鉀離子通道在不同胎齡大鼠動脈導(dǎo)管收縮的作用 論文

1、鉀離子通道在不同胎齡大鼠動脈導(dǎo)管收縮的作用鉀離子通道在不同胎齡大鼠動脈導(dǎo)管收縮的作用 論論文文關(guān)鍵字：收縮 電流 濃度 細(xì)胞 明顯 通道 動脈導(dǎo)管 平滑肌 格列本脲【摘要】【摘要】目的目的研究大鼠動脈導(dǎo)管平滑肌中的三磷酸腺苷（ATP）敏感的鉀離子通道（KATP）及電壓依賴的鉀通道（Kv）的發(fā)育變化及其在動脈導(dǎo)管收縮中的作用。方法方法通過測量胎齡 19 天（早產(chǎn)）及 21 天（足月）（n=8）胎鼠動脈導(dǎo)管血管環(huán)張力及利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)方法測量動脈導(dǎo)管單個(gè)平滑肌細(xì)胞的鉀離子電流，觀察 KATP 激動劑吡拉地爾和 KATP 阻斷劑格列本脲，Kv 阻斷劑 4-氨基吡啶對動脈導(dǎo)管收縮和鉀離子電流的影響

2、。結(jié)結(jié)果果格列本脲可收縮胎齡 21 天胎鼠的動脈導(dǎo)管，但對 19 天的無作用。鉀電流可以因吡拉地爾增加，因格列本脲減少，但這種減少的電流在胎齡 21 天的動脈導(dǎo)管要明顯大于 19 天的。4-氨基吡啶在兩組作用無明顯差異。結(jié)論結(jié)論本研究數(shù)據(jù)提示在早產(chǎn)兒與足月兒比較，總的 Kv 電流無明顯差異，但 KATP 電流明顯減少，KATP 通道未發(fā)育成熟，支持 KATP 在動脈導(dǎo)管平滑肌作為一個(gè)氧感受器，是早產(chǎn)兒動脈導(dǎo)管未閉發(fā)生率高的原因之一?！娟P(guān)鍵詞】【關(guān)鍵詞】動脈導(dǎo)管；氧氣；鉀離子通道；早產(chǎn)兒TheThe rolerole ofof potassiumpotassium channelschannel

3、s inin oxygen-inducedoxygen-induced contractioncontractionofof ductusductus arteriosusarteriosus inin fetalfetal ratrat ofof differentdifferent gestationgestation ageage【AbstractAbstract】ObjectiveObjectiveTo investigated the role of ATPsensitive potassium channel and voltage-dependent potassium chan

4、nelin oxygen-induced contraction of ductus arterioses of rat.MethodsMethodsIsometric force of contact tissue and potassium current insingle smooth muscle cells of ductus arteriosus were measured in twogroups of rats of 19th (premature) and 21st (mature) gestation agerespectively. The effects of pina

5、cidil(KATP activater)，glybenclamide (KATP inhibitor)， and4-aminopyridine(KV inhibitor)were investigated.ResultsResultsglybenclamide contracted ductus arteriesin 21st group but not in 19th group. Potassium current increased byapplying pinacidil in the perfusion solution and decreased byglybenclamide.

6、The change of the currents， together with thedepolarization of the membrane potential were significant greater in21st group then in 19th group. No significant different effect of 4-aminopyridine was observed between two groups.ConclusionConclusionKATP butnot KV channel may be one of the O2 sensors i

7、n ductus arterioses. Itwas underdeveloped in premature fetus. and participate in their poorreaction to oxygen and high incidence of patent ductus arteriosus.【KeyKey wordswords】ductus arteriosus； oxygen； potassiumchannel； premature fetus新生兒的動脈導(dǎo)管通常在生后數(shù)小時(shí)到數(shù)日關(guān)閉。出生后隨著呼吸的開始，血氧分壓升高是動脈導(dǎo)管收縮的重要原因。早產(chǎn)兒動脈導(dǎo)管對氧濃度變

