讀筒r r 粗調(diào)螺施 細(xì)調(diào)螺施6-6-標(biāo)本移動(dòng)螺旋滬底座 8 8-接物鏡及轉(zhuǎn)換盤 9 9-物鏡10-10-載物臺(tái) 1 1聚光器 1212-光源(二)相差和微分干涉顯微鏡技術(shù)光線在通過密度不同的介質(zhì)時(shí),其滯留程度不同,即產(chǎn)生了光程差和相位差相差顯微鏡的基本原理把光程差變成振幅差(即明暗)。從而提高樣品反差,提 高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度,明暗差別通過密度差形成 使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。用途:觀
7、察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本,樣品不需染色, 適合觀察活細(xì)胞。甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)。小結(jié)9在構(gòu)造上,相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。1.1. 環(huán)形光闌(annularannular diaphragrhdiaphragrh:位于光源與聚光器之間。2.2. 相位板(annularannular phaseplatephaseplate:物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直 射光或衍射光的相位推遲 1/41/4 入。微分干涉顯微鏡用的是偏振光,增加了樣品反差,并具有立體感,可作于 研究活體細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)10(三)熒光顯微鏡技術(shù)特點(diǎn):光源為短波光;有兩個(gè)特殊的
8、濾光片(激發(fā)光濾片,阻斷濾片)照明方式通常為落射式(這種照明的光束來自物體的上方通過物鏡后射到 被檢物體上,這樣物鏡又起著聚光鏡的作用。這種照明法是適用于非透明物體, 檢出能力高;對細(xì)胞的刺激??;能進(jìn)行多重染色)。原理:細(xì)胞中有些物質(zhì),如葉綠素等,受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一 些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光,但如果用熒光染料或熒光抗體染色后,經(jīng)紫外線照 射亦可發(fā)熒光,熒光顯微鏡可對這類物質(zhì)進(jìn)仃疋性和疋里研究。光源為糸外光,波長較短,分辨力高于普通顯微鏡。是目前在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物 大分子的定性定位最有力的工具應(yīng)用:直接熒光標(biāo)記技術(shù)間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)(四)激光共聚焦顯微技術(shù)11原理和應(yīng)用:
9、激光共聚焦掃描顯微鏡(laserlaser confocalconfocal scanningscanningmicroscopemicroscope )用激光作掃描光源,逐點(diǎn)、逐仃、逐面快速掃描成像,掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡,物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)(所謂共焦,是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦在同一點(diǎn)上),也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長較短,光束很細(xì),所以共焦激光掃描顯微鏡有較咼的分辨力,大約是普通光學(xué)顯微鏡的 3 3 倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦,掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi),調(diào)焦深度不一樣時(shí),就可以獲得樣品不同深度層次的圖像,這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi),通過計(jì)算機(jī)重新組合,就能顯示細(xì)胞樣品
10、的立體結(jié)構(gòu),給出細(xì)胞內(nèi)各部分之間的定量關(guān)系及各種結(jié)構(gòu)線度。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài),也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的定量。用途類似熒光顯微鏡,但能掃描不同層次,形成立體圖像。優(yōu)點(diǎn)是排除焦平面以外光的干擾,增強(qiáng)圖像反差和提咼分辨率(1.41.41.71.7),可重構(gòu)樣品的二維結(jié)構(gòu)。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)(五)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRETFRET 技術(shù)是檢測活體中生物大分了納米距離和納米距離變化的有力工具,可用于檢測某一細(xì)胞中兩個(gè)蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。FRETFRET 現(xiàn)象:當(dāng)供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團(tuán)分子的吸收光譜重疊,并且兩個(gè)探針的距離在 10nm
