反相色譜柱的清潔和再生

1、反相H PL C柱子得清潔與再生反相色譜就是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛得技術(shù)主要就是因?yàn)樗m用于分析極人 多數(shù)得非極性物質(zhì)與很多得可離子化得及離子化合物人多數(shù)用于反相色譜得固定相都就是天然 得疏水物質(zhì)，W此.分析物就是按照它們與固定和得疏水相互作用得人小來分離得，含有疏水得 機(jī)制也能以同樣得保留方式分離。硅膠農(nóng)面因?yàn)橛兄杷I介相而有些別得化學(xué)性質(zhì)。殘留得硅烷醇存在于所有得硅膠鍵 合填料中。圖1描述了不同種類得能出現(xiàn)得硅烷醇，這些硅烷醇具有弱酸性，W此能與某些待分 析物合基質(zhì)成分，特別就是堿性成分。因?yàn)楣柰榇嫉胮Ka值人約就是4、5,離子化能在中性pH 條件下發(fā)生W此與陽離了產(chǎn)生靜電相互作

2、用就有可能發(fā)生。較老得A型硅膠能容納高濃度金屬離 予（有時(shí)候lOOppm或更多），而這能使硅膠農(nóng)而得酸性更人甚至能發(fā)生金屬螫合現(xiàn)象或淸除些化合物殘留硅烷醇在非末端封閉得硅膠合短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。b使用者 必須清楚她們所用得固定相農(nóng)而特殊性質(zhì)與可能得分析物一固定相衣而得相互作用，這樣當(dāng)她們 使用反相方法時(shí)才能考慮到可能得基質(zhì)相互作用。例如，非常疏水得樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香 物質(zhì)，與蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填衣面并且改變她們得性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)得生物流體也能吸附在裝填衣而。盡管分析者想盡最大努力來保護(hù)HP L C柱&某些分析物基質(zhì)污染能使固定相受到有害得影響。b當(dāng)柱子被污染，它

3、得色譜行為與沒被 污染得柱了會(huì)有些不同。被污染得柱了能產(chǎn)生反壓問題-彼污染得反相柱子必須清洗與再生才 能恢復(fù)原來得操作條件這部分得''柱了觀察將討論可行得方法使柱了回復(fù)原來得或差不多原來 得狀態(tài).因?yàn)殒I合硅膠柱了就是最受歡迎得,我重點(diǎn)講述這種柱子。最后，我將討論別得反相柱了得 清潔步驟。i反相柱了污染原因:通常，樣品中含有一些對(duì)分析者來說不感興趣得東西鹽、脂質(zhì).含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸.疏水蛋 白質(zhì)與其它一些生物物質(zhì)就是一些可能在使用時(shí)與HP LC柱發(fā)生相互作用得物質(zhì)這些物質(zhì)有比分析者得目標(biāo)物或少或大得保留值。那些保留值較小得物質(zhì)如鹽類一般來說在空體積時(shí)就被沖 出色譜柱這些非目標(biāo)產(chǎn)物得

4、干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線上移或者就是 負(fù)峰。如果樣品成分在柱了中有很強(qiáng)得保留而且流動(dòng)相溶液成分不足以把這些物質(zhì)洗脫下來，多 次上樣后，這些吸附在柱了衣面得物質(zhì)通常就會(huì)積累在柱頭。這些行為通常只有通過平行實(shí)驗(yàn)才 能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值得樣品能彼緩慢洗出而且農(nóng)現(xiàn)為寬峰，基線擾動(dòng)，或者基線漂移。有時(shí)候這些彼吸附得樣品成分累積到一定程度足以使她們開始形成新得固定相。分析物能與這些 朵質(zhì)作用形成一定得分離機(jī)理。保留時(shí)間會(huì)波動(dòng)，拖尾會(huì)出現(xiàn)如果足夠得污染產(chǎn)生，柱了得反 壓能超過泵所能承受得最大壓力，使柱了無法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積加清洗硅膠鍵合柱子>再生被污染HPLC柱子得