8、化的反應(yīng)欠佳，與早產(chǎn)兒動脈導(dǎo)管對氧的敏感性尚未成熟有關(guān)。提高灌流液氧分壓可引起離體動脈導(dǎo)管收縮。這種氧氣引發(fā)的動脈導(dǎo)管收縮的機(jī)制尚不明確。氧氣誘導(dǎo)血管內(nèi)皮釋放內(nèi)皮素是使動脈導(dǎo)管收縮的原因之一1。Roulet 和Coburn2發(fā)現(xiàn)血氧分壓升高可引起細(xì)胞膜去極化。研究發(fā)現(xiàn) ATP 依賴的鉀通道（ATP-dependent K channel，KATP，）阻斷劑格列本脲，可收縮動脈導(dǎo)管；而 KATP 開放劑克羅卡林，可以拮抗氧氣引發(fā)的動脈導(dǎo)管收縮3。因此，筆者推測富氧可以關(guān)閉 KATP，從而使平滑肌細(xì)胞膜去極化。但是 Tristani-Firouzi 等4發(fā)現(xiàn)在動脈導(dǎo)管也存在著電壓依賴的鉀通道（vo

9、ltage-dependent K channel，Kv），并在富氧的條件下關(guān)閉，因此他們認(rèn)為動脈導(dǎo)管上的氧感受器是 Kv。KATP 和 Kv 在動脈導(dǎo)管收縮中的作用仍然沒有定論。在我們以前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氧氣引發(fā)的動脈導(dǎo)管收縮現(xiàn)象只在胎齡 21 天的胎鼠動脈導(dǎo)管出現(xiàn)，而在 19 天的不能引出5。在動脈導(dǎo)管中作為氧感受器的通道，在早產(chǎn)兒應(yīng)該尚未發(fā)育成熟。因此，本研究的目的是了解胎鼠動脈導(dǎo)管平滑肌中 KATP 和 Kv 發(fā)育情況及它們在動脈導(dǎo)管收縮中的作用，以探明動脈導(dǎo)管的收縮機(jī)制。1 1對象與方法對象與方法1.11.1對象未生育過的 Wister 鼠，過夜交配后若在陰道拭子發(fā)現(xiàn)有精子則初步判斷受

10、孕并定為胎齡第 0 天（足月 21.5 天）。胎齡 19 或 21 天時(shí)用苯巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉母鼠后剖腹取胎鼠。整個(gè)過程遵循美國生理協(xié)會的相應(yīng)規(guī)則。所有試劑及藥品均來自美國 Sigma 公司。1.1.11.1.1測量張力使用完整動脈導(dǎo)管環(huán)分離出胎鼠的縱隔組織并置于 HEPES 緩沖液中。HEPES 液成分(mM)：NaCl， 142； KCl， 5； CaCl2，1.5； glucose，6； MgCl2， 1； HEPES， 5； 用 NaOH 滴定到 pH 7.4，再用100%氮?dú)?N2)平衡。在解剖顯微鏡下從胸腔取出動脈導(dǎo)管，制備成 0.40.6mm長的血管環(huán)段，然后放于

11、 37的浴槽。1.1.21.1.2電生理實(shí)驗(yàn)使用新鮮分離的單個(gè)平滑肌細(xì)胞所有用于制備和保存單個(gè)動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞的液體均以 100%N2 平衡。動脈導(dǎo)管和肺動脈從胸腔取出后放置于去鈣的 Hanks 溶液。Hanks 液成分(mM)：NaCl 138.8， KCl5.4， NaH2PO4 1.2， MgCl2 0.5， HEPES 10， EGTA 0.1， 用 1M NaOH 滴定到 pH 7.4。然后把血管剪成小片、置于沒有 EGTA 的 Hanks消化液，其中含有木瓜蛋白酶 0.4mg/ml， 二硫蘇糖醇 0.19mg/ml， 以及牛血清白蛋白0.2mg/ml；在 37水箱中消化 58mi