11、10nm 以內(nèi)時(shí),就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移,稱FRETFRET 現(xiàn)象。米用融合表達(dá)方式,可將兩個(gè)蛋白的距離拉近于 5 510nm10nmFRETFRET 效率反映了被檢的兩種蛋白是否直接作用及作用的強(qiáng)弱。12(六)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)又稱光脫色恢復(fù)技術(shù),可用于檢測活體細(xì)胞表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn) 動(dòng)以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動(dòng)態(tài)變化率的大小。原理:利用高能量激光束的照射使特定的區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬 滅,光漂白區(qū)熒光的恢復(fù)可通過非漂白區(qū)的熒光標(biāo)記分子在膜上或胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng) 至光漂白區(qū)來完成。用于檢測活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動(dòng)態(tài) 變化率的大小四、電子顯微鏡技術(shù)用于研究細(xì)胞內(nèi)部
12、的精細(xì)結(jié)構(gòu)。(一)、電子顯微鏡的基本知識(shí)1 1、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMEMEM200200nmnm100100 nmnm0.10.1 nmnm可見光(400-700400-700)紫外光(約 200200nmnm)電子束(0.01-0.90.01-0.9 )玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空利用樣品對光的 吸收形成明暗反 差和顏色變化利用樣品對電子 的散射和透射形 成明暗反差不要求真空要求真空51.33x101.33x10-1.33x101.33x10-PaPa教學(xué)內(nèi)容2 2、電子顯微鏡的特征以電子束作光源,電磁場作透鏡。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡
13、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等4 4 部分構(gòu)成;小結(jié)13分辨力 0.2nm0.2nm,放大倍數(shù)可達(dá) 106106;用于觀察超微結(jié)構(gòu)(小于 0.20.2 卩)。(二)主要電鏡制備技術(shù)1 1、超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品,以環(huán)氧樹脂包埋, 以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片,切片厚度20-50nm=20-50nm=由于電子束的穿透能力有限,為獲得高分辨率的圖像,切片厚度一般僅為40-50nm,40-50nm,即一個(gè)直徑為 20um20um 的細(xì)胞可以切成幾百片,故稱超薄切片。這需要 樣品具備一定的剛性和韌性,而生物樣品不具備這些特性,因此需要包埋于特 殊的介質(zhì)中
14、,包埋時(shí)會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu),因此在包埋前必須先將樣品固定。(1 1) 固定:保持樣品的真實(shí)性,細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和成分保持在原來位置上通常以鋨酸和戊二醛固定樣品,低溫,防止酶的自溶而破壞樣品結(jié)構(gòu)。(2 2) 包埋:各種細(xì)微結(jié)構(gòu)在切片過程中獲得均勻良好的支撐,使獲得的超薄切 片連續(xù)完整并有足夠的強(qiáng)度,且能耐受觀察時(shí)的電子轟擊、高溫和真空揮發(fā)。 常用的包埋劑為環(huán)氧樹脂。注意:生物樣品固定后仍含有大量水分,而包埋劑是與誰不相溶的,因此在包埋前通常需要一系列的脫水處理。(3 3) 切片:通過樣品桿的金屬熱膨脹或機(jī)械伸縮控制切片厚度。切片刀:玻璃或磚石。切片需撈在覆有支撐膜的載網(wǎng)上才能在電鏡下觀察。(4 4)
15、染色:用重金屬鹽染色以形成明暗反差,只能觀察到黑白圖像不同的成分對不同的燃料有不同的親和性:鋨酸 一脂質(zhì);鉛鹽一蛋白質(zhì);醋酸 鈾一核酸。2 2、負(fù)染技術(shù)14用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色;吸去染料干燥后,樣品凹陷處鋪了一層重金 屬鹽,而凸的出地方?jīng)]有染料沉積,從而出現(xiàn)負(fù)染效果,襯托出樣品的精細(xì)結(jié) 構(gòu),分辨力可達(dá) 1.51.5 nmnm 左右。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)153 3、冰凍蝕刻 freeze-etchingfreeze-etching亦稱冰凍斷裂蝕刻復(fù)型。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。 然后斷開,升溫后, 冰升華,暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉,把鉑 和碳的膜剝下來,此膜即為復(fù)膜(
