淺論U0126對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦內(nèi)水通道蛋白4表達(dá)的影響

1、淺論U0126對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦內(nèi)水通道蛋白4表達(dá)的影響                作者：張樹恒 衣服新 倪偉民 孟飛 葉志軍【摘要】  目的 研究水通道蛋白4在出血性腦損傷大鼠腦內(nèi)的表達(dá),及絲裂原活化蛋白激酶 (MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻滯劑U0126對(duì)其表達(dá)的影響。方法 大鼠緩慢注射自體血出血模型,測(cè)定腦組織含水量及伊文斯藍(lán)含量,并采用免疫組織化學(xué)，Western blot檢測(cè)AQP4的表達(dá)。測(cè)定預(yù)先經(jīng)尾靜脈給予U0126后MAPKs信

2、號(hào)通路關(guān)鍵蛋白ERK1/2磷酸化水平,同時(shí)觀察U0126對(duì)腦水腫和AQP4表達(dá)的影響。結(jié)果 假手術(shù)組AQP4表達(dá)較低，在出血損傷后表達(dá)升高,腦組織含水量及伊文斯藍(lán)含量增加,給予U0126后AQP4的表達(dá)和腦組織含水量降低,同時(shí)ERK1 /2磷酸化水平降低。結(jié)論 出血性損傷后AQP4表達(dá)上升,腦水腫明顯,預(yù)先給予U0126可抑制AQP4的表達(dá),減輕腦水腫。 【關(guān)鍵詞】  腦出血 腦水腫 水孔蛋白類 丁二烯類 腈類對(duì)于腦水腫的形成,傳統(tǒng)觀念認(rèn)為是由于能量耗竭和鈣超載所致, 但最近研究發(fā)現(xiàn),AQP4（aquaporin-4,)起著重要作用1。水通道蛋白(AQP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類涉及特異性

3、細(xì)胞膜水分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是影響水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡調(diào)節(jié)的主要膜蛋白。AQP家族有十多種類型,其中AQP4主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),與腦脊液重吸收、滲透壓調(diào)節(jié)、腦水腫形成等生理和病理過程密切相關(guān)。我們于2007年9月至2008年7月通過給予MAPKs抑制劑U0126,研究其對(duì)實(shí)驗(yàn)性出血性腦損傷大鼠的腦水腫及AQP4表達(dá)的影響。   1  材料和方法   1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑  72 只健康雄性SD大鼠(200250 g)由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。P-ERK1/2抗體,購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，AQP4抗

4、體試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。   1.2  動(dòng)物分組和模型制備及藥物處理  用隨機(jī)排列表法分入4 組:假手術(shù)組，出血組，載體溶液對(duì)照組，載體溶液加U0126組,每組各18 只。   U0126用藥方法 稱重大鼠并以0.1 mg/kg體重計(jì)算U0126(1，4-二氨基-2，3-氰基-1，4-雙2-氨基苯基硫代丁二烯)用量，將U0126溶解于DMSO中并以0.1 mmol/L的PBS稀釋為總量 300 L。于造模前30 min自尾靜脈注入。相同DMSO含量的PBS溶液300 L尾靜脈注射作為載體溶液對(duì)照。假手術(shù)組和腦出血組在

5、造模前相同時(shí)間點(diǎn)自尾靜脈注入等容量量生理鹽水。   采用大鼠緩慢注射自體血出血模型，依照Gieorge Paxinos大鼠腦立體定位圖譜經(jīng)立體定位儀介導(dǎo)將取自股動(dòng)脈的自體75 L新鮮全血用微量注射針緩慢注入右側(cè)尾狀核。以動(dòng)物出現(xiàn)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪或向外側(cè)劃圈或向?qū)?cè)傾倒作為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組，按上述方法進(jìn)針，但不注血。各組均于造模后24 h斷頭取材。   1.3  腦組織含水量測(cè)定  各組取6只大鼠用于含水量的測(cè)定,采用干濕法,于出血側(cè)前緣取腦組織約100 mg,稱取濕重,于85 烘烤后稱取干重,計(jì)算含水量: 腦組織含水量