12、n，再置于沒有 EGTA、含有膠原酶0.25mg/ml 的 Hanks液，37消化 57min。再把膠凍樣的組織用毛細(xì)吸管移至加有 10 mg/ml 葡萄糖的普通 Hanks液并保存在冰中，實(shí)驗(yàn)開始前輕輕攪動即可獲得單個(gè)細(xì)胞。1.21.2方法1.2.11.2.1血管張力測量按照常用的等容收縮方法測量血管張力。用兩根直徑 25m 的鎢絲穿過血管腔，通過壓力傳感器(Leonia 公司 Kulite 半導(dǎo)體)接到肌動描記器，并記錄等容收縮的張力。實(shí)驗(yàn)開始后，用 Krebs-Henseleit（K-H）液以 10 ml/min 的速度灌洗。K-H 液成分（mM）： NaCl，118； KCl， 5；

13、CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； NaHCO3， 24；NaH2PO4， 0.436，用 95%N25%CO2 氣體平衡，使浴槽中灌洗液 pH 值為7.387.42；氧分壓 2225mmHg；二氧化碳分壓 3542mmHg。在使用高鉀溶液(鉀濃度 50 mM)時(shí)，用等摩爾的 KCl 替代 NaCl。記錄血管軸長，兩條鎢絲之間的距離及牽拉開始時(shí)的牽引力。以牽引力(mN)除以血管軸長（mm）表示血管壁張力（mN/mm）。對 19 和 21 天胎齡的標(biāo)本，調(diào)節(jié)其基礎(chǔ)張力分別到 0.30.5mN/mm (平均 0.40.1)和 0.60.8mN/mm(平均 0.70.1

14、)。采用 3 種方法使動脈導(dǎo)管環(huán)收縮：4M 格列本脲（KATP 通道阻斷劑）；10mM 4-氨基吡啶（4-AP）（Kv 阻斷劑）；以及 50mM KCl。格列本脲和4-AP 均溶解在 K-H 液中。1.2.21.2.2膜片鉗實(shí)驗(yàn)低氧液以 6ml/min 的速度灌洗，組織池中的氧分壓由血?dú)鈾C(jī)（Ciba Corning 280）測定，間隔 5min 采樣，連續(xù) 3 次保持在3035mmHg 時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞放置于操作池中，選擇紡錘狀、表面光滑、折光性好的平滑肌細(xì)胞。電極內(nèi)液成分(mM)：KCl 20， KOH 120， MgCl2 2， EGTA10， HEPES 5， Mg-ATP 1 或 5，

15、 aspartate 60 (pH 7.4)。灌流液成分(mM)：NaCl 143， KCl 5.4， NaH2PO4 0.33， MgCl2 0.5， HEPES 5， NaOH 調(diào)節(jié) pH到 7.4。灌流液用 100%氮?dú)馄胶?。利用二甲亞砜溶?KATP 激動劑吡拉地爾和KATP 通道阻斷劑格列本脲，并使后二者在灌流液中的濃度分別為 110M 和4M。灌流液中二甲亞砜的濃度不超過 0.2%。電極后尖端阻抗為 56M。調(diào)整微推進(jìn)器，完成 G封閉后，副壓吸引形成全細(xì)胞結(jié)構(gòu)。利用 Axopatch 200B 放大器，由 pClamp8.2 發(fā)放刺激脈沖，采樣頻率為 10kHz，低通濾波頻率為 2