16、replicareplica )。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài),在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞 斷裂面處的結(jié)構(gòu)。用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜面結(jié)構(gòu),立體感,不需要包埋、固定深度蝕刻主要用來觀察胞質(zhì)中細(xì)胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。4 4、電鏡二維重構(gòu)技術(shù)將電子顯微鏡、電子衍射、計(jì)算機(jī)圖像處理相結(jié)合的技術(shù)。用于分析難形 成晶體的膜蛋白、病毒和蛋白質(zhì)- -核酸復(fù)合物的二維結(jié)構(gòu)。生物樣品的二維晶體在不同傾角下進(jìn)行拍照,得到一系列電鏡圖片,傅里 葉變換處理,得到三維結(jié)構(gòu)電子密度圖展示生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu),具有咼分辨率5 5、掃描電鏡技術(shù)(SEMSEM掃描電子顯微鏡于 2020 世
17、紀(jì) 6060 年代問世,用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。工作 原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品,在樣品表面激發(fā)出次級電子,次級電子 的多少與電子束入射角有關(guān),也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān),次級電子由探16測體收集,并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào),再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度,顯示出與電子束同步的掃扌田圖像。圖像為立體形象,反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子,標(biāo)本在固定、脫水后,要噴涂上一層重金屬微粒,重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號(hào)。COCO 2 2 臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。五、掃描隧道顯微鏡(STMSTM它于 19811981
18、年由格爾德賓寧(GerdGerd K.BinnigK.Binnig)及亨利希羅勒(HeinrichHeinrichRohrerRohrer)在 IBMIBM 位于瑞士蘇黎世的蘇黎世實(shí)驗(yàn)室發(fā)明掃描隧道顯微鏡,只一種在納米水平上探測微觀世界物質(zhì)表面形貌的一儀器。原理:掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí), 即產(chǎn)生彼此間相互作用力,如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)(隧道電流)、原子間作用力、磁力、摩擦力等,并在教學(xué)內(nèi)容小結(jié)計(jì)算機(jī)顯示出來,從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。主要裝置.? ? XYZXYZ 方向掃描的壓電陶瓷、? ?逼近裝置、? ?電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)、? ?數(shù)據(jù)采集、處理和顯示系統(tǒng)主要特
19、點(diǎn):? ?具有原子尺度的高分辨本領(lǐng):側(cè)分辨率0.1-0.20.1-0.2nmnm,縱分辯率 0.0010.001 nmnm? ?真空、大氣、液體條件下工作? ?非破壞性測量17局限性:? ?掃描隧道顯微鏡(STM)(STM)所觀察的樣品必須具有一定程度的 導(dǎo)電性,對于半導(dǎo)體,觀測的效果就差于導(dǎo)體;對于絕緣體則根本無法直接觀察。? ?在掃描隧道顯微鏡(STM(STM) )的恒電流工作模式下,有時(shí)它對樣品表面微粒之間的某些溝槽不能夠準(zhǔn)確探測,與此相關(guān)的分辨率較差。第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞成分的分析相結(jié)合是當(dāng)代細(xì)胞生物學(xué)研究中長采用的試驗(yàn)方法。一、細(xì)胞組分分離技術(shù)? ?是分離細(xì)胞器及
20、各種大分子基本手段。? ?轉(zhuǎn)速 1025kr/min1025kr/min 的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。? ?轉(zhuǎn)速25kr/min25kr/min,離心力89Kg89Kg 者稱為超速離心機(jī)。超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá) 100000r/min100000r/min,離心力超過 500kg500kg。(一)差速離心 DifferentialDifferential centrifugationcentrifugation? ?特點(diǎn):介質(zhì)密度均一;速度由低向高,逐級離心。? ?用途:分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)? ?沉降順序:核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與咼基18體核蛋白體。? ?可將