6、(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。   1.4  伊文斯藍(lán)含量的測(cè)定  各組另取6只大鼠以其右側(cè)半球病灶前半部分用于伊文斯藍(lán)含量的測(cè)定,采用甲酰胺浸泡法,于股靜脈注入2.5%伊文斯藍(lán)鹽水液0.2 mL/100 g體重,斷頭取腦后加入10%三氯醋酸沉淀蛋白,用無水乙醇勻漿,提取伊文斯藍(lán),取上清液在600 nm測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出伊文斯藍(lán)含量(g/g濕重)。   1.5  免疫組織化學(xué)  各組取6只大鼠,取出血灶周圍腦組織,冠切制作4 m石蠟切片,用兩步法進(jìn)行染色。   1.

7、6  Western blot 檢測(cè)  各組取6只大鼠以其剩余右側(cè)半球病灶后半部分用于蛋白印記檢測(cè)。出血灶周圍腦組織100 mg,提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳,半干法轉(zhuǎn)膜,AQP4一抗(1500)、P-ERK1/2一抗(11 000)4 孵育過夜;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(11 000) 37 孵育1 h。ECL光化學(xué)法顯色,用Gelwork 4.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定吸光度。   1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  所測(cè)數(shù)據(jù)以x±s表示，以SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析的LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 

8、60; 2  結(jié)   果   2.1  腦組織含水量和伊文斯藍(lán)含量  與假手術(shù)組相比,其余各組腦組織含水量及伊文斯藍(lán)含量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05)。出血組含水量載體溶液對(duì)照組高于U0126組，P 0.05。出血組伊文斯藍(lán)含量載體溶液對(duì)照組高于U0126組，P 0.05,而出血組和載體溶液對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05，見表1）。表1  腦組織含水量和伊文斯藍(lán)含量結(jié)果   2.2  免疫組織化學(xué)結(jié)果  AQP4陽性染色位于星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和血管間隙

9、,神經(jīng)元為陰性,海馬區(qū)表達(dá)強(qiáng)度高于皮質(zhì)。出血組和載體溶液對(duì)照組及U0126組表達(dá)強(qiáng)度明顯高于假手術(shù)組,而U0126組表達(dá)少于出血組和載體溶液對(duì)照組(圖14)。P-ERK1/2陽性染色位于胞核、胞質(zhì)和突起，以胞核為主。在出血周圍的皮質(zhì)、深部皮質(zhì)與腦白質(zhì)結(jié)合部，及海馬區(qū)染色較強(qiáng)，室管膜細(xì)胞和脈絡(luò)叢血管內(nèi)皮細(xì)胞也呈較強(qiáng)陽性染色。P-ERK1/2在假手術(shù)組染色較少,出血損傷后(出血組和載體溶液對(duì)照組以及U0126組)陽性著色增多，U0126組表達(dá)少于出血組和載體溶液對(duì)照組。   2.3  Western blot檢測(cè)結(jié)果  AQP4條帶(31KD)在假手術(shù)組較淡

10、(吸光度值為124.2 ±1.1)， 出血組和載體對(duì)照組以及U0126組條帶明顯增寬變深。出血組AQP4吸光度值(156.8 ±0.8)和載體溶液對(duì)照組吸光度值（157.2 ±0.9）高于U0126組(147.7 ±1.2, P0.01)。P-ERK1/2為兩條條帶(42 KD和44 KD)，假手術(shù)組條帶較淡,吸光度值(131.6 ±5.1)，且44 KD條帶不明顯,出血組和載體溶液對(duì)照組以及U0126組條帶明顯增深變寬,P-ERK1/2條帶吸光度值出血組（175.4 ±8.3 )和載體溶液對(duì)照組（174.5 ±6.7）低于

11、U0126組(142.1 ±2.9,P0.01)，出血組與載體對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。            3  討   論   腦出血后除血腫直接破壞腦組織和占位效應(yīng)引起神經(jīng)損傷外，腦水腫是造成繼發(fā)性神經(jīng)損傷、病情惡化的重要原因之一。因此,預(yù)防和消除腦水腫是治療出血性卒中的關(guān)鍵。但是目前尚缺乏針對(duì)腦水腫形成機(jī)制的有效藥物。   水通道蛋白4的發(fā)現(xiàn)使人們?cè)谡J(rèn)識(shí)腦水腫形成的分子機(jī)制上跨出了歷史性的一