5、關(guān)鍵就是知道污染物得性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)萌軇﹣砣コＨ?果污染就是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保留物質(zhì)得累積引起得利用簡單得步驟來除去這些污染物往往能 恢復(fù)其色譜行為有時(shí)候，經(jīng)過多次操作以后得色譜柱用90- 1 0 0 %得溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)得溶劑）沖洗2 0個(gè)體積可以清除污染物。（衣2列舉了不同規(guī)格得HPLC柱子得空體積.W此讀者能方便地確定和應(yīng)柱了沖洗得體積。例如，柱了中殘留得脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫咲喃如果您使用得就是緩沖液系統(tǒng)，不箜直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機(jī) 溶劑可能會(huì)使H P L C流動(dòng)體系中得緩沖液沉淀這樣會(huì)導(dǎo)致更人得問題如柱頭堵塞、管道堵塞.泵活塞損傷或進(jìn)樣

6、閥轉(zhuǎn)軸失靈應(yīng)該先用無緩沖流動(dòng)相（即把緩沖液換成水）。沖洗510個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒法把殘留在色譜柱上得污染物洗抻。那么更強(qiáng)得溶劑或者就是一系列 洛劑就有必要用來清洗柱了樂，如果污染物就是非生物物質(zhì)，使用者可以跳過個(gè)或多個(gè)另外得 有機(jī)溶劑去除污染物。溶劑與溶劑之間得組合有很多。到柱了廠家得網(wǎng)頁上能找到推薦得溶劑系 統(tǒng)。一般來說所有得清洗方法都有類似得形式所用得溶劑都就是隨溶劑強(qiáng)度增加，經(jīng)常最后一個(gè)溶 劑就是非常疏水得（如醋酸乙陸甚至就是婭），可以用來溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)與油類我們必須 保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。淸洗過程要結(jié)束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度 能S

7、混得溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)例如，異丙醇就是個(gè)非常好得作為中間步驟得溶劑，因?yàn)?它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑S溶但就是異丙醇粘度非常人.必須確保較低得 流速以免使泵壓過高。當(dāng)然,如果使用紫外檢測器得話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使 用大量得溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。b對(duì)于典型得硅膠鍵合柱來說如果沒冇緩沖溶液得話推薦使 用以下溶劑系列:10 0%甲醇100%乙晴75b%乙晴25%異丙醇 10 0異丙醇ibO 0%一氯甲烷iOOb%正己烷e用一氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑和容性柱/必須用界丙醇沖洗后才能用原來得水相溶劑-每種溶劑至少?zèng)_洗W個(gè)柱體積.如2 50mmx 4. 6mmHP

8、LC分析柱，分析者可以用12ml/min得流速來沖洗，耍回箜原來得溶劑體系，不需耍每步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒有緩沖得流動(dòng)相, 最后回復(fù)起始流動(dòng)相配置。四氫咲喃就是另外一種比較受歡迎得去除污染得溶劑。如果使用者懷 疑柱了彼嚴(yán)重污染，可以二甲基亞視（DMSO）或者二甲基甲酰錢與水按5 0:50得比例混合用低于0、5ml /min得流速流過色譜柱。成功再生反相柱了就是個(gè)非常耗時(shí)間得過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作ab還有一個(gè)問題就是清洗過程中就是否可以把HPLC柱了反過來。W為大多數(shù)強(qiáng)保留得污染物都會(huì)累積在柱頭，把柱了反過來可以縮短污染物被沖出柱子得移動(dòng)距離