16、kHz，記錄靜息膜電位及電流。刺激方案為：保持電位在-70 mV 使鉀電流失活，從-80mV 到+60 mV 范圍，階躍10mV， 刺激頻率 0.1 Hz。電流密度表示為電流與細(xì)胞膜容積之比，單位pA/pF。被吡拉地爾激活并被格列本脲抑制的電流即是 KATP 電流。1.31.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在 Stateview 及 Clamfit 分析軟件下處理結(jié)果。取電流時(shí)程的最后 400ms 數(shù)據(jù)進(jìn)行測量。結(jié)果用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。未配對的兩組均值比較采用 t 檢驗(yàn)。對藥物反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用配對 t-檢驗(yàn)和分析變量的重復(fù)測定。P0.05）；在兩組均可觀察到 4-AP 引起的血管收縮（P0.05）；只在 21

17、 天組可見由格列本脲引起的動脈導(dǎo)管收縮(P100M)吡拉地爾也會激活 KCa通道8，故在用吡拉地爾之前常規(guī)加入 1 mMTEAC 以減少誤差。在 21 天組，由 10 M 吡拉地爾激活的鉀電流比 19 天組明顯增多。在兩組中均發(fā)現(xiàn) 10 M 吡拉地爾激活的鉀電流最大，濃度繼續(xù)升高并沒有同期增多的電流。被格列本脲阻斷的鉀電流大小與被 10 M 吡拉地爾激活的鉀電流大小相等。這種電流在 21 天組明顯大于 19 天組。當(dāng)使用 1 M ATP 作為電極液時(shí)，4 M 格列本脲可明顯抑制鉀電流， 提示在這種條件下 KATP 是開放的。而且這種電流在 21 天組明顯大于 19天組（P0.05）。吡拉地爾可

18、激活鉀通道，而且這些被激活的電流可以被格列本脲阻斷，阻斷的電流比激活的稍大，也表明在基礎(chǔ)條件下，有部分 KATP 是開放的。這種被阻斷的鉀離子電流在足月組也明顯高于早產(chǎn)組。兩組的膜電位沒有差別(足月組-40.73.3 mV，早產(chǎn)組-41.54.0mV)。格列本脲可明顯改變單個(gè)細(xì)胞膜電位，并且在兩組間有明顯差異(足月組33.33.3 mV，早產(chǎn)組 8.22.8 mV，P0.01)。3 3討論討論細(xì)胞內(nèi) ATP 濃度低時(shí) KATP 通道開放9，這時(shí)給予格列本脲可以使之關(guān)閉。如果有較多的 KATP 通道被關(guān)閉，可以導(dǎo)致細(xì)胞膜的去極化，從而開放電壓依賴的鈣通道，增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，使血管平滑肌收縮。有報(bào)

19、道格列本脲可以收縮足月新生兔的動脈導(dǎo)管3。本實(shí)驗(yàn)中，格列本脲也可使足月大鼠的動脈導(dǎo)管發(fā)生明顯收縮。這些數(shù)據(jù)提示在低氧環(huán)境，成熟胎鼠動脈導(dǎo)管 KATP是開放并且有功能的。但在未成熟胎鼠卻看不到這種格列本脲引起的動脈導(dǎo)管收縮現(xiàn)象，提示在未成熟胎兒動脈導(dǎo)管的 KATP 是無功能或者是未發(fā)育完善的。在我們以前的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了氧氣可以使胎齡 21 天的大鼠動脈導(dǎo)管收縮但對19 天的無效；而且未成熟胎兒的血管收縮系統(tǒng)，包括平滑肌細(xì)胞膜的去極化、細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加以及細(xì)胞內(nèi)鈣活化收縮蛋白等與成熟胎兒比較沒有明顯差別，但對血氧變化的感應(yīng)機(jī)制不成熟5。這些結(jié)果支持 KATP 是動脈導(dǎo)管的氧感受器之一。因?yàn)?4-A