21、細(xì)胞器初步分離,常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。(二)密度梯度離心? ?用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細(xì)胞混懸液或勻 漿置于介質(zhì)的頂部,通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離? ?類型:速度沉降、等密度沉降。? ?常用介質(zhì):氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。? ?分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求:1 1)能產(chǎn)生密度梯度,且密度高時(shí),粘度不高;2 2)PHPH 中性或易調(diào)為中性;3 3)濃度大時(shí)滲透壓不大;4 4)對細(xì)胞無毒。1.1. 速度沉降 velocityvelocity sedimentationsedimentation? ?用途:分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。? ?特
22、點(diǎn):介質(zhì)密度較低,介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密 度。? ?原理:介質(zhì)密度梯度平緩,分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降 而達(dá)到分離。2.2. 等密度沉降 isopycnicisopycnic sedimentationsedimentation? ?用途:分離密度不等的顆粒。? ?特點(diǎn):介質(zhì)密度高,陡度大,介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。19力場比速率沉降法大 1010010100 倍,需要咼速或超速離心。? ?原理:樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處,并停留在那里達(dá)到平衡,從而將不同密度的成分分離。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)一、細(xì)胞內(nèi)生物大分
23、子的顯示方法:原理:利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征,通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。DNADNA 福爾根(FeulgenFeulgen)反應(yīng)- 紫紅色多糖類:PASPAS 反應(yīng)黃色脂肪:蘇丹 IIIIII 紅色蛋白質(zhì):米倫(MillonMillon )紅色1 1、金屬沉淀法:如磷酸酶分解磷酸酯底物后,反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoSCoS 或 PbSPbS有色沉淀,而顯示出酶活性。2 2、FeulgenFeulgen 反應(yīng):醛基可使 SchiffSchiff 試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸3 3、四氧化鋨:與不飽和脂肪
24、酸反應(yīng)成黑色,脂肪滴4 4、MillonMillon (米倫)反應(yīng):氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的絡(luò)氨酸殘基反應(yīng),形成紅色沉淀,(有色復(fù)合物)蛋白質(zhì)205 5、聯(lián)苯胺反應(yīng):過氧化酶分解 H202H202 產(chǎn)生新生氧,后者再將無色聯(lián)苯胺氧化21成聯(lián)苯胺藍(lán),進(jìn)而變成棕色化合物。6 6、脂溶染色法:借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。7 7、茚二酮反應(yīng):顯示蛋白質(zhì)三、特異蛋白抗原的定位與定性細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)疋位法:免疫熒光技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)蛋白質(zhì)體外定性法:免疫印跡、放射免疫沉淀、蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜分析(一)免疫熒光技術(shù)根據(jù)免疫學(xué)原理,利用抗體同特定抗原專一結(jié)合,并標(biāo)上標(biāo)記熒光素,對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。
25、快速、靈敏、有特異性,但其分辨率有限。(二)免疫電鏡技術(shù)能有效提高樣品的分辨率,在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位。免疫鐵蛋白技術(shù)教學(xué)內(nèi)容小結(jié)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用:通過對分泌蛋白的定位,可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài);胞內(nèi)酶的研究;膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸丿予列的定位和定性分子雜交技術(shù):具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段,在適當(dāng)條件下,通過氫鍵結(jié)合,形成 DNA-DNADNA-DNA DNA-RNADNA-RNA 或 RNA-RNRNA-RN 雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。22? ?原位雜交(inin situ