12、步。AQP家族有十多種類型,其主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)水。其中AQP4主要存在于腦,是膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液以及血管之間的水調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),在腦組織水平衡和腦水腫的形成中發(fā)揮著重要作用10-14。有研究顯示,敲除水通道蛋白4基因的小鼠腦損傷后腦水腫較對(duì)照組明顯減輕，且大鼠腦出血后AQP4mRNA和蛋白均增加,與腦水腫的形成成正相關(guān)?？梢酝茰y(cè)有效抑制AQP4的表達(dá),將會(huì)減輕腦水腫。   在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)檢測(cè),出血組大鼠腦組織含水量和伊文斯藍(lán)含量均高于假手術(shù)組,提示腦出血后形成了腦水腫。同時(shí),免疫組化和Western blot檢測(cè)均發(fā)現(xiàn),出血損傷后AQP4的表達(dá)增加,這可能是腦水腫形成的原

13、因之一。并且出血損傷后P-ERK1/2表達(dá)亦明顯升高，提示腦出血后MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活,在腦出血過程中該通路在傳遞損傷信號(hào),調(diào)控細(xì)胞對(duì)出血性損傷刺激的生物反應(yīng)方面可能發(fā)揮著重要作用。   絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號(hào)通路,可將胞外刺激信號(hào)傳遞至胞核 。迄今為止，真核生物細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：ERK/p42 /p44、SAPK、p38和ERK34和BMK亞家族,每個(gè)亞家族又分若干亞型，分別在不同的器官發(fā)揮不同的

14、作用，其中, ERK/p42 /p44通路主要存在于肌肉和腦 ,包含2個(gè)亞型: ERKl和ERK2,相對(duì)分子質(zhì)量分別為42 KD和44 KD。損害性刺激信號(hào)作用于細(xì)胞表面的受體,激活 GTP 結(jié)合蛋白R(shí)AS， 繼而激活Raf-1,Raf-1可將MEK磷酸化激活, 活化的MEK (P-MEK)可使ERK1 /2被磷酸化形成P-ERK1 /2,并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,通過磷酸化下游的ELK，使其獲得調(diào)控轉(zhuǎn)錄的能力,調(diào)節(jié)與細(xì)胞損傷有關(guān)的即刻早反應(yīng)基因和晚反應(yīng)基因的表達(dá)。   我們的實(shí)驗(yàn)，通過提前注射U0126來阻斷腦出血損傷后MAPKs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。U0126是高選擇性和高效的MAPKs

15、阻滯劑,通過直接抑制MEK活性而阻滯其下游分子ERK1 /2的磷酸化10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注射U0126 后P-ERK1 /2明顯降低,提示在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)ERK/p42 /p44 通路被阻斷。與此同時(shí), 給藥組AQP4蛋白的表達(dá)也降低, 并且給藥組的腦水含量亦明顯降低，提示AQP4的表達(dá)受到ERK信號(hào)通路的調(diào)控,阻斷ERK/p42 /p44信號(hào)通路可抑制AQP4的表達(dá),從而減輕腦水腫。給藥組伊文斯藍(lán)含量也較出血組減少,這與AQP4 表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸的足突以及毛細(xì)血管內(nèi)皮上, 即分布于BBB 的兩側(cè), AQP4在介導(dǎo)水分子透過BBB 過程中扮演重要角色有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所采用高選擇

16、的MAPKs阻滯劑U0126可能為腦出血后腦水腫的治療帶來新的思路。應(yīng)該看到調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激和損傷的各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間存在廣泛的交聯(lián)即所謂cross talk現(xiàn)象，十分復(fù)雜，因此進(jìn)一步研究其它通路對(duì)AQP4表達(dá)的影響是十分必要的。（此文圖1-4見第96頁）【參考文獻(xiàn)】  1 Badaut J, Lasbenns F, Magistretti PJ, et al. Aquaporins in brain: distribution, physiology, and pathophysiology J. Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22: 367-378.Ar

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