20、P 引起的收縮在兩組無明顯差別，提示在早產(chǎn)鼠動脈導(dǎo)管的總的 Kv 通道與成熟鼠沒有區(qū)別。當(dāng)然，因?yàn)?Kv 通道有很多亞類， 在未成熟胎兒的動脈導(dǎo)管也可能存在某些 KV 亞類發(fā)育不完善，尚不能完全排除 KV 也是動脈導(dǎo)管的氧感受器之一。KATP 通道的活性與細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）， 二磷酸腺苷(ADP)和其他二磷酸核苷的濃度及比例有關(guān)10。在缺氧時(shí)血管平滑肌組織 ATP 濃度是否降低仍無定論。以前的實(shí)驗(yàn)顯示，在動脈導(dǎo)管組織，當(dāng)灌流液從低氧改到富氧狀態(tài)后，由 340nm 激發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度雖然降低得不多但具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3。提示熒光底物（如吡啶核苷酸）濃度在低氧環(huán)境中因?yàn)闊o氧代謝而有所增加。Sh

21、igemori11提出低氧環(huán)境可以明顯降低門靜脈和肺動脈中的 ATP 濃度；但 Leach 等6在報(bào)告中指出， 在靜息狀態(tài)且沒有受到牽拉的動脈，低氧并不會明顯降低其組織 ATP 濃度。在生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的 ATP濃度為 1.5 4mM6，7。在本研究中，筆者選擇了兩種 ATP 濃度作為吸液管內(nèi)液：1mM 和 5mM。在吸液管內(nèi)液 ATP 濃度為 1mM 時(shí)，格列本脲可以明顯阻斷鉀電流，而在 5mM 組則未見此現(xiàn)象。這表明 KATP 通道在 1 mM ATP 這表明KATP 通道在 1 mM ATP 環(huán)境中是開放的，而在 5 mM ATP 環(huán)境中是被抑制的。有報(bào)道當(dāng) ATP 濃度在

22、10200M 時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞的 KATP 電流可以有一半被阻斷10。本研究也發(fā)現(xiàn)在動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞，較高濃度 ATP 可以阻斷其 KATP 電流。在缺氧狀態(tài)時(shí)的 ATP 濃度改變，可以改變 KATP 通道的活性，從而使動脈導(dǎo)管擴(kuò)張。但是不同部位血管組織的 KATP 通道對 ATP 的敏感性可能是不同的10。本研究中，被吡拉地爾激活、格列本脲阻斷的鉀離子電流在足月組明顯大于早產(chǎn)組。表明在早產(chǎn)組動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞膜上的 KATP 通道尚未發(fā)育成熟。有人可能會認(rèn)為在早產(chǎn)組 KATP 通道也是存在的，只是被 1 mM 的 ATP 所抑制了；但實(shí)際上吡拉地爾在 3 mM ATP 的條件下仍然可以激

23、活 KATP 電流10，12，13。胎鼠動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞膜電位與文獻(xiàn)報(bào)道值近似2。與張力實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，由格列本脲引起的膜電位的降低在足月組明顯大于早產(chǎn)組。有報(bào)道在完整動脈導(dǎo)管，去極化到 15 mV 可以引起最大收縮的 25%的收縮，去極化到21 mV 則引起完全收縮。雖然格列本脲對單個(gè)細(xì)胞膜電位的影響與整體組織的可能有差異，我們的研究也提示了格列本脲引起的去極化在早產(chǎn)組沒有足月組明顯。總之，本研究結(jié)果表明：在未成熟胎兒的動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞膜上的ATP 依賴的鉀離子通道是未發(fā)育完善的。本研究結(jié)果支持 ATP 依賴的鉀離子通道是動脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞膜上的血氧感受器之一的假設(shè)。也支持在早產(chǎn)兒 KAT

24、P的發(fā)育不成熟是在其動脈導(dǎo)管觀察不到氧誘發(fā)的收縮現(xiàn)象的原因之一的假設(shè)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】【參考文獻(xiàn)】1Jing S， Nakanishi T， Gu H， et al. The Role ofEndothelin in Oxygen-induced Contractionof the Ductus Arteriosusin the Rabbit and Rat Fetuses. Heart Vessles，2002， 16：181-188.2Roulet MJ， Coburn RF. Oxygen-induced contraction in theguinea pig neonatal ductu

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