9、?？紤]到裝填柱了得穩(wěn)定性，現(xiàn)在人多數(shù)HPLC柱子都就是比普通操作壓力大很多紂高壓裝填 得，W此她們得柱床應(yīng)該不會(huì)受到反方向流速得影響。但就是，如果頭上得燒結(jié)比尾部得燒結(jié)孔 徑大得話。例如尾部燒結(jié)得孔徑就是2|jm她通常能夠留住平均5|jm孔徑里得填料。有時(shí)侯廠 家會(huì)讓頭部孔徑較人以避免樣品或流動(dòng)相顆粒堵塞如果這種孔徑人于裝填顆粒尺寸分布曲線得 最小粒徑時(shí)，有些填料能穿過這些縫隙而流出色譜柱，這樣會(huì)導(dǎo)致空白出現(xiàn)。如果柱子有箭頭標(biāo)志 建議得流動(dòng)方向，我建議通過操作手冊(cè)與說明書'廠家主頁或者技術(shù)支持部門等確認(rèn)就是否可以 把柱子反過來沖。無論您就是否把柱了反方向，最好不耍讓溶劑通過檢測器避免污

10、染物與穿透縫 隙得顆粒進(jìn)入檢測池，否則有可能引起污染。血清洗柱了頻率主要驗(yàn)有多少強(qiáng)保留物質(zhì)彼打入色譜 柱。W為反相柱有時(shí)候在分辨率消失或者鬼峰出現(xiàn)前能歡受很人得污染，使用者經(jīng)常會(huì)等到出現(xiàn) 了異常情況才開始注意。然而，污染物過多得累積會(huì)導(dǎo)致清洗柱子得難度加犬。所以，如果您知 道經(jīng)常用雜質(zhì)較多得樣品上樣時(shí)，我建議您們有規(guī)律地清洗柱了，您越就是頻繁清洗柱了.就清洗起來就越不費(fèi)勁。3清洗硅膠鍵合反相柱得蛋白質(zhì)殘余b如果就是生物物質(zhì)如血漿或血清等積累在反相色譜柱上，操作者必須采用不同得淸洗程存人部分情況下，純有機(jī)溶劑如乙晴或甲醇不溶解多肽 與蛋白質(zhì)因此不能有效地清洗柱了。然而,有機(jī)溶劑與緩沖液.酸.離了

11、對(duì)試劑等得混合物則能 有效地溶解。開始，先開始嘗試用百分比含量高得高強(qiáng)度溶劑（溶劑B）沖洗i體積。Frei $ er與她得合作者發(fā)現(xiàn)重復(fù)變化三氟乙酸水溶液與三氟乙酸一丙醇之間梯度得高低可以再生彼污染得反相柱了。Bha dwaj與Day認(rèn)為在250 mmx4 6 mm得柱了中注入lOOpL得三氟乙醇就能起到效果。如果上述幾個(gè)方法都不成功，Cuni co與她得同事推薦了幾種強(qiáng)溶劑與增溶劑來除去黃白質(zhì)（見衣三）。在使用這些溶劑之前，可以先咨詢柱子得廠商確保這些溶劑能與柱子得填 料相容硅膠基質(zhì)得柱了通常來說都就是相容得，但有機(jī)聚合物基質(zhì)得柱了可能會(huì)在某些溶劑組 合中膨脹或收縮'這樣會(huì)影響其色譜

12、行為。當(dāng)用前述得溶劑系列時(shí)，確保衣三所捉到得溶劑能與系列中得溶劑互混對(duì)每個(gè)溶劑系統(tǒng)至少要 沖洗20體積。由于有些溶劑系統(tǒng)黏性很人，沖洗得流速應(yīng)該相應(yīng)調(diào)整以確保不會(huì)超過泵壓用完 脈或尿等溶劑侯，至少應(yīng)該用40-50體積得HPLC級(jí)水來沖洗柱了。對(duì)于反相柱子，不建議用衣面活性劑如十二烷基磺酸鈉（SDS）與三硝基甲苯，伙I為這些化合物必然 會(huì)牢固吸附在硅膠鍵合相柱了上很難除去。用衣而活性劑會(huì)影響裝填衣而而改變其性質(zhì)然而有 一個(gè)分離小組得研究衣明由某個(gè)小組做得污染后得柱了可以用5 0 0 pLi% S DS溶液用Iml/min得流速清除下多肽合成產(chǎn)物。如果繼續(xù)用從5%9 5%含1%（V/V）三氟乙酸御