26、situhybridizationhybridization)用于檢測染色體上的特殊 DNADNA 序列。最初是使用放射性 DNADNA 探針,后來又發(fā)明了免疫探針法。五、應(yīng)用放射自顯影技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài)? ?用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。? ?原理:將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi),經(jīng)過一段時(shí)間后,制取切片,涂上鹵化銀乳膠,經(jīng)放射性曝光,使乳膠感光,對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位和半定量研究的一種細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。143? ? 一般用 C C 和 H H 標(biāo)記。常用 3H-TDR3H-TDR 來顯示 DN
27、ADNA 用 3H-UDR3H-UDR 顯示 RNARNA 用3H3H 氨基酸研究蛋白質(zhì),用 3H3H 甘露糖、3H3H 巖藻糖研究多糖。14C C 半衰期為 57305730 年,3H H 為 12.512.5 年。六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)1 1、流式細(xì)胞儀? ?用途:對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。? ?可定量地測定某一細(xì)胞中的 DNADNA RNARNA 或某一特異蛋白的含量,以及細(xì)胞群體中上述成分含量不同的細(xì)胞的數(shù)量。特別是它還可將某一特異染色的細(xì)胞從數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞群體中分離出來,以及將DNADNA 含量不同的中期染色體,甚至 X X 或丫染色體的精子分離出來。? ?原理:
28、包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴,形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴,在激光束的照射下,這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光,經(jīng)探測器檢教學(xué)內(nèi)容小結(jié)23測,轉(zhuǎn)換為電信號(hào),送入計(jì)算機(jī)處理,輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果,并可根據(jù)這些性質(zhì) 分選出高純度的細(xì)胞亞群, 分離純度可達(dá) 99%99%包被細(xì)胞的液流稱為鞘液,所用儀器稱為流式細(xì)胞儀 (flowflowcytometercytometer )。2 2、顯微分光光度測定技術(shù)? ?實(shí)質(zhì)上是顯微鏡技術(shù)和分光光度技術(shù)的結(jié)合。它以物質(zhì)分子的光吸收、熒光發(fā)射和光反射特性作為測量基礎(chǔ), 可以對細(xì)胞內(nèi)的某些重要的生物 分子 (如 DNADNA RNRNA A蛋白質(zhì)等)的含量進(jìn)行定量測試,是組織化
29、學(xué)和細(xì) 胞生物學(xué)中定量研究的必不可少的工具。? ?顯微吸收光度法時(shí)一種光度測量的化學(xué)方法,它基于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、多糖、核酸、脂類和酶染顆粒能在不同等電點(diǎn)下電離出不同側(cè)基,因而造成對染料親和力不同,應(yīng)用不同的化學(xué)試劑染色,可使不同的細(xì)胞組 分染上不同的顏色,在顯微鏡下成為可見的結(jié)構(gòu)。染料于組分的結(jié)合必 須是特異性的,即染料、細(xì)胞組分結(jié)合物的光吸收是遵循朗伯- -比爾定律, 而且染色深淺與被染細(xì)胞組分之間呈化學(xué)劑量學(xué)關(guān)系,符合這兩者關(guān)系 的樣本就可應(yīng)用吸收測量法,通過光檢測器(可使光能變成電能)測量 有色化合物吸收單色光的量。第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)就是將動(dòng)植物組
30、織或細(xì)胞從機(jī)體取出,分散成單個(gè)細(xì)胞或直接以 單細(xì)胞 生物,給予必要的生長條件,讓其在培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)基上繼續(xù)生長與增 殖。24(一)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)? ? 原代培養(yǎng)(primaryprimary cultureculture cellcell): :從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。?傳代培養(yǎng)(subculturesubculture cellcell): :適應(yīng)在培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。? ? 細(xì)胞系(cellcell lineline):通過純系化或選擇法從原代培養(yǎng)細(xì)胞中分離出來的細(xì)胞群體。? ?細(xì)胞株(cellcell strainstrain ):從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特疋性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)