13、乙晴梯度洗脫.可以恢復(fù)多肽得分離4b清洗反相柱得待殊技巧 有時(shí)候，用有機(jī)溶劑清洗污染柱了并不能成功。如果金屬離了吸附在硅膠或鍵合相上這種情況更 有可能發(fā)生。用鰲合劑如0、05M乙二胺四乙酸（ED1A）通過色譜柱時(shí)，含有很多金屬離了得ED7A 復(fù)合物能溶解她們。用完EDTA溶液后.分析者一定耍用水完全沖洗柱了。如果樣品含有離子 化合物，變化P H可以使她們轉(zhuǎn)為非離了狀態(tài)，這樣她們就可以被水有機(jī)溶劑混合物洗脫下來.例如，強(qiáng)堿性物質(zhì)能在pH低于3時(shí)被除去，在這個(gè)條件下質(zhì)了錢變得水溶性更好酸性物質(zhì)能在pH調(diào)整到人于其pKa時(shí)被洗下來一人約時(shí)pH8或9.這個(gè)狀態(tài)酸性物質(zhì)處于離了狀態(tài)。然而,要注意硅膠柱了

14、在長時(shí)間處于高P H條件下容易彼破壞。要避免緩沖液或用緩沖液保存得柱了長菌，可以用普通家用漂口劑1:10或1： 20來沖洗。在這之間至少要打5 0體積色譜純得水。不能讓漂白水通過檢測器，因?yàn)槠谒畷?huì)腐蝕檢測池。避免溶劑瓶中緩沖液長菌，每次只取足夠得緩沖液用.把沒用得保存在冰箱里，添加0、1%疊氮化鈉 在緩沖液中，用緩沖液保存得柱子不能長期不用。色譜工作考經(jīng)常會(huì)討論到離了對(duì)色譜中離了對(duì)試劑對(duì)固定相得影響。顯然離了對(duì)試劑如辛烷一礎(chǔ) 酸（用于陽離了）與四烷基鉞澳（用于陰離了）在一定濃度得有機(jī)修飾劑下能很強(qiáng)地吸附在硅膠鍵 介柱了上。柱了因此彼污染很難回復(fù)到起始狀態(tài)，因此人們都認(rèn)為任何用于離了對(duì)得柱了都

15、會(huì)被 破壞而且用于不能再用于普通得反相色譜q Bid ling me yer不同意這種觀點(diǎn)，她認(rèn)為用于離了對(duì)色譜苛刻得pH值會(huì)通過水解鍵合相與在酸性條件下（pH 1-3 ）硬化硅膠或在高pH條件h（ P H7-8）溶解硅膠使一些柱了得性質(zhì)改變。耍清除離了對(duì)試劑中御確酸，她建議首先用相同得沒有離了對(duì)得緩沖液（至少20體積）沖洗然后用沒有緩沖液得流動(dòng)相（在清洗過程中甲醇 可能比乙晴更有效;如果就是長鏈得離了對(duì)試劑，用四氫咲喃）。很明顯，確酸離了對(duì)試劑與鞍離 子對(duì)試劑有著不同得衣現(xiàn).B i dlingmeyer與她得合作者證明了在C18柱了上用流動(dòng)相濃度大于70%得甲醇，長鏈離了對(duì)試劑,SDS不會(huì)吸附在固定相上這個(gè)發(fā)現(xiàn)跟分離組得結(jié)果-致。硅膠鍵合整體柱如Ch romo lith柱了（默克公司,德國）可認(rèn)為跟別得硅膠柱樣.血結(jié)論:反相柱了會(huì)W為重復(fù)注入含有強(qiáng)保留物質(zhì)特別就是分了量人得或疏水得樣品而被污染，生