31、胞群。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)細(xì)胞貼壁:分散的細(xì)胞懸液在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分鐘貨數(shù)小時(shí)內(nèi))就貼附于瓶壁上的現(xiàn)象。(二)、植物細(xì)胞培養(yǎng)1.1.原生質(zhì)體培養(yǎng):培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞,特點(diǎn):比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì),如 DNADNA便于進(jìn)行細(xì)胞融合,形成雜交細(xì)胞;適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁,經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。2.2.單倍體培養(yǎng):通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。(三)、非細(xì)胞體系來源于細(xì)胞,而不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),但包含了進(jìn)行正常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)(如供能系統(tǒng)和酶反應(yīng)體系等)組成的體系即為非細(xì)胞體系(cell-freecell-freesystemsystem)。用途:研究 DNADNA 復(fù)制、RNARNA 專
32、錄、蛋白質(zhì)合成、高爾基體的膜泡運(yùn)輸機(jī)制25以及細(xì)胞核裝配等。26二、細(xì)胞工程(一)細(xì)胞融合與細(xì)胞雜交技術(shù)通過培養(yǎng)和介導(dǎo),兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合(cellcell fusionfusion )或細(xì)胞雜交。? ?同核融合細(xì)胞:基因型相同的細(xì)胞融合形成的雜交細(xì)胞。? ?異核融合細(xì)胞:基因型不同的細(xì)胞融合形成的雜交細(xì)胞。? ?自發(fā)融合:同種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。? ?誘發(fā)融合:異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。在自然界中細(xì)胞自發(fā)融合發(fā)生的機(jī)率很小,一般需要誘發(fā)融合。誘發(fā)融合細(xì)胞的方法一般有以下幾種:誘發(fā)細(xì)胞融合的方法:1 1 生物法:病毒促進(jìn)細(xì)胞融合,其
33、中仙臺(tái)病毒(HVJHVJ)是最早用于動(dòng)物細(xì)胞融合的融合劑。原理:病毒被膜具有凝聚細(xì)胞的能力,它一邊黏連一個(gè)細(xì)胞的表面,另一邊黏連另一個(gè)細(xì)胞的表面,從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié),誘導(dǎo)細(xì)胞的融合。教學(xué)內(nèi)容小結(jié)2 2、化學(xué)法:主要包括鹽類融合劑、聚乙二醇 (PEGPEG)、二甲亞砜(DMSODMSO)、甘油- -醋酸酯、油酸鹽、脂質(zhì)、Ca2+Ca2+配合物等。其中聚乙二醇法是較常用的化學(xué)融合方法。其原理是 PEGPEG 分子具有輕微的負(fù)極性,與具有正極性基團(tuán)的物質(zhì)形成氫鍵,在原生質(zhì)體之間形成分子橋,使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合。3 3、物理法:電融合法。其 原理是改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電27荷和氧化還原電位發(fā)生改變,使異種原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂,進(jìn)而 質(zhì)膜開始連接,直到閉和成完整的膜形成融合體。細(xì)胞融合的步驟1 1、動(dòng)物細(xì)胞的融合(1)細(xì)胞準(zhǔn)備。分貼壁和懸浮細(xì)胞兩種。前者可直接將兩親本細(xì)胞混合
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2025年新能源汽車租賃與政府補(bǔ)貼申請服務(wù)合同3篇
- 2025年度房地產(chǎn)經(jīng)紀(jì)個(gè)人勞務(wù)用工合同范本2篇
- 2025年水電工程信息化建設(shè)與維護(hù)承包合同范本3篇
- 2025年度個(gè)人果園果樹修剪與病蟲害防治一體化服務(wù)合同4篇
- 工廠轉(zhuǎn)讓協(xié)議書(2篇)
- 二零二五版城市更新改造項(xiàng)目融資合同范本4篇
- 2025年度個(gè)人抵押貸款擔(dān)保合同4篇
- 二零二五年房產(chǎn)交易市場參展商合作保障協(xié)議3篇
- 《建設(shè)工程施工合同糾紛事實(shí)查明的思路與方法》理解與適用
- 2025年行政管理制度范本:教育機(jī)構(gòu)管理規(guī)范3篇
- 2024版塑料購銷合同范本買賣
- 【高一上】【期末話收獲 家校話未來】期末家長會(huì)
- JJF 2184-2025電子計(jì)價(jià)秤型式評價(jià)大綱(試行)
- GB/T 44890-2024行政許可工作規(guī)范
- 有毒有害氣體崗位操作規(guī)程(3篇)
- 兒童常見呼吸系統(tǒng)疾病免疫調(diào)節(jié)劑合理使用專家共識(shí)2024(全文)
- 2025屆山東省德州市物理高三第一學(xué)期期末調(diào)研模擬試題含解析
- 《華潤集團(tuán)全面預(yù)算管理案例研究》
- 2024-2025高考英語全國卷分類匯編之完型填空(含答案及解析)
- 二年級下冊加減混合豎式練習(xí)360題附答案
- 蘇教版五年級數(shù)學(xué)下冊解方程五種類型50題
評論
0/150
提